玉米抗絲黑穗病多標(biāo)記分子輔助育種技術(shù)規(guī)程

DB23/TXXXX—XXXX

玉米抗絲黑穗病多標(biāo)記分子輔助育種技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了玉米抗絲黑穗病多標(biāo)記分子輔助育種的術(shù)語和定義、儀器、育種材料及育種程序。

本文件適用于玉米(ZeamaysL.）抗絲黑穗病分子標(biāo)記輔助育種。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文

件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適

用于本文件。

NYT1248.3-2006玉米抗病蟲性鑒定技術(shù)規(guī)范第3部分：玉米抗絲黑穗病鑒定技術(shù)規(guī)范

NY-T1432-2014玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

玉米絲黑穗病maizeheadsmut

由絲軸黑粉菌（Sphacelothecareiliana(Kühn)Clint.）侵染所引起的玉米真菌性病害，在7葉期之前

穿透玉米胚芽鞘、中胚軸或根部的表皮細(xì)胞完成侵染，初期顯癥不明顯，在開花期破壞雌穗和雄穗的

正常結(jié)構(gòu)，形成黑粉孢子堆積造成絕產(chǎn)。

3.2

標(biāo)記輔助選擇

利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記對目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇的育種技術(shù)。

3.3

多標(biāo)記組合

利用與育種目標(biāo)性狀緊密連鎖的2個(gè)及以上的分子標(biāo)記組合。

3.4

前景選擇標(biāo)記

用于檢測目標(biāo)性狀的分子標(biāo)記。

3.5

背景選擇標(biāo)記

1

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用于檢測試驗(yàn)材料遺傳背景的分子標(biāo)記。

4儀器

4.1DNA提取儀器

研缽、核酸提取磨樣機(jī)、水浴鍋、移液器、低溫高速離心機(jī)和通風(fēng)櫥等。

4.2PCR檢測儀器

PCR儀、移液器、電泳儀、電泳槽和凝膠成像系統(tǒng)。

5育種材料

5.1感病受體親本

選取農(nóng)藝性狀優(yōu)良但感或高感絲黑穗病的玉米自交系，且不具有bin2.09主效抗病位點(diǎn)/基因和

bin8.03次主效抗病位點(diǎn)的玉米自交系，作為感病受體親本（P1）。

5.2抗病供體親本

選取在田間表現(xiàn)為高抗絲黑穗病，且具有bin2.09主效抗病位點(diǎn)/基因和bin8.03次主效抗病位點(diǎn)的玉

米自交系，作為抗病供體親本（P2）。

6育種程序

6.1雜交

以P1為母本，以P2為父本，人工授粉雜交，獲得F1代雜交種子。

6.2回交

以F1為母本，以P1為父本，人工授粉雜交，獲得BC1F1世代雜交種子。

6.3BC1F1基因分型

6.3.1采樣

BC1F1世代雜交種子樣品可以是種子的胚乳、幼苗的葉片等可用于DNA提取的玉米植物組織。樣

品采集后立刻用于DNA提取或冷凍保存。采樣時(shí)應(yīng)記錄每個(gè)體樣品名稱、樣品編號(hào)、采樣地點(diǎn)和時(shí)間

等。

6.3.2DNA提取與純化

將每個(gè)體樣品研磨粉末200mg~300mg轉(zhuǎn)入2mL離心管，加入0.5mL2×CTAB提取緩沖液充分

混勻，在55℃～65℃恒浴30min。加入1mL氯仿:異戊醇（24：1），充分搖動(dòng)5min，8000g，室

溫下離心5min。取上清液加入2.5×體積預(yù)冷無水乙醇，﹣20℃冰箱放置2h以上，15000g離心20

min。用70%的預(yù)冷乙醇洗一次，自然干燥后，用200μL0.1×TE緩沖液溶解，置4℃保存。也可采

用其他能夠達(dá)到PCR擴(kuò)增質(zhì)量要求的DNA提取方法。

2

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6.3.3前景選擇

6.3.3.1標(biāo)記信息

使用的分子標(biāo)記為玉米抗絲黑穗病bin2.09主效和bin8.03次主效QTL所在位點(diǎn)的連鎖標(biāo)記或抗病基

因的功能標(biāo)記，詳細(xì)信息見附錄1。

6.3.3.2PCR擴(kuò)增

采用20μL的反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增。單標(biāo)記反應(yīng)體系包含每種dNTP(2.5mM/mL)2ul，10×Taq

Buffer2ul，25mMMgcl21ul，Primer-F(20u)0.5ul，Primer-R(20u)0.5ul，Taq(5U/uL)1ul，

DNA(20ng/μL~50ng/μL)2ul，ddH2O11ul。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：PCR程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min，1個(gè)循

環(huán)；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸10s，共34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。單標(biāo)記PCR

產(chǎn)物分別進(jìn)行酶切，反應(yīng)體系包括10×NEBuffer1ul，限制性內(nèi)切酶0.4ul，PCR產(chǎn)物2.5ul，ddH2O

6.1ul，37℃孵育3h左右。

6.3.3.3酶切產(chǎn)物檢測

對酶切產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳，如個(gè)體攜帶抗病位點(diǎn)或基因，LSdCAP2、

