蛋白質(zhì)的化學

第四章蛋白質(zhì)的化學第一節(jié)蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)第二節(jié)蛋白質(zhì)的化學組成第三節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)與合成原理第四節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能第五節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)第六節(jié)蛋白質(zhì)的分離與純化的基本原理第七節(jié)蛋白質(zhì)的分類第1頁，共123頁。第一節(jié)蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)一蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體的基本成分蛋白質(zhì)(protein):是由許多不同的α-氨基酸按一定的序列通過酰胺鍵(肽鍵)縮合而成的,具有較穩(wěn)定的構(gòu)象并具有一定生物功能的大分子.蛋白質(zhì)存在于所有的生物細胞中,是構(gòu)成生物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì).

第2頁，共123頁。蛋白質(zhì)的分布:蛋白質(zhì)是細胞中含量最豐富的高分子有機化合物.

占人體總干重的45%,細菌占50-80%,

干酵母47%,高等植物大豆含40%第3頁，共123頁。二蛋白質(zhì)具有多樣性的生物學功能蛋白質(zhì)在生命活動過程中有重要的作用：生物催化,酶類，已知的有3000種以上代謝調(diào)節(jié)，部分激素免疫保護，抗體、干擾素物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和貯存，載體蛋白運動與支持，肌肉、骨骼、鞭毛控制生長和分化，基因表達調(diào)控接受和傳遞信息，配體和受體構(gòu)成生物膜.第4頁，共123頁。第二節(jié)蛋白質(zhì)的化學組成一蛋白質(zhì)的元素組成

蛋白質(zhì)是一類含氮有機化合物.某些蛋白質(zhì)還含有微量元素,主要是磷(P)、鐵(Fe)、銅(Cu)、鋅(Zn)和碘(I)等.

N的含量平均為16%：凱氏(Kjadehl)定氮法的理論基礎(chǔ)蛋白質(zhì)的含量=蛋白質(zhì)的含氮量×100/16=蛋白質(zhì)的含氮量×6.25第5頁，共123頁。化學式：C3H6N6第6頁，共123頁。第68頁，共123頁。第72頁，共123頁。第六節(jié)蛋白質(zhì)的分離與純化的基本原理谷胱甘肽(glutathione，GSH)(一)根據(jù)溶解度不同的分離純化方法帶正電荷的極性氨基酸：賴氨酸、精氨酸、組氨酸透析:將蛋白質(zhì)溶液放在半透膜袋內(nèi),置于適當?shù)囊子谂c氧結(jié)合,使Hb與氧結(jié)合的速度大大加快.荷質(zhì)比:凈電荷,大小,形狀免疫分離純化:免疫親和層析第115頁，共123頁。第60頁，共123頁。二.蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的基本單位氨基酸(aminoacids):是蛋白質(zhì)水解的最終產(chǎn)物,是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本單位.

所有蛋白質(zhì)都由20種基本氨基酸組成.

氨基酸的結(jié)構(gòu)第7頁，共123頁。第8頁，共123頁。第9頁，共123頁。第10頁，共123頁。20種氨基酸(aa)的結(jié)構(gòu)特點:均為L-氨基酸均為α氨基酸,脯氨酸除外(α亞氨基酸)α-碳原子為不對稱碳原子(甘氨酸除外)各種aa的R側(cè)鏈各不相同第11頁，共123頁。2.不常見氨基酸在少數(shù)蛋白質(zhì)中分離出一些不常見的氨基酸,這些氨基酸都由相應的基本氨基酸衍生而來的.其中重要的有4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、N-甲基賴氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等.這些不常見蛋白質(zhì)氨基酸的結(jié)構(gòu)如下：第12頁，共123頁。三、氨基酸可根據(jù)側(cè)鏈結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進行分類非極性氨基酸：丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸不帶電荷的極性氨基酸：甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺帶正電荷的極性氨基酸：賴氨酸、精氨酸、組氨酸帶負電荷的極性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸極性氨基酸第13頁，共123頁。幾種特殊氨基酸

