第03章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法課件

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究思路進(jìn)行初步觀察形成可驗(yàn)證的假說(shuō)設(shè)計(jì)對(duì)照試驗(yàn)收集資料解釋結(jié)果作出合理結(jié)論查閱已有知識(shí)第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法CaenorhabditiselegansDrosophilamelanogasterArabidopsisthaliana生物學(xué)研究模式生物第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究模式生物微生物細(xì)胞病毒孟加拉斑馬魚(yú)熒光斑馬魚(yú)全身透明斑馬魚(yú)第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法不同物種享有共同分子機(jī)制第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

細(xì)胞組分的分析方法

細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy）

電子顯微鏡技術(shù)(Electromicroscopy)

掃描探針顯微鏡（ScanningProbeMicroscope）掃描隧道顯微鏡(scanningtunnelingmicroscope)

第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy)

普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)

熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)（LaserConfocalMicroscopy）

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）

微分干涉顯微鏡（differentialinterferencecontrastmicroscope,DIC）

錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhancemicroscopy）第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法光鏡樣本制作第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法分辨率是指區(qū)分開(kāi)兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離。第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法熒光顯微鏡技術(shù)

（FluorescenceMicroscopy）

原理與應(yīng)用

直接熒光標(biāo)記技術(shù)

間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)

在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位：

如綠色熒光蛋白(GFP)的應(yīng)用

第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法熒光顯微鏡技術(shù)原理第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法體視熒光顯微鏡第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色直接熒光標(biāo)記技術(shù)第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法現(xiàn)代生物學(xué)的北斗星2008年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予美國(guó)科學(xué)家下村修、馬丁-查爾菲，華裔化學(xué)家錢(qián)永健，他們因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)和發(fā)展綠色熒光蛋白(GFP)而獲獎(jiǎng)的。多種顏色熒光的大腸桿菌組成的“錢(qián)氏實(shí)驗(yàn)室”字樣

第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)

（LaserScanningConfocalMicroscopy）激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)原理第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

應(yīng)用：

1.排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng)圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，高品質(zhì)的熒光成像;2.多維觀察,重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu);3.可進(jìn)行一二三標(biāo)記;4.動(dòng)、靜態(tài)觀察；

5.定性與定量分析。

第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法實(shí)例美國(guó)哈佛大學(xué)的吉恩·里維特(JeanLivet)使用共焦顯微技術(shù)(confocalmicroscopy)，拍攝了一只基因工程小鼠的腦干組織切片(厚340μm)。(即“腦虹”技術(shù)，Brainbow)美國(guó)北卡羅來(lái)納大學(xué)惠明頓分校的索尼婭·派奧特(SonjaPyott)拍攝到了小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞

.毛細(xì)胞為綠色，與毛細(xì)胞有突觸聯(lián)系的細(xì)胞為紅色，藍(lán)色的則是細(xì)胞核第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）將光程差或相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，可用于觀察活細(xì)胞

微分干涉顯微鏡（differential-interferencemicroscope）偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成 明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法AcomparisonofyeastcellsthatweregrowingonthevaginalepitheliumseenwithdifferenttypesofLM.a)underbright-field;b)phase-contrast;c)DIC第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhancemicroscopy）計(jì)算機(jī)輔助的DIC顯微鏡可在高分辨率下研究活細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)。第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、電子顯微鏡技術(shù)

電子顯微鏡的基本知識(shí)

電鏡與光鏡的比較

電鏡與光鏡光路圖比較

電子顯微鏡的基本構(gòu)造

主要電鏡制樣技術(shù)

負(fù)染色技術(shù)

冰凍蝕刻技術(shù)

超薄切片技術(shù)

電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

掃描電鏡（Scanningelectronmicroscope，SEM）

SPM(Scanningprobemicroscope)第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法電鏡與光鏡的比較

顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見(jiàn)光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對(duì)光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對(duì)電子的散射和透射形成明暗反差第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法電鏡與光鏡光路圖比較第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法電子顯微鏡的基本構(gòu)造第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法主要電鏡制樣技術(shù)

超薄切片技術(shù)用于電鏡觀察的樣本制備示意圖

負(fù)染色技術(shù)（Negativestaining）與金屬投影 染色背景，襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)

冰凍蝕刻技術(shù)（Freezeetching）（技術(shù)示意圖） 冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型：主要用來(lái)觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。 快速冷凍深度蝕刻技術(shù)（quickfreezedeepetching）

電鏡三維重構(gòu)技術(shù) 電子顯微術(shù)、電子衍射與計(jì)算機(jī)圖象處理相結(jié)合而形成的具有重要應(yīng)用前景的一門(mén)新技術(shù)。 電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-射線(xiàn)晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)（StructuralBiology）

——主要研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實(shí)驗(yàn)手段。第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法Examplesofnegtivelystainedandmetal-shadowedspecimens.Electronmicrographsofatobaccorattlevirusafternegtivestainingwithpotassiumphosphotungstate(a)orshadowcastingwithchromium(b).第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法掃描電鏡

