生物學(xué)案：專題課題土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)

學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精課題2土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)1．研究培養(yǎng)基對微生物的選擇作用。2．進行微生物數(shù)量的測定.一、研究思路1．篩選菌株尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)____肥,但不能直接被農(nóng)作物吸收利用，只有當(dāng)土壤中的細菌將尿素分解成____之后，才能被植物利用。土壤中的細菌之所以能分解尿素，是因為它們能合成______。（1）實驗室中微生物篩選的原理：人為提供有利于目的______生長的條件(包括營養(yǎng)、______、pH等)，同時______或______其他微生物生長.（2）選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中,將允許________的微生物生長，同時______或______其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱做選擇培養(yǎng)基。2．統(tǒng)計菌落數(shù)目(1）常用來統(tǒng)計樣品中______數(shù)目的方法是________.即當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的________.通過統(tǒng)計平板上的________，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。為了保證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)在________的平板進行計數(shù).統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目____.這是因為當(dāng)兩個或多個細胞在一起時,平板上觀察到的只是一個菌落.因此,統(tǒng)計結(jié)果一般用________來表示。（2）____________也是測定微生物數(shù)量的常用方法。(3）細菌的數(shù)目還可以通過______法來測定。例如，測定飲用水中大腸桿菌的數(shù)目，可將________的水過濾后，將濾膜放到________培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌的菌落呈現(xiàn)____色，可以根據(jù)培養(yǎng)基上________的數(shù)目，計算出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。3．設(shè)置對照(1）設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中__________對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的________。（2）對照實驗是指除了________的條件以外，其他條件都______的實驗,其作用是比照實驗組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實是所測試的條件引起相應(yīng)的結(jié)果.二、實驗設(shè)計實驗設(shè)計包括對實驗方案，所需儀器、材料,用具和藥品，具體的________以及時間安排等的綜合考慮和安排。關(guān)于土壤中某樣品細菌的分離與計數(shù)的實驗操作步驟如下：1．土壤取樣土壤中的微生物70％～90％是_____，絕大多數(shù)分布在距地表______的近____性土壤中。2．樣品的稀釋樣品的________將直接影響平板上生長的菌落數(shù)目。通常選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在________之間、適于計數(shù)的平板.測定土壤中細菌的數(shù)量，一般選用____________倍的稀釋液進行平板培養(yǎng).第一次實驗時，可將稀釋范圍放寬一點，以保證能從中選擇出適于計數(shù)的平板.3．微生物的培養(yǎng)與觀察不同種類的微生物,往往需要不同的培養(yǎng)______和培養(yǎng)______。細菌一般在30~37℃的溫度下培養(yǎng)1~2d，放線菌一般在25～28℃的溫度下培養(yǎng)5～7d，而霉菌一般在25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取____________時的記錄作為結(jié)果,以防止因____________而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目.一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下（相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時間），同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。菌落的特征包括______________和______等方面。思考：土壤有“微生物的天然培養(yǎng)基”之稱,為什么？三、操作提示1．無菌操作2．