脯氨酸（亞氨基酸）CH2CHCOO-NH2+CH2CH2CH2CHCOO-NH2+CH2CH2第14頁，共123頁。

半胱氨酸+胱氨酸二硫鍵-HH-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3第15頁，共123頁。第16頁，共123頁。四、氨基酸其他重要的概念必需氨基酸(essentialaminoacid,EAA)：人體體內(nèi)自身不能合成,必須從食物中獲

成人有8種必需氨基酸：賴氨酸(Lys)纈氨酸(Val)色氨酸(Try)

亮氨酸(Leu)異亮氨酸(Ile)蘇氨酸(Thr)

苯丙氨酸(Phe)甲硫氨酸（蛋氨酸）(Met)

嬰兒時期所需:精氨酸(Arg)、組氨酸(His)

食物蛋白質(zhì)的互補作用:營養(yǎng)價值較低的食物蛋白質(zhì)合理搭配、混合食用,從而互補必需氨基酸的不足,提高營養(yǎng)價值.第17頁，共123頁。2.紫外吸收色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸在280nm附近有一定的吸收.原因：分子中含有苯環(huán)(共軛雙鍵).據(jù)此可以通過測定蛋白質(zhì)溶液280nm的吸光值測定蛋白質(zhì)含量第18頁，共123頁。3.茚三酮反應氨基酸與水合茚三酮一起加熱,生成藍紫色化合物,在570nm處有最大吸收.可用作aa含量分析.氨基酸與水合茚三酮共熱,發(fā)生氧化脫氨反應,生成的NH3與還原吲三酮及水合茚三酮脫水縮合,生成藍紫色化合物第19頁，共123頁。4.兩性解離及等電點不同pH時氨基酸以不同的離子化形式存在：

氨基酸所帶靜電荷為零時,溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點(isoelectricPoint),以pI表示pI的用途：分離、純化和鑒定蛋白質(zhì)制劑、AA制劑，在藥物使用上可改變PI方法延長療效第20頁，共123頁。五、氨基酸的分離與分析1.自動氨基酸分析儀2.高效液相色譜(highperformanceliguidchromatography，HPLC)3.離子交換層析4.質(zhì)譜(MS)第21頁，共123頁。第三節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)與合成原理蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)分為一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)(二、三、四級結(jié)構(gòu)).一蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)(primarystructure)一級結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的種類、數(shù)量及排列順序.包含的共價鍵主要指肽鍵和二硫鍵(disulfidebond).第22頁，共123頁。(一)肽鍵(peptidebond)和肽鏈(polypeptide)肽鍵：一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基

之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵.第23頁，共123頁。肽鍵特點：組成肽鍵的原子處于同一平面肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì),不能自由旋轉(zhuǎn)肽健C-N:0.133nmC＝N:0.125nmC－N:0.145nm第24頁，共123頁。肽(peptide):氨基酸借肽鍵相連而形成的化合物.

二肽,三肽……

蛋白質(zhì)與多肽并無嚴格的界線,通常將分子量在

6kDa以上的多肽稱為蛋白質(zhì)寡肽(oligopeptide):由10個以內(nèi)氨基酸連成的小肽肽鏈:氨基酸之間通過肽鍵連接形成的鏈.