原理與應(yīng)用：

電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測(cè)器收集二次電子成象。

CO2臨界點(diǎn)干燥法防止引起樣品變形的表面張力問(wèn)題第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法掃描電鏡外觀第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法三、掃描隧道顯微鏡ScanningProbeMicroscope,SPM(80年代發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器)

包括：STM、AFM、磁力顯微鏡、摩擦力顯微鏡等原理：掃描探針與樣品接觸或達(dá)到很近距離時(shí)，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，并在計(jì)算機(jī)顯示出來(lái)，從而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。

裝置：掃描的壓電陶瓷，逼近裝置，電子學(xué)反饋控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集、處理、顯示系統(tǒng)。

特點(diǎn)：（1）可對(duì)晶體或非晶體成像，無(wú)需復(fù)雜計(jì)算，且分辨本領(lǐng)高。（側(cè)分辨率為0.1～0.2nm，縱分辨率可達(dá)0.01nm）； （2）可實(shí)時(shí)得到樣品表面三維圖象，可測(cè)量厚度信息；（3）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測(cè)量。 （4）可連續(xù)成像，進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察

用途：納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)。第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法透射電鏡外觀第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

透射電鏡下的細(xì)胞第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

活細(xì)胞工作站可實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞水平上的定性和定量分析、活細(xì)胞圖像處理、活細(xì)胞動(dòng)態(tài)示蹤。在分子水平，可做到基因定位定量表達(dá)的動(dòng)態(tài)分析、蛋白質(zhì)合成降解運(yùn)輸和相互作用的動(dòng)態(tài)研究、細(xì)胞骨架的代謝動(dòng)力學(xué)測(cè)定和細(xì)胞周期各時(shí)相的動(dòng)態(tài)觀察等。

現(xiàn)在市場(chǎng)上使用的活細(xì)胞工作站由高級(jí)自動(dòng)倒置顯微鏡、活細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間孵育系統(tǒng)、Z軸微光切系統(tǒng)（數(shù)碼共聚焦系統(tǒng)）、單色儀、高靈敏冷CCD、圖像軟件工作站組成。還需要加熱控制器；溫度控制器；CO2控制器；CO2培養(yǎng)箱。用于培養(yǎng)狀態(tài)下細(xì)胞動(dòng)態(tài)的研究。儀器可以自動(dòng)聚焦、單細(xì)胞追蹤、多位點(diǎn)成像。成像速度高、圖像清晰度高。四、活細(xì)胞工作站第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法用途：1、活細(xì)胞熒光標(biāo)記蛋白的長(zhǎng)時(shí)程失蹤觀察2、活細(xì)胞運(yùn)動(dòng)分化形態(tài)示蹤觀察3、熒光共定位4、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）5、熒光圖像處理、測(cè)量第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法

離心分離技術(shù)

細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類(lèi)等的顯示方法

特異蛋白抗原的定位與定性

細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

放射自顯影技術(shù)

定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、離心分離技術(shù)

用途：于分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物

差速離心：分離密度不同的細(xì)胞組分

密度梯度離心：精細(xì)組分或生物大分子的分離第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法差速離心A等速度沉降B等密度沉降密度梯度離心第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、

酶、糖與脂類(lèi)等的顯示方法

原理：利用一些顯色劑與所檢測(cè)物質(zhì)中一些 特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過(guò)顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來(lái)判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。

第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法FeulgenStaining第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法三、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫熒光技術(shù)： 快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限（圖）

蛋白電泳(SDS)

與免疫印跡反應(yīng)(Western-Blot)

免疫電鏡技術(shù)：

免疫鐵蛋白技術(shù)

免疫酶標(biāo)技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)

應(yīng)用：通過(guò)對(duì)分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動(dòng)態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

光鏡水平的原位雜交技術(shù)

（同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針）

電鏡水平的原位雜交技術(shù)

（生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標(biāo)記結(jié)合）

PCR技術(shù)

第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法人類(lèi)染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法五、放射自顯影技術(shù)

原理及應(yīng)用：

利用同位素的放射自顯影，對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究；

實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究和追蹤。

步驟：

前體物摻入細(xì)胞（標(biāo)記：持續(xù)標(biāo)記和脈沖標(biāo)記）

———放射自顯影第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法六．定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)

細(xì)胞顯微分光光度術(shù)（Microspectrophotometry）

利用細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對(duì)特異光譜的吸收，測(cè)定這些物質(zhì) （如核酸與蛋白質(zhì)等）在細(xì)胞內(nèi)的含量。 包括：紫外光顯微分光光度測(cè)定法可見(jiàn)光顯微分光光度測(cè)定法

流式細(xì)胞儀（FlowCytometry）

主要應(yīng)用：用于定量測(cè)定細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量； 測(cè)定細(xì)胞群體中不同時(shí)相細(xì)胞的數(shù)量； 從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞； 分離DNA含量不同的中期染色體。

第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法流式細(xì)胞術(shù)第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與

顯微操作技術(shù)

細(xì)胞的培養(yǎng)

細(xì)胞工程第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、細(xì)胞的培養(yǎng)

