人類IDH1基因突變檢測試劑盒（熒光PCR法）（CSZ2100196）

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13一、申請人名稱廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司廈門市海滄區(qū)鼎山路39號廈門市海滄區(qū)鼎山路39號一、產(chǎn)品概述（一）產(chǎn)品主要組成成分本試劑盒含有IDHPCR反應(yīng)條、IDH混合酶、IDH陽性對照，詳見表1、表2。表1試劑盒組成表2IDHPCR反應(yīng)條的組成1238/備注：不同批次試劑不可混用。（二）產(chǎn)品預(yù)期用途本試劑盒用于體外定性檢測急性髓系白血?。ˋML）患者骨髓樣本DNA中人類異檸檬酸脫氫酶1（IDH1）突變基因，檢測的突變位點為：394C>A、395G>A、394C>T、395G>T和394C>G，用于艾伏尼布片（Tibsovo片）的伴隨診斷。檢測結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為患者個體化治療的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情、藥物適應(yīng)癥、治療反應(yīng)及其他實驗室檢測指標(biāo)等因素對檢測結(jié)果進行綜合判斷。（三）產(chǎn)品包裝規(guī)格（四）產(chǎn)品檢驗原理本試劑盒基于擴增阻礙突變系統(tǒng)和熒光PCR技術(shù)實現(xiàn)骨髓樣本DNA中IDH1基因突變的檢測。本試劑盒針對IDH1基因突變位點設(shè)計特異的突變檢測引物，PCR擴增時，由于該引物3'末端的堿基與突變型模板完全配對，引物延伸并擴增出突變模板；而與野生型模板由于不能完全配對，引物的延伸被阻斷，野生型模板擴增被抑制，從而實現(xiàn)IDH1基因突變的檢測。本試劑盒基于熒光PCR技術(shù)，通過FAM標(biāo)記的熒光探針，在1~3號管實現(xiàn)IDH1基因突變的實時檢測，在8號外控管實現(xiàn)IDH2基因外顯子3區(qū)段的檢測，用于監(jiān)控樣本質(zhì)量；另外，反應(yīng)體系中還包含檢測人類IDH1基因保守區(qū)域（IDH1基因外顯子6區(qū)段）的引物和HEX標(biāo)記的熒光探針，作為內(nèi)控試劑用于結(jié)果判讀及監(jiān)控樣本的質(zhì)量。本試劑盒PCR擴增反應(yīng)系統(tǒng)同時含有UNG酶，可以選擇性斷裂含有dU的PCR片段中的尿嘧啶糖苷鍵，有效降低因PCR產(chǎn)物污染產(chǎn)生的假二、臨床前研究概述（一）主要原材料1.主要原材料的選擇本產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、DNA聚合酶、UNG酶和dNTP，這些原材料均為外購方式獲得。自行設(shè)計的引物和探針委托專業(yè)的合成公司合成，并經(jīng)HPLC純化獲得；DNA聚合酶、UNG酶和dNTPs等均由有資質(zhì)的原料供應(yīng)商提供。通過功能性試驗，申請人篩選出最佳原材料和供應(yīng)商，同時制定了各主要原材料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)檢驗合格。2.企業(yè)參考品和對照品的設(shè)置情況申請人設(shè)計了完整的企業(yè)參考品，包括陽性參考品、陰性參考品、最低檢測限參考品和精密度參考品，參考品均采用臨床樣本制備而成。陽性參考品共13支，包括不同突變比例下試劑盒可檢出的所有突變類型。陰性參考品共9支，7支為野生型人基因組DNA，另外含1例非人基因組樣本和1例試劑盒檢測范圍外的IDH1基因突變陽性細(xì)胞系樣本。檢測限參考品共5支，包括試劑盒可檢出的所有突變類型。精密度參考品共5支，包括陰性精密度參考品、不同突變比例所有突變類型的陽性精密度參考品。