有鏈狀、環(huán)狀和分支狀.氨基酸殘基(aminoacidresidue):組成多肽的氨基酸單元.氨基酸在形成肽鏈時丟失一分子水,分子已不完整.二硫鍵：兩分子半胱氨酸殘基的巰基脫氫生成的，可存在肽鏈內(nèi)部和肽鏈之間.第25頁，共123頁。多肽鏈的一端含有一個游離的

-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個游離的

-羧基，稱為羧基端或C-端.氨基酸的順序是從N端的氨基酸殘基開始，以C端氨基酸殘基為終點的排列順序.如上述五肽可表示為:Ser-Val-Tyr-Asp-GlnSVYDQSer-Val和Val-Ser是相同的二肽嗎？第26頁，共123頁。多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位生物活性肽:1.谷胱甘肽(glutathione，GSH)功能：GSH是體內(nèi)重要的還原劑構(gòu)成第一個肽鍵的羧基是谷氨酸的γ－羧基2.促甲狀腺素釋放激素由下丘腦分泌,促進腺垂體釋放促甲狀腺素(調(diào)節(jié)糖代謝)第27頁，共123頁。3.牛胰島素結(jié)構(gòu)：第28頁，共123頁。第29頁，共123頁。(二)蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的原理一級結(jié)構(gòu)測定目的:知道氨基酸的組成和排列順序

一級結(jié)構(gòu)確定的原則：將大化小,逐段分析,制成兩套肽片段,找出重疊位點,排出肽的前后位置,最后確定蛋白質(zhì)的完整序列.第30頁，共123頁。2.1N-末端氨基酸的分析(1)二硝基氟苯法(DNFB)分離DNP-氨基酸，用紙層析、HPLC進行分析該方法已過時首先由Sanger應用，確定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)第31頁，共123頁。(2)丹磺酰氯法(DNS-Cl):此法優(yōu)點,丹磺酰-氨基酸有很強的熒光性質(zhì)，檢測靈敏度比DNFB高100倍，產(chǎn)物不必提取直接分析第32頁，共123頁。(3)Edman降解法(苯異硫氰酸酯法、PITC法、PTC法、PTH法)Edman于1950年首先提出第33頁，共123頁。(4)氨肽酶法：一種肽鏈外切酶.能從肽鏈N端開始逐個切掉氨基酸第34頁，共123頁。2.2C-末端氨基酸的分析羧肽酶法：羧肽酶是一種肽鏈C-端外切酶，目前常用的羧肽酶：A,B,C和Y.種類作用類型A脂肪族或芳香族氨基酸（脯氨酸除外）B堿性氨基酸CC末端的脯氨酸Y幾乎所有類型氨基酸（最適用）第35頁，共123頁。(2)肼解法:也稱聯(lián)氨法.多肽與肼在無水條件下加熱,C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來,其余的氨基酸則變成肼化物.肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離.第36頁，共123頁。3.大分子多肽氨基酸順序的確定采用兩種或多種不同的斷裂方法將長肽斷裂成兩套或多套小肽,并將其分離純化、分別測序.多肽的選擇性降解的方法有：化學法：溴化氰水解法,它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵.酶解法:第37頁，共123頁。第38頁，共123頁。利用重疊肽確定肽段在多肽鏈中的次序：利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊,拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序.第39頁，共123頁。5.從核酸順序推導氨基酸順序原理：通過核酸的氨基酸順序（三個核苷酸確定一個氨基酸的密碼）。優(yōu)點：對經(jīng)典化學法難以測定的大分子蛋白質(zhì)或生物體含量很低的蛋白質(zhì)很適用缺點：無法提供二硫鍵的位置等信息第40頁，共123頁。二蛋白質(zhì)的構(gòu)象(conformation)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)不具有功能,只有形成正確的結(jié)構(gòu)才具有功能.二級結(jié)構(gòu)以上的結(jié)構(gòu)叫高級結(jié)構(gòu),高級結(jié)構(gòu)是指各原子或基團在空間上的分布,所以又叫空間結(jié)構(gòu),或三維結(jié)構(gòu)可分為:二級結(jié)構(gòu),三級結(jié)構(gòu),四級結(jié)構(gòu)第41頁，共123頁。(一)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)(secondarystructure)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指肽鏈的主鏈在空間的排列,或規(guī)則的幾何走向、旋轉(zhuǎn)及折疊.只涉及肽鏈主鏈的構(gòu)象及鏈內(nèi)或鏈間形成的氫鍵.主要有

