DB41T 1587-2018 飼料中大腸桿菌O157的檢測 EMA-PCR法

DB41DB41/T1587—2018飼料中大腸桿菌O157的檢測EMA-PCR法2018-04-17發(fā)布2018-07-17實施河南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I1GB4789.6食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗致4.42×PremixTaq緩沖液：內(nèi)含TaqDNA聚合酶1.25a）上游引物：5＇-CAGGTGAAGGTGGAATGGTTGT-3';4.11疊氮溴化乙錠（EMA，0.2mg/mL見附錄A的A.5。4.12溴化乙錠（10mg/mL）。4.13滅菌離心管：1.5mL，15mL。25.4離心機：轉(zhuǎn)速≥12000r/min。取25g試樣于225mL營養(yǎng)肉湯（4菌液轉(zhuǎn)移至10mL腸道增菌肉湯（4.3）中，42℃±1℃培養(yǎng)18h。如果試樣量不足25g，試樣質(zhì)量與增菌鹵素?zé)粽丈湎缕毓?min，然后水浴煮沸10min，再將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴中使其快速冷卻。渦旋混勻裂解稱取1.5g瓊脂糖（4.6）加入100mL1×TAE電泳緩沖液（4.9）中，加熱使其充分熔化，冷至65℃左右，加入5μL溴化乙錠（4.12），充分混勻，根據(jù)需要在模板內(nèi)放入合適的梳子，倒入凝膠3與1μL6×上樣緩沖液（4.10）混合后加入到上樣孔內(nèi)，設(shè)Mar恒壓下電泳20min～30min。如果大腸桿菌O157陽性對照的PCR產(chǎn)物在318bp處出現(xiàn)條帶（參見附錄B），同時陰性對照PCR產(chǎn)物于318bp處未出現(xiàn)條帶，則檢測結(jié)果成立樣品的PCR產(chǎn)物電泳后在318bp處出現(xiàn)條帶，則為疑似陽性樣品，此時需按GB4789.6進行確證樣品的PCR產(chǎn)物電泳后在318bp處未出現(xiàn)條帶，判定25g樣品中未檢出大腸桿菌O157。4培養(yǎng)基和試劑A.1.1成分10.0g3.0g5.0g水1000mLA.1.2制法A.2.1成分10.0g5.0g20.0g8.0g2.0g0.015g水1000mLA.2.2制法A.3.1成分242.0g37.2g57.1mL942.9mLA.3.2制法5調(diào)節(jié)至pH8.3，定容至1L后，室溫保存。使用時稀釋50倍即為A.4.1成分0.5g0.5g0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA，pH8.0）0.06mL360mL640mLA.4.2制法0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶于500mL滅菌水中，加入溴酚藍和二甲苯氰FF溶解，與甘油混合，定容至1000mL，分裝后4℃保存。A.5.1成分疊氮溴化乙錠5mg滅菌水25mLA.5.2制法5mg疊氮溴化乙錠溶于5mL滅菌水中，定容至25mL，充分混勻，分裝后-20℃避光