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

類(lèi)型：原代培養(yǎng)細(xì)胞（primaryculturecell） 繼代培養(yǎng)細(xì)胞（sub-culturecell）

細(xì)胞系（cellline）有限細(xì)胞系，永生細(xì)胞系

細(xì)胞株（cellstrain）

植物細(xì)胞

類(lèi)型：

原生質(zhì)體培養(yǎng)（體細(xì)胞培養(yǎng)）

單倍體細(xì)胞培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）

非細(xì)胞體系（cell-freesystem）

第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞懸浮液10代細(xì)胞50代細(xì)胞無(wú)限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞系有限與無(wú)限細(xì)胞系如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；細(xì)胞株和細(xì)胞系？多數(shù)組織細(xì)胞固定在表面生長(zhǎng)和分裂。隨細(xì)胞增多，細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖遺傳物質(zhì)改變第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法Hela細(xì)胞（左）、CHO細(xì)胞（右）的培養(yǎng)第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法獲得細(xì)胞細(xì)胞的全能性細(xì)胞株、細(xì)胞系植物體培養(yǎng)結(jié)果或細(xì)胞產(chǎn)物快速繁殖、培育無(wú)病毒植株等培養(yǎng)目的葡萄糖、動(dòng)物血清蔗糖、植物激素培養(yǎng)基特有成分液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基性質(zhì)細(xì)胞增殖原理動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)比較項(xiàng)目植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的比較第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用（1）生產(chǎn)蛋白生物制品：病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等。（2）獲得大量自身的皮膚細(xì)胞，用于植皮。（3）用于檢測(cè)有毒物質(zhì)（4）用于生理、病理、藥理等方面的研究，為治療和預(yù)防疾病提供理論依據(jù)這只老鼠身上的“人耳”是由我國(guó)科學(xué)家曹誼林教授利用細(xì)胞工程技術(shù)復(fù)制出來(lái)的。第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

二、細(xì)胞工程

細(xì)胞融合（cellfusion）與細(xì)胞雜交（cellhybridization）技術(shù)

單克隆抗體（monocloneantibody）技術(shù)

細(xì)胞拆合與顯微操作技術(shù)

物理法結(jié)合顯微操作技術(shù)(圖1、圖2)

化學(xué)法結(jié)合離心技術(shù)

制備核體（karyoplast）和胞質(zhì)體（cytoplast）。

其它技術(shù)遺傳分析（mutant,knockout,knockin）

對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)的研究成為當(dāng)今生命科學(xué)發(fā)展的瓶頸第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法主要用于制備單克隆抗體獲得雜種植株用途物理、化學(xué)方法（同左）滅活的病毒物理（離心、振蕩、電刺激）化學(xué)（聚乙二醇）誘導(dǎo)方法使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合細(xì)胞融合的方法細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞膜的流動(dòng)性、植物細(xì)胞全能性細(xì)胞融合的原理動(dòng)物細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交比較項(xiàng)目比較項(xiàng)目（一）植物、動(dòng)物細(xì)胞融合的比較第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞融合單克隆抗體技術(shù)第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法(二)單克隆抗體提出問(wèn)題：長(zhǎng)期以來(lái)，人們?yōu)榱双@得抗體，采用的是把某種抗原反復(fù)注射到動(dòng)物體內(nèi)，然后從動(dòng)物血清中分離出所需抗體的方法。用這種方法獲得的抗體，不僅產(chǎn)量低，而且抗體的特異性差，純度低，反應(yīng)不夠靈敏。單克隆抗體的概念第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法（1）為什么用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合？思考：（2）單克隆抗體制備過(guò)程中應(yīng)用哪些細(xì)胞工程技術(shù)手段？（3）制備過(guò)程為何要經(jīng)過(guò)兩次篩選？第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法單克隆抗體有何應(yīng)用？

主要用于疾病的診斷、治療和預(yù)防。與常規(guī)抗體相比，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。如；各種癌癥、肝炎病毒、SARS病毒、細(xì)菌及血吸蟲(chóng)等數(shù)百種疾病的診斷；在疾病治療方面，單克隆抗體猶如人體衛(wèi)士，能識(shí)別“自己”與“異己”，一旦發(fā)現(xiàn)致病因素便與之結(jié)合將其殺死。若在單抗上帶上抗癌藥物制成“生物導(dǎo)彈”，將藥物定向帶到癌細(xì)胞所在部位，既消滅了癌細(xì)胞又不會(huì)傷害健康細(xì)胞。第03章細(xì)胞生物學(xué)研究方法

絕大多數(shù)的單克隆抗體(mAb)是用小鼠開(kāi)發(fā)的，雖然可作為研究和診斷的工具，但它們至少在一定程度上不是理想的治療劑，因?yàn)樗鼈冊(cè)谌祟?lèi)中有免疫原性。也就是說(shuō)，小鼠抗體引入到病人體內(nèi)，將被病人的免疫系統(tǒng)識(shí)別為外源物質(zhì)，并將發(fā)生有損治療抗體利用的人抗鼠抗體(HAMA)應(yīng)答。已經(jīng)通過(guò)將這些鼠的抗體人源化或直接制備人的mAb來(lái)解決。

最近，通過(guò)用人免疫球蛋白基因取代小鼠免疫球蛋白基因創(chuàng)建了產(chǎn)生人抗體