-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角.第42頁，共123頁。1.α-螺旋(α-helix)

由肽鍵平面盤旋形成的螺旋狀構(gòu)象Pauling和Corey于1965年提出第43頁，共123頁。結(jié)構(gòu)要點：天然蛋白質(zhì)中螺旋的方向大都為右手螺旋(僅在嗜熱菌蛋白酶中發(fā)現(xiàn)了一段左手螺旋).每3.6個氨基酸螺旋上升一圈,每圈螺旋的高度為0.54nm,每個氨基酸殘基沿軸上升0.15nm,肽鍵平面與中心軸平行.主鏈原子構(gòu)成螺旋的主體,側(cè)鏈在其外部肽鏈內(nèi)形成氫鍵，氫鍵的取向幾乎與軸平行，第一個氨基酸殘基的-CO基與第四個氨基酸殘基的-NH基形成氫鍵.是穩(wěn)定螺旋的主要作用力第44頁，共123頁。影響α-螺旋穩(wěn)定性的因素：在多肽鏈中連續(xù)的出現(xiàn)帶同種電荷的極性氨基酸，阻止氫鍵形成，α-螺旋就不穩(wěn)定Pro的N上缺少H，不能形成氫鍵，它改變多肽鏈的方向并終止螺旋Gly的R基太小，難以形成α-螺旋所需的兩面角，也是螺旋的最大破壞者肽鏈中連續(xù)出現(xiàn)帶龐大側(cè)鏈的氨基酸如Ile，由于空間位阻，也難以形成α-螺旋pH的影響第45頁，共123頁。（4條α-螺旋）原纖維微原纖維巨原纖維紡錘體型皮質(zhì)細胞角質(zhì)膜皮質(zhì)髓質(zhì)頭發(fā)頭發(fā)結(jié)構(gòu)燙發(fā)的生物化學過程第46頁，共123頁。2.β-折疊(β-pleatedsheet)

-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列,通過鏈間氫鍵交聯(lián)形成.肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象.第47頁，共123頁。

-折疊的結(jié)構(gòu)要點：肽鍵平面呈鋸齒狀排列,側(cè)鏈Ｒ基團交錯分布在片層平面的兩側(cè)由氫鍵維持穩(wěn)定.其方向與折疊的長軸接近垂直.有兩種類型:平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊:反平行式，即相鄰肽鏈的方向相反每一個氨基酸在主軸上所占的距離，平行的是0.325nm，反平行的是0.35nm.反平行式更穩(wěn)定.第48頁，共123頁。3.

-轉(zhuǎn)角(β-turn)也稱

-回折或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，存在于球狀蛋白中在

-轉(zhuǎn)角部分，由四個氨基酸殘基組成彎曲處的第一個氨基酸殘基的-C=O和第四個殘基的–N-H之間形成氫鍵，維持構(gòu)象.經(jīng)常出現(xiàn)在連接反平行β-折疊片的端頭.第49頁，共123頁。4.無規(guī)卷曲(randomcoil)自由回轉(zhuǎn)

無規(guī)律的松散肽鏈結(jié)構(gòu).常常是酶的活性部位第50頁，共123頁。(二)超二級結(jié)構(gòu)指二級結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)單位(α-螺旋,β-折疊等)相互聚集,形成有規(guī)律的在空間上能辨認的聚集體.已知的超二級結(jié)構(gòu)主要有αα,βαβ,β-曲折和β-折疊筒等.