做好標記3．制定計劃四、對分離得到的分解尿素的細菌的鑒定1．在細菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)中,細菌合成的______將尿素分解成了____.氨會使培養(yǎng)基的堿性______，pH______。因此，可以通過檢測培養(yǎng)基____的變化來判斷該化學(xué)反應(yīng)是否發(fā)生。2．在以______為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入______指示劑。培養(yǎng)某種細菌后，如果pH升高，指示劑將變____,說明該種細菌能夠________。答案：一、1。氮氨脲酶(1)菌株溫度抑制阻止（2）特定種類抑制阻止2．（1）活菌稀釋涂布平板法一個活菌菌落數(shù)30～300低菌落數(shù)（2）顯微鏡直接計數(shù)（3）濾膜已知體積伊紅美藍黑黑色菌落3．（1）非測試因素可信度（2)被測試相同二、實施步驟1．細菌3～8cm2．稀釋程度30～300104、105、1063．溫度時間菌落數(shù)目穩(wěn)定培養(yǎng)時間不足形狀、大小、隆起程度顏色思考：由于土壤具備了各種微生物生長所需的營養(yǎng)、水分、空氣、酸堿度、滲透壓和溫度等條件，是微生物生活的良好環(huán)境.四、1.脲酶氨增強升高pH2．尿素酚紅紅分解尿素1．培養(yǎng)基的類型及其應(yīng)用標準培養(yǎng)基類型配制特點主要應(yīng)用物理性質(zhì)固體培養(yǎng)基加入瓊脂較多菌種分離，計數(shù)半固體培養(yǎng)基加入瓊脂較少觀察微生物的運動、鑒定菌種液體培養(yǎng)基不加入瓊脂工業(yè)生產(chǎn)，連續(xù)培養(yǎng)化學(xué)組成合成培養(yǎng)基由已知成分配制而成，培養(yǎng)基成分明確菌種分類、鑒定天然培養(yǎng)基由天然成分配制而成，培養(yǎng)基成分不明確工業(yè)生產(chǎn)目的用途鑒別培養(yǎng)基添加某種指示劑或化學(xué)藥劑菌種的鑒別選擇培養(yǎng)基添加（或缺少）某種化學(xué)成分菌種的分離選擇培養(yǎng)基配制時可添加某種化學(xué)成分,這里的“添加”是在基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)成分的基礎(chǔ)上加入的。配制固體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基時加入的瓊脂是從紅藻中提取的,其主要成分是水溶性多糖,在配制培養(yǎng)基中作為凝固劑。2．選擇培養(yǎng)基一般來說，選擇培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)成分，以抑制不需要的微生物的生長，促進所需要的微生物的生長。如,加入青霉素可以抑制細菌、放線菌的生長，分離出酵母菌和霉菌；加入高濃度的食鹽可抑制多種細菌的生長，但不影響金黃色葡萄球菌的生長，從而分離得到該菌.培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分的缺少也可達到分離微生物的目的.如培養(yǎng)基中缺乏氮源時,可以分離固氮微生物,因為非固氮微生物不能在此培養(yǎng)基上生存.當(dāng)培養(yǎng)基的某種營養(yǎng)成分為特定化學(xué)成分時，也具有分離效果。如石油是唯一碳源時，可以抑制不能利用石油的微生物的生長，使能夠利用石油的微生物生存,達到分離能消除石油污染的微生物的目的。生物適應(yīng)一定環(huán)境，環(huán)境對生物具有選擇作用.所以通過配制選擇培養(yǎng)基、控制培養(yǎng)條件等均可以選擇出目的微生物，如將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)只能得到耐高溫的微生物。原則上只有目的微生物才能在選擇培養(yǎng)基上生長.但實際上，微生物培養(yǎng)是一個非常復(fù)雜的問題，有些微生物可以利用其他微生物的代謝產(chǎn)物生長繁殖，因此能夠在選擇培養(yǎng)基上生長的微生物是不是所需要的微生物，還需要進一步的驗證。3．顯微鏡直接計數(shù)法與稀釋涂布平板法的比較顯微鏡直接計數(shù)法是利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，是一種常用的微生物計數(shù)方法。此法是將經(jīng)過適當(dāng)稀釋的菌懸液放在血球計數(shù)板的載玻片與蓋玻片之間的計數(shù)室中，在顯微鏡下進行計數(shù).由于計數(shù)室的容積是一定的，所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來換算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。由于此法計得的是活菌和死菌的總和，故又稱為總菌計數(shù)法。此法的優(yōu)點是直觀、快速，但需要與血球計數(shù)板配套使用，且計數(shù)隨機性大，所以對菌體數(shù)量不能做出較為宏觀、全面的反映。平板菌落計數(shù)法通常做梯度稀釋，所以計數(shù)的線性范圍大。由于是菌懸液涂布，所以比較均勻,能較好地反映菌落的疏密程度，重復(fù)性、平行性好，是經(jīng)典的計數(shù)方法.但需要平板上長出菌落一段時間后才能計數(shù),因此速度慢是最大的缺點.4．在土壤中采集菌樣的方法與要點由于在土壤中幾乎可找到任何微生物，所以土壤往往是首選的采集目標。