產(chǎn)品設(shè)置了陽性對照（PC）和陰性對照（NTC，自備純化水），用于檢測過程中試劑盒和儀器的質(zhì)量控制。（二）生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究申請人對該產(chǎn)品反應(yīng)體系的研究包括適用樣本類型的研究、各組分和酶液等使用量的研究、靶基因和內(nèi)外控引物及探針濃度的研究、PCR擴增反應(yīng)條件的研究和循環(huán)數(shù)研究等。通過功能性實驗，確定了最佳的反應(yīng)體系。申請人根據(jù)試劑盒中試劑和組件的主要生產(chǎn)工藝的研究結(jié)果，確定了最佳的生產(chǎn)工藝。（三）分析性能評估本產(chǎn)品分析性能評估內(nèi)容包括準(zhǔn)確度、精密度、最低檢測限、分析特異性、核酸提取性能等研究。申請人提交了三批產(chǎn)品在適用機型上的性能評估資料。準(zhǔn)確度研究中，使用3批成品試劑盒在適用機型上對陽性參考品和陰性參考品進行檢測，檢測結(jié)果顯示陽性參考品符合率、陰性參考品符合率均為100%。精密度研究中使用3批成品試劑盒在適用機型上對陰性臨床樣本、弱陽性和中陽性臨床樣本進行檢測，評價本產(chǎn)品批內(nèi)、批間及檢測日內(nèi)、日間、操作者間精密度，結(jié)果顯示檢測結(jié)果符合率均為100%，檢測變異系數(shù)均不大于5%。最低檢測限研究中，申請人使用不同核酸濃度和不同突變比例的樣本進行檢測，采用95%（n=20）的陽性檢出率作為標(biāo)準(zhǔn)，初步確定產(chǎn)品最低檢測限。然后使用3批成品試劑盒在適用機型上對檢測限參考品進行驗證，本試劑盒在10ng基因組DNA背景下，能夠檢出1%的基因突變。分析特異性研究包含交叉反應(yīng)研究和干擾研究，交叉反應(yīng)研究包括序列相近、具有一定同源性的其他常見突變類型及AML其他常見基因突變類型（包括試劑盒涵蓋范圍外的IDH1基因1種突變類型，IDH2基因11種突變類型，F(xiàn)LT3、NRAS、NPM1和JAK2基因各1種突變類型）、野生型基因序列和非人類基因組基因。申請人使用3批試劑盒對交叉反應(yīng)樣本進行檢測，結(jié)果顯示均無交叉反應(yīng)。干擾試檸檬酸鈉（0.645mol/L）、EDTA（27μmol/L、內(nèi)源性干擾物質(zhì)（血紅蛋白（3g/L）、甘油三酯（37mmol/L）、白蛋白（60g/L）、膽紅素（342μmol/L））和藥物阿糖胞苷（60μg/mL）對檢測結(jié)果無影響，肝素鈉（終濃度150U/mL）對檢測結(jié)果有一定抑制作用。申請人采用臨床樣本進行了核酸提取試劑盒性能的研究，根據(jù)與該產(chǎn)品的組合性能研究結(jié)果，確定推薦的核酸提取試劑符合檢測需求。（四）陽性判斷值研究陽性判斷值的建立研究選取了210例AML骨髓樣本，分別統(tǒng)計FAM通道Ct值和ΔCt值，通過受試者工作特征（ROC）曲線確定本產(chǎn)品的陽性判斷值，再用另外一批51例臨床樣本上對陽性判斷值進行驗證。另外對1121例臨床試驗樣本的檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析，進一步對陽性判斷值進行驗證。最終確定陽性判斷值見表4。表4結(jié)果判定123ΔCtCut-off值899當(dāng)樣品突變Ct值大于或等于陰性臨界Ct值時（即落于陰性區(qū)則該樣品為陰性或低于本試劑盒的檢測下限。當(dāng)樣品突變Ct值小于陰性臨界值時，進行如下判斷：當(dāng)某個反應(yīng)管的突變Ct值小于陽性臨界值時（即落于陽性A區(qū)），則該樣品為該反應(yīng)管對應(yīng)的突變陽性，即陽性A區(qū)；當(dāng)反應(yīng)管的突變Ct值大于陽性臨界值時，且小于陰性臨界Ct值時（即落于陽性B區(qū)則計算該反應(yīng)管的ΔCt值（突變Ct值-外控Ct值），若反應(yīng)管的ΔCt值小于相對應(yīng)的ΔCtCut-off值，則該樣品也為該反應(yīng)管對應(yīng)的突變陽性，即陽性B區(qū)；反之則為陰性或低于本試劑盒的檢測下限。