是氨基酸側(cè)鏈相互作用的結(jié)果.超二級結(jié)構(gòu)在結(jié)構(gòu)層次上高于二級結(jié)構(gòu)，但沒有聚集成具有功能的結(jié)構(gòu)域．又稱基序或模塊（motifs）第51頁，共123頁。第52頁，共123頁。(三)結(jié)構(gòu)域(structuraldomain)結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白質(zhì)的折疊單位.多肽鏈在超二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進一步繞曲折疊成緊密的近似球行的結(jié)構(gòu),具有部分生物功能.第53頁，共123頁。第54頁，共123頁。結(jié)構(gòu)域一般由100-200個aa組成,氨基酸可以連續(xù),也可以不連續(xù)．結(jié)構(gòu)域之間常形成裂隙,比較松散,往往是蛋白質(zhì)優(yōu)先被水解的部位.酶的活性中心往往位于兩個結(jié)構(gòu)域的界面上．可作為結(jié)構(gòu)單位進行相對獨立的運動,水解后仍能維持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu),甚至保留某些生物活性．對于較小的蛋白質(zhì)分子,結(jié)構(gòu)域與三級結(jié)構(gòu)等同,即這些蛋白為單結(jié)構(gòu)域.結(jié)構(gòu)域有時也稱功能域,功能域是指有功能的部分.功能域可以是一個結(jié)構(gòu)域,也可以是兩個或兩個以上的結(jié)構(gòu)域組成.第55頁，共123頁。(四)三級結(jié)構(gòu)(tertiarystructure)蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進一步盤旋、折疊,從而生成特定的空間結(jié)構(gòu).包括主鏈和側(cè)鏈的所有原子的空間排布．

一般非極性側(cè)鏈埋在分子內(nèi)部，形成疏水核，極性側(cè)鏈在分子表面．第56頁，共123頁。(四)四級結(jié)構(gòu)(quarternarystructure)蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)是指由多條各自具有一、二、三級結(jié)構(gòu)的肽鏈通過非共價鍵連接起來的結(jié)構(gòu)形式,內(nèi)容包括各個亞基在蛋白質(zhì)中的空間排列方式及亞基之間的相互作用關(guān)系.

這種蛋白質(zhì)分子中，每一個具有獨立三級結(jié)構(gòu)的肽鏈,稱為亞基(Subunit),它一般由一條肽鏈構(gòu)成,無生理活性,只有當這些亞基聚合成一個完整的蛋白質(zhì)分子后,才具有生物活性第57頁，共123頁。由2-10個亞基組成的蛋白稱為寡聚體oligomer

更多亞基組成的蛋白稱多聚體(polymer)第58頁，共123頁。(五)維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的化學鍵1氫鍵(hydrogenbond):一個電負性大的原子上的氫和另一個電負性大的原子相互作用形成的鍵.2疏水鍵(hydrophobicbond):由兩個非極性基團因避開水而聚在一起的作用力.第59頁，共123頁。3鹽鍵(ionicbond):蛋白分子中正電荷基團和負電荷基團之間的靜電吸引所形成的化學鍵.4范德華引力(VanderWaals):原子,分子,基團間的一種弱作用力.5二硫鍵(disulfidebond)第60頁，共123頁。維系蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)：肽鍵、二硫鍵維系蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)：氫鍵維系蛋白質(zhì)分子的三級結(jié)構(gòu)：疏水相互作用力、氫鍵、范德華力、鹽鍵維系蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)：范德華力、鹽鍵第61頁，共123頁。三蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測定1.二級結(jié)構(gòu)測定通常采用圓二色光譜(circulardichroism，CD)測定溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量.