土壤采樣必須考慮以下幾個問題:（1）土壤中有機物的含量：有機物含量高，土質(zhì)較肥，一般在其中的微生物數(shù)量較多,反之微生物數(shù)量較少。(2）采土的深度：土壤的深度不同，其通氣、養(yǎng)分和水分的分布情況也不同。表層的土壤直接受日光曝曬，故較干燥，微生物也不易大量繁殖。在離地面5～20cm處的土壤中,（3）植被情況：植被的種類與微生物的分布有著密切的關(guān)系。例如，在冬天灌水的水稻田土壤中,真菌分布得較多。（4）采土的季節(jié)：以春秋兩季為宜。這時土壤中的養(yǎng)分、水分和溫度都較適宜,微生物的數(shù)量也最多。采土?xí)r尤其應(yīng)注意土壤的含水量，水分過多會造成厭氧環(huán)境，不利于放線菌的生長繁殖。真菌雖需要較高的相對濕度，但基質(zhì)中的水分卻不宜過多。因此要避免在雨季采集土樣.此外,土壤的pH也應(yīng)適當(dāng)注意,細菌和放線菌在中性或微堿性土壤中居多，而真菌則在偏酸性的土壤中較豐富。（5)采土方法：選擇好適當(dāng)?shù)攸c后，用小鏟子除去表土，取5～20cm處的土樣幾十克，盛入事先滅過菌的防水紙袋內(nèi)，并在上面記錄采土?xí)r間、5．實驗設(shè)計注意事項（1)設(shè)置重復(fù)組。實驗要有足夠的次數(shù)，才能避免結(jié)果的偶然性,使結(jié)論更有說服力與準確性。如該實驗中，可在每個稀釋度下設(shè)置3個選擇培養(yǎng)基平板；計數(shù)時在同一稀釋度下，至少對3個平板進行重復(fù)計數(shù)，求平均值.這樣也可以為實驗是否成功提供參考，如重復(fù)組結(jié)果不一致，則意味著操作有誤，需要重新實驗。（2）設(shè)置對照。對照的設(shè)置也會增加實驗結(jié)果的可信度和說服力.如在該實驗中，可在配制培養(yǎng)基時，準備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基兩種，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用，在相同的稀釋度下，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基的。另外，要設(shè)置空白對照，即在培養(yǎng)基中不加土樣，如果空白對照的培養(yǎng)基上沒有菌落生長,則說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。題型一選擇培養(yǎng)基的特點與應(yīng)用【例題1】（2009·上海高考）氯苯化合物是重要的有機化工原料，因其不易降解，會污染環(huán)境。某研究小組依照下列實驗方案（圖1）篩選出能高效降解氯苯的微生物SP1菌。培養(yǎng)基配方如下表。圖1培養(yǎng)基的組成液體培養(yǎng)基蛋白胨牛肉膏氯苯氯化鈉硝酸銨無機鹽(無碳）蒸餾水Ⅰ號1055mg5——1Ⅱ號-—50mg53適量1Ⅲ號——20～80mg53適量1（1)配制Ⅱ號固體培養(yǎng)基時，除添加Ⅱ號培養(yǎng)基成分外,還應(yīng)添加1%的________。(2）培養(yǎng)基配制時，滅菌與調(diào)pH的先后順序是________________________________________________________________________________。（3)從用途上來說，Ⅰ號培養(yǎng)基和Ⅱ號培養(yǎng)基分別屬于________培養(yǎng)基和________培養(yǎng)基。在Ⅱ號培養(yǎng)基中，為SP1菌提供氮源的成分是________。（4）在營養(yǎng)缺乏或環(huán)境惡劣時，SP1的菌體會變成一個圓形的休眠體,這種休眠體被稱為________。（5）將SP1菌接種在含不同濃度氯苯的Ⅲ號培養(yǎng)液中培養(yǎng)，得到生長曲線（如圖2）.從圖2可知，SP1菌在________培養(yǎng)條件下最早停止生長，其原因是_________________________________________________________________________________________________.圖2解析：(1）固體培養(yǎng)基必須含有適量的瓊脂。（2)配制培養(yǎng)基時應(yīng)先調(diào)pH后滅菌。（3）Ⅰ號培養(yǎng)基是為了獲得更多的菌株，屬于通用培養(yǎng)基，Ⅱ號培養(yǎng)基是為了選擇出SP1菌株，屬于選擇培養(yǎng)基,Ⅱ號培養(yǎng)基成分中含N物質(zhì)為硝酸銨，則應(yīng)由它為SP1菌株提供氮源。（4）在惡劣環(huán)境下一些菌體會形成芽孢休眠體，來度過不良環(huán)境.(5）SP1菌株是以氯苯為碳源，當(dāng)氯苯消耗盡菌株因缺少碳源而不能繼續(xù)生存，故氯苯含量越少,SP1菌株越早停止生長。答案:（1)瓊脂(2）先調(diào)pH，后滅菌(3）通用選擇硝酸銨（4）芽孢（5）20mg·L－1氯苯碳源最早耗盡題型二測定細菌數(shù)量的原理與方法【例題2】用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù),在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計結(jié)果，正確的是（）。A．涂布了1個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是230B．涂布了2個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是215和260,取平均值238C．