（五）穩(wěn)定性研究申請人對本產(chǎn)品實時穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性、開瓶凍融穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性進行了系統(tǒng)的研究，確定了在各種條件下本產(chǎn)品及樣本的有效保存時間。實時穩(wěn)定性研究：將3批試劑盒儲存于規(guī)定儲存條件下，分別在0、6、8和10個月對物理性能、準(zhǔn)確度、特異性、檢測限和精密度進行考察，各項性能指標(biāo)均符合要求，確定產(chǎn)品在20±5℃條件下，可此外，申請人對產(chǎn)品的開瓶凍融穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性分別進行了研究。結(jié)果顯示，產(chǎn)品性能均能滿足產(chǎn)品說明書聲稱。三、臨床評價概述申請人提交了試驗體外診斷試劑的臨床檢測性能和伴隨診斷意義的臨床試驗資料，分為如下兩部分。（一）臨床檢測性能本產(chǎn)品在福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院和蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院3家臨床試驗機構(gòu)進行臨床試驗，采用試驗體外診斷試劑與sanger測序進行比較研究，確認(rèn)本產(chǎn)品的臨床檢測性能。入組病例為急性髓性白血病（AML）患者，樣本類型為骨髓樣本，共納入1121個病例，其中陽性樣本140例，陰性樣本981例。試驗結(jié)果顯示：試驗體外診斷試劑與sanger測序的陽性符合率為100%（95%CI：97.2%，100.00%），陰性符合率為99.1%（95%CI：98.3%，99.5%），總符合率為99.2%（95%CI：98.5%，99.6%）。（二）伴隨診斷意義試驗體外診斷試劑的伴隨診斷證據(jù)采用橋接試驗的路徑提交，橋（AG120-C-001和CS3010-101）入組人群的樣本。1.與藥物臨床試驗入組人群篩選試劑CTA檢測結(jié)果的一致性該部分研究的樣本共納入158例樣本，試驗體外診斷試劑與CTA2.試驗體外診斷試劑的橋接藥物療效針對藥物關(guān)鍵性臨床試驗納入的204例IDH1基因突變陽性的骨髓樣本，本次橋接試驗納入118例，試驗體外診斷試劑檢測陽性的110例。針對藥物關(guān)鍵性臨床試驗中的主要評價指標(biāo)，上述110個病例的CR+CRh率為31.8%（95%CI：23.3%～41.4%與藥物關(guān)鍵性臨床試驗結(jié)果基本一致；對于藥物關(guān)鍵性臨床試驗中的其他次要評價指標(biāo)也進行了充分評價，結(jié)果顯示，上述110個病例的次要評價指標(biāo)結(jié)果也與藥物關(guān)鍵性臨床試驗中的結(jié)果基本一致；同時，針對需要進行敏感性分析的情況也進行了充分分析。綜上所述，該產(chǎn)品臨床試驗設(shè)計符合《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求，臨床試驗結(jié)果顯示該產(chǎn)品臨床性能滿足臨床要四、產(chǎn)品受益風(fēng)險判定根據(jù)YY/T0316-2016《醫(yī)療器械－風(fēng)險管理對醫(yī)療器械的應(yīng)用》對產(chǎn)品進行風(fēng)險分析。本產(chǎn)品用于艾伏尼布片的伴隨診斷，為臨床醫(yī)生對急性髓系白血?。ˋML）患者選擇靶向藥物提供依據(jù)。