-螺旋的CD峰有222nm處的負峰、208nm處的負峰和198nm處的正峰三個成分；而

-折疊的CD譜不很固定第62頁，共123頁。2.三級結(jié)構(gòu)測定X射線衍射法(X-raydiffraction)和核磁共振技術(shù)(nuclearmagneticresonance,NMR)是研究蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)最準確的方法第63頁，共123頁。四蛋白質(zhì)和多肽合成的基本原理(一)化學合成法的基本原理氨基酸的基團保護氨基保護基Y：Cbz-Cl(芐氧碳酰氯)：H2/Pd或Na-液氨法去除Boc-Cl(叔丁氧碳酰氯)：稀鹽酸法去除第64頁，共123頁。2.縮合劑：N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(N,N′-dicyclohexylcarbodiimide,縮寫DCCI)第65頁，共123頁。多肽的液相合成(1)氨基酸的基團保護(2)接肽縮合反應(3)除去保護集團循環(huán)反應，合成順序N端到C端第66頁，共123頁。多肽的固相合成常用固相載體：聚苯乙烯樹脂羧基與載體相連.合成方向：C端到N端第67頁，共123頁。(二)生物技術(shù)合成蛋白質(zhì)1.基因工程(geneticengineering)(DNA重組)2.細胞工程(cellengineering)3.酶工程(enzymeengineering)第68頁，共123頁。第四節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能一蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系1.一級結(jié)構(gòu)不同,生物學功能各異不同蛋白質(zhì)有不同功能的根本原因是一級結(jié)構(gòu)的不同.一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)進而決定功能.第69頁，共123頁。第70頁，共123頁。2.一級結(jié)構(gòu)中關(guān)鍵部分相同,功能也相同

ACTH：促腎上腺皮質(zhì)激素,垂體前葉分泌第71頁，共123頁。3.一級結(jié)構(gòu)中關(guān)鍵部分變化,其生物活性也改變第72頁，共123頁。4.一級結(jié)構(gòu)的變化與疾病的關(guān)系如鐮刀貧血病(sickle-cellanemia),其不正常的血紅蛋白(Hb-S)與正常的血紅蛋白(Hb-A)的差別：僅僅在于β鏈的N-末端第6位殘基發(fā)生變化CTT→CAT第73頁，共123頁。糖尿病是胰島素51個氨基酸中僅有一氨基酸殘基異常:

這類由遺傳突變引起的在分子水平上僅存在微觀差異而導致的疾病稱作分子病第74頁，共123頁。高濃度中性鹽：鹽析作用構(gòu)成第一個肽鍵的羧基是第109頁，共123頁。帶負電荷的極性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸第28頁，共123頁。所有蛋白質(zhì)都由20種基本氨基酸組成.四蛋白質(zhì)和多肽合成的基本原理第28頁，共123頁。蛋白質(zhì)是由氨基酸組成，因此蛋白質(zhì)的性質(zhì)與氨基酸相似,但由于蛋白質(zhì)是由許多氨基酸通過肽鍵形成了大分子化合物,也就出現(xiàn)了一些新的性質(zhì).熔點：180℃（分解）.葡聚糖凝膠(商品名Sephadex)(2)丹磺酰氯法(DNS-Cl):此法優(yōu)點,丹磺酰-氨基酸有很強的熒光性質(zhì)，檢測靈敏度比DNFB高100倍，產(chǎn)物不必提取直接分析在多肽鏈中連續(xù)的出現(xiàn)帶同種電荷的極性氨基酸，阻止氫鍵形成，α-螺旋就不穩(wěn)定N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺結(jié)構(gòu)域之間常形成裂隙,比較松散,往往是蛋白質(zhì)優(yōu)先被水解的部位.二蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)分子特定的空間構(gòu)象是其具有生物活性所必需的.1.蛋白質(zhì)前體的活化有些蛋白在體內(nèi)是以無活性的蛋白質(zhì)原形式合成和分泌的,經(jīng)過裂解之后才表現(xiàn)出活性.一些酶原和蛋白質(zhì).第75頁，共123頁。例：胰島素,在剛合成時為前胰島素原,其的N-末端有一段肽鏈,稱為信號肽.信號肽被切去,變成胰島素原.其由84個aa組成,僅有10%活性,經(jīng)水解成一條21個aa的A鏈,一條30個aa的B鏈，才有完整的生物活性.第76頁，共123頁。2.蛋白質(zhì)的變構(gòu)現(xiàn)象變構(gòu)作用(allostericeffect)：又稱別構(gòu)效應,指含亞基的蛋白質(zhì)分子由于一個亞基構(gòu)象的改變而引起其余亞基以至整個分子構(gòu)象、性質(zhì)和功能發(fā)生變化.以血紅蛋白為例：血紅蛋白(Hb),四聚體(α2β2),與氧的親和力很弱,但當氧與Hb分子中一個亞基的血紅素輔基的鐵結(jié)合后.即引起該亞基構(gòu)象的改變,一個亞基構(gòu)象的改變又會引起其余亞基的構(gòu)象相繼發(fā)生改變,易于與氧結(jié)合,使Hb與氧結(jié)合的速度大大加快.第77頁，共123頁。3蛋白質(zhì)構(gòu)象改變與疾病蛋白質(zhì)構(gòu)象病比如：朊病毒蛋白（PrP)第78頁，共123頁。三蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與生物進化