LSdCAP3、LSdCAP8和DNdCAPS8.031標(biāo)記酶切產(chǎn)物大小分別為93bp，136bp，132bp和137bp，可選取

同時(shí)攜帶4個(gè)抗病位點(diǎn)或基因的個(gè)體。

6.3.4背景選擇

對入選個(gè)體進(jìn)行遺傳背景分析，使用的分子標(biāo)記為簡單重復(fù)序列（SampleSequenceRepeat，

SSR）標(biāo)記進(jìn)行遺傳背景，詳細(xì)信息見NY-T1432-2014《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》中的附

錄C。篩選遺傳背景與P1基因型相似度最高的個(gè)體。

6.4BC1F1回交

以從6.3中獲得的BC1F1為母本，以P1為父本，人工授粉雜交，獲得BC2F1雜交種子。

6.5BC2F1基因分型

按照6.3的基因分型方法執(zhí)行，篩選同時(shí)含有4個(gè)抗病位點(diǎn)或基因、遺傳背景與P1基因型相似度最

高的個(gè)體。

6.6BC2F1回交

以從6.5中獲得的BC2F1為母本，以P1為父本，人工授粉雜交，獲得BC3F1雜交種子。

6.7BC3F1基因分型

按照6.4的基因分型方法執(zhí)行，篩選同時(shí)含有4個(gè)抗病位點(diǎn)或基因、遺傳背景與P1基因型相似度最

高的個(gè)體。

6.8BC3F1回交

從6.7中獲得的BC3F1自交，混收，獲得BC3F2種子。

6.9BC3F2基因分型

3

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按照6.3的基因分型方法執(zhí)行，篩選同時(shí)含有4個(gè)純合抗病位點(diǎn)或基因、遺傳背景與P1基因型相似

度最高的個(gè)體。將BC3F2單株種植于田間，選取農(nóng)藝性狀與P1接近的單株。

6.10選系

將6.9中獲得的單株進(jìn)行自交至BC3F4代，從中選擇農(nóng)藝性狀與P1相似的材料進(jìn)行系選，絲黑穗病

抗性鑒定按照NYT1248.3-2006的規(guī)定執(zhí)行，通過小區(qū)品比試驗(yàn)，選出優(yōu)良抗病自交系。

4

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附錄1dCAPS分子標(biāo)記信息

標(biāo)記信息

序QTL所在的QTL表型貢

標(biāo)記名稱標(biāo)記類型SNP

號(hào)染色體位置獻(xiàn)率（%）引物退火溫度內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)預(yù)期產(chǎn)物大小

位置突變位點(diǎn)

上游TACATTGATATTTGCCACACGAAT5’CTGCAG3’

1LSdCAP2連鎖標(biāo)記2.093655PstI93/73,2069T/C

下游CAAATCAACGAGTGATTTACTGCA3’GACGTC5’

上游GGCTGCGCCGTGAGATACT5’ACTGGN3’

2LSdCAP3連鎖標(biāo)記2.093655BsrI136/22,11420T/G

下游GCTCTCGATCTGTCCTTGTCACCA3’TGACCN5’

上游CGACAACGCCCGCCATCGCCG5’CCGC3’

3LSdCAP8功能標(biāo)記2.093660AciI132/19,11322C/G

下游TTGAGGTTGCCGAGGTCAGT3’GGCG5’

上游AGCTCAACGCAATTCATTGTGC5’GWGCWC3’

4DNdCAPS8.03-1功能標(biāo)記8.031065BsiHKAI137/114,2397C/T

下游CGCTCACTGCCAAGTTTTGC3’CWCGWG3’

1

ICS65.020.20

CCSB05

DB23

黑龍江省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB23/TXXXX—XXXX

玉米抗絲黑穗病多標(biāo)記分子輔助育種技術(shù)

規(guī)程（征求意見稿）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

黑龍江省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

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玉米抗絲黑穗病多標(biāo)記分子輔助育種技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了玉米抗絲黑穗病多標(biāo)記分子輔助育種的術(shù)語和定義、儀器、育種材料及育種程序。

本文件適用于玉米(ZeamaysL.）抗絲黑穗病分子標(biāo)記輔助育種。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文

件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適

用于本文件。

NYT1248.3-2006玉米抗病蟲性鑒定技術(shù)規(guī)范第3部分：玉米抗絲黑穗病鑒定技術(shù)規(guī)范

NY-T1432-2014玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

玉米絲黑穗病maizeheadsmut

由絲軸黑粉菌（Sphacelothecareiliana(Kühn)Clint.）侵染所引起的玉米真菌性病害，在7葉期之前

穿透玉米胚芽鞘、中胚軸或根部的表皮細(xì)胞完成侵染，初期顯癥不明顯，在開花期破壞雌穗和雄穗的

正常結(jié)構(gòu)，形成黑粉孢子堆積造成絕產(chǎn)。

3.2

標(biāo)記輔助選擇

利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記對目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇的育種技術(shù)。

3.3

多標(biāo)記組合

利用與育種目標(biāo)性狀緊密連鎖的2個(gè)及以上的分子標(biāo)記組合。

3.4

前景選擇標(biāo)記

用于檢測目標(biāo)性狀的分子標(biāo)記。

3.5

背景選擇標(biāo)記

1

DB23/TXXXX—XXXX

用于檢測試