檢測結(jié)果僅供臨床參考，具體臨床應(yīng)用時，臨床醫(yī)生必須結(jié)合病例實際情況進行綜合判斷。本產(chǎn)品臨床應(yīng)用的主要受益在于：作為艾伏尼布片的伴隨診斷試劑對靶向用藥人群進行篩選，便于IDH1突變檢測陽性的AML患者獲得及時的治療。（二）風(fēng)險評估申請人對已知危險（源）進行風(fēng)險評價，按照風(fēng)險可接受準(zhǔn)則判斷每個危險（源）的風(fēng)險是否達(dá)到可接受水平，對合理可行降低的風(fēng)險、不經(jīng)過風(fēng)險/收益分析既判定為不可接受的風(fēng)險采取控制措施，并對具體措施進行實施驗證，同時重新對采取措施后的風(fēng)險進行估計，確認(rèn)其風(fēng)險水平是否可接受。但為保證用械安全，基于對主要剩余風(fēng)險的規(guī)避，需要在說明書中提示以下信息：1.本試劑盒用于體外定性檢測急性髓系白血?。ˋML）患者骨髓樣本DNA中人類異檸檬酸脫氫酶1（IDH1）突變基因，檢測的突變位點為：394C>A、395G>A、394C>T、395G>T和394C>G，用于艾伏尼布片（Tibsovo片）的伴隨診斷。檢測結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為患者個體化治療的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情、藥物適應(yīng)癥、治療反應(yīng)及其他實驗室檢測指標(biāo)等因素對檢測結(jié)果進行綜合判斷。2.警示及注意事項：產(chǎn)品說明中介紹了該產(chǎn)品檢驗方法的局限性及使用中的注意事項。本申報項目為境內(nèi)第三類體外診斷試劑產(chǎn)品注冊。申請人的注冊申報資料符合現(xiàn)行要求，依據(jù)《醫(yī)療器械監(jiān)督管理條例》（國務(wù)院令第739號）、《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》（國家市場監(jiān)督建議準(zhǔn)予注冊。附件：產(chǎn)品說明書通用名稱：人類IDH1基因突變檢測試劑盒（熒光PCR法）檢測結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為患者個體化治療的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情、藥物適應(yīng)癥、治療反應(yīng)及其他實驗室檢測指標(biāo)等因素對檢測結(jié)果進行綜合判斷。主要是將細(xì)胞質(zhì)中的異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸(α-KG參與三羧酸循環(huán)氧化供能，是多種代謝途徑所需的非線粒體還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的主要來源[1]。近IDH1抑制劑藥物治療中獲益[7-8]。因此對IDH1基因突變的檢測可以指導(dǎo)患者治本試劑盒針對IDH1基因突變位點設(shè)計特異的突變檢測引物，PCR擴增另外，反應(yīng)體系中還包含檢測人類IDH1基因保守區(qū)域（IDH1基因外顯子61238/1.廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司的核酸提取試劑（型號：新鮮血液/3.骨髓樣本運輸條件：2~8℃恒溫運輸或者泡沫箱加冰袋密封運輸，運輸時5.DNA提取完畢后，建議立即進行檢測，檢測前請對核酸進行準(zhǔn)確定量，在每次PCR反應(yīng)中，每份樣品必須和陽性對照（PC）、陰性對照（NTC，ABCDEF1NTC2NTC3NTC4//////5//////6//////7//////8NTC9.