涂布了3個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是21、212和256,取平均值163D．涂布了3個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是210、240和250，取平均值233解析:在設(shè)計實驗時，一定要涂布至少3個平板，作為重復(fù)組，才能增強實驗的說服力與準確性，所以A、B兩項不正確。C項雖涂布了3個平板,但是，其中1個平板的計數(shù)結(jié)果與另兩個相差太遠，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯誤，因此，不能簡單地用3個平板的計數(shù)值求平均值。答案:D反思領(lǐng)悟:在設(shè)計實驗時，一定要涂布至少3個平板作為重復(fù)組；在分析實驗結(jié)果時，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，如果結(jié)果差別過大，則意味著操作有誤，需重新實驗。題型三設(shè)計微生物的選擇方案【例題3】用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用需要設(shè)置的對照是（）。A．未接種的選擇培養(yǎng)基 B．未接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基C．接種了的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 D．接種了的選擇培養(yǎng)基解析：將菌液稀釋相同的倍數(shù),在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此,以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對照。對照遵循的是單一變量原則，所以與選擇培養(yǎng)基一樣接種、培養(yǎng)。答案：C反思領(lǐng)悟：對照實驗是指除了被測試的條件以外,其他條件都相同的實驗，其作用是比照實驗組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實是所測試的條件引起相應(yīng)的結(jié)果.1．下列是關(guān)于“檢測土壤中細菌總數(shù)”實驗操作的敘述，其中錯誤的是（）.A．用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，經(jīng)高溫、高壓滅菌后倒平板B．取104、105、106倍的土壤稀釋液和無菌水各0。1mL，分別涂布于各組平板上C．將實驗組和對照組平板倒置,37℃恒溫培養(yǎng)24～48D．確定對照組無菌后，選擇菌落數(shù)在300以上的實驗組平板進行計數(shù)2．若大腸桿菌和圓褐固氮菌混合在一起,采用下列哪組培養(yǎng)基可將它們分離?（)A．加食鹽的培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 B．伊紅美藍培養(yǎng)基和無氮培養(yǎng)基C．斜面培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基 D．加青霉素的培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基3．分析下面培養(yǎng)基的配方,回答下面的問題。KH2PO41.4Na2HPO42。1MgSO4·7H2O0.2葡萄糖10.0尿素1.0瓊脂15.0用蒸餾水定容到1000mL（1）在該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是________和________。（2)按物理性質(zhì)劃分該培養(yǎng)基屬于________培養(yǎng)基，理由是培養(yǎng)基中含有________；該類培養(yǎng)基常用于微生物的純化、________和________。（3）由于培養(yǎng)基中只有尿素一種______源，所以該培養(yǎng)基只能用于能夠合成________的微生物的培養(yǎng)。用此培養(yǎng)基培養(yǎng)土壤浸出液能夠從土壤中篩選出________細菌.(4)在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，并能抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱作________培養(yǎng)基。4．（2011·課標全國理綜）有些細菌可分解原油，從而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同學(xué)欲從受原油污染的土壤中篩選出能高效降解原油的菌株?；卮鹣铝袉栴}。（1）在篩選過程中,應(yīng)將土壤樣品稀釋液接種于以________為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上，從功能上講，該培養(yǎng)基屬于________培養(yǎng)基.（2）純化菌種時,為了得到單菌落，常采用的接種方法有兩種，即________和________.（3）為了篩選出高效菌株，可比較單菌落周圍分解圈的大小，分解圈大說明該菌株的降解能力________________________________________________________________________。（4)通常情況下，在微生物培養(yǎng)過程中，實