實驗結(jié)束后，使用2層PE手套包扎好PCR反應(yīng)條，并按生物垃圾處理。2.突變結(jié)果的確定：首先確定樣品各個反應(yīng)管各自的突品的外控反應(yīng)管Ct值。由于樣品中突變百分含量各不相同，所得到b）當(dāng)樣品突變Ct值小于陰性臨界值時，進行下列判斷：i.當(dāng)某個反應(yīng)管的突變Ct值小于陽性臨界值時（即落于陽性A區(qū)），則該個或2個以上反應(yīng)管出現(xiàn)陽性結(jié)果（按照表4判讀）時，先確定突變反應(yīng)管中ii.若△Ct值大于或等于交叉閾值，則認(rèn)為是交叉信號，可判為該突變反應(yīng)8聯(lián)管編號123陽性A區(qū)突變Ct值Ct<24Ct<26Ct<26陽性B區(qū)突變Ct值24≤Ct<2626≤Ct<2826≤Ct<28ΔCtCut-off值899突變Ct值Ct≥26Ct≥28Ct≥28----“*”根據(jù)人工合成質(zhì)粒的實驗數(shù)據(jù)獲得。1.陰性對照(NTC)的1～3號管的FAM信號應(yīng)無明顯擴增曲線。若1～信號及8號管的FAM信號偶爾升起，而1～3號管的FAM信號無擴增曲線，不3.樣本8號反應(yīng)管（外控反應(yīng)管）的FAM信號應(yīng)有明顯擴增曲線，且Ct值應(yīng)在或DNA加入量過少，需要重新提取DNA或增加DNA上樣量再進行試驗；此4.待測樣品1～3號管內(nèi)控VIC信號應(yīng)有明顯的擴增曲線且Ct值小于31。若1～33.不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運及處理、以及不當(dāng)?shù)脑囼灢僮骱蛯嶒灜h(huán)境均有可能進行檢測，檢測結(jié)果顯示陽性參考品符合率、陰性參考品符2.精密度研究中使用3批成品試劑盒在適用機型上對陰性臨床樣本和弱陽性和中陽性臨床樣本進行檢測，評價本試劑盒批內(nèi)、批間及檢測日內(nèi)、日間、操作者間精密度，結(jié)果顯示檢測結(jié)果符合率均為100%，檢測變異系3.最低檢測限研究中，使用不同核酸濃度和不同突變比例的樣本進行檢測，采用95%（n=20）的陽性檢出率作為標(biāo)準(zhǔn)，初步確定產(chǎn)品最低檢測限。然后使具有一定同源性的其他常見突變類型及AML其他常見基因突變類型（包括試劑盒涵蓋范圍外的IDH1基因1種突變類型，IDH2基因11種突變類型，F(xiàn)LT3、擾試驗結(jié)果顯示，臨床樣本中可能存在的外源干擾物質(zhì)（葡萄糖（1.2g/L）、檸檬酸鈉（0.645mol/L）、EDTA（27μmol/L））、內(nèi)源性干擾物質(zhì)（血紅蛋和藥物阿糖胞苷（60μg/mL）對檢測結(jié)果無影響，肝素鈉（終濃度150U/mL）5.采用臨床樣本進行了核酸提取試劑盒性能的研究，根據(jù)與本試劑盒的組合性本產(chǎn)品在3家臨床試驗機構(gòu)進行臨床試驗，采用試驗體外診斷試劑與sanger測序進行比較研究，共納入1121個病例，本產(chǎn)品與sanger測序的陽性符合率為尼布片的關(guān)鍵性藥物臨床試驗入組人群的樣本。針的橋接藥物療效，本產(chǎn)品檢測陽性病例的主2.本試劑盒結(jié)果會受到樣品本身的來源、樣品采集過程、樣本質(zhì)量、樣本運輸條件、樣本預(yù)處理等因素影響，同時也受到DNA提取質(zhì)量、熒光定量PCR儀型號、操作環(huán)境以及當(dāng)前分子生物學(xué)技術(shù)的局限性等限制，可能導(dǎo)致得出假陽性或假陰性的檢測結(jié)果。使用者須了解檢測過程中可能存在的潛在錯誤、4.本試劑盒所有試劑均經(jīng)過特別配制，以用于上述檢測。隨意替換試劑盒中的5.應(yīng)該嚴(yán)格區(qū)分陽性對照和反應(yīng)試劑的使用，防止污染試劑對照的操作。推薦在制備反應(yīng)試劑和添加DNA模板時，使用單獨、專用的移