同源蛋白：在不同有機體中實現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì).同源蛋白中的一級結(jié)構(gòu)中有許多位置的氨基酸對所有種屬來說都是相同的，稱為不變殘基；其他位置的氨基酸稱可變殘基.不同種屬的可變殘基有很大變化.可用于判斷生物體間親緣關(guān)系的遠近.

第79頁，共123頁。例：細胞色素C,80個物種中,有26個位置上的氨基酸殘基完全不變,是維持其構(gòu)象中發(fā)揮特有功能所必要的部位,屬于不變殘基.第80頁，共123頁。

可變殘基可能隨著進化而變異，而且不同種屬的細胞色素C氨基酸差異數(shù)與種屬之間的親緣關(guān)系相關(guān).親緣關(guān)系相近者，氨基酸差異少，反之則多(進化樹)第81頁，共123頁。第五節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)是由氨基酸組成，因此蛋白質(zhì)的性質(zhì)與氨基酸相似,但由于蛋白質(zhì)是由許多氨基酸通過肽鍵形成了大分子化合物,也就出現(xiàn)了一些新的性質(zhì).第82頁，共123頁。一蛋白質(zhì)分子的大小、形狀及分子量的測定1.蛋白質(zhì)是分子量很大的生物分子，相對分子質(zhì)量一般大于1×104.最高可達4×107(煙草花葉病毒)．2.球形不對稱常數(shù)接近1

纖維狀不對稱常數(shù)遠大于10

橢圓形不對稱常數(shù)介于中間第83頁，共123頁。3.分子量測定的方法1)估算分子量方法：

a)根據(jù)化學成分測定最小相對分子質(zhì)量

首先利用化學分析方法測定蛋白質(zhì)分子中某一特殊成分的百分含量,假定蛋白質(zhì)分子中該成分只有一個,據(jù)其百分含量可計算出最低相對分子質(zhì)量：

最小分子量=原子量/組成百分數(shù)ⅹ100

如：細胞色素C鐵=0.45%，其最小分子量=12237

第84頁，共123頁。b)根據(jù)氨基酸的數(shù)目

20種氨基酸的平均分子量為128

肽鍵個數(shù)=縮合失水分子數(shù)=氨基酸分子總個數(shù)－肽鏈條數(shù)

已知20種氨基酸的平均分子量是128，現(xiàn)有一蛋白質(zhì)分子由兩條多肽鏈組成，共有肽鍵98個,問此蛋白質(zhì)的分子量最接近于（）2)較精確測定分子量的主要方法有超速離心法、分子篩層析法、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、生物質(zhì)譜法等.

11036第85頁，共123頁。a）超速離心法在60000～80000rpm的高速離心力作用下,蛋白質(zhì)分子會沿旋轉(zhuǎn)中心向外周方向移動,用光學方法測定界面移動的速度即為蛋白質(zhì)的離心沉降速度.蛋白質(zhì)的沉降速度與分子大小和形狀有關(guān).沉降系數(shù)是溶質(zhì)顆粒在單位離心場中的沉降速度,用S表示.一個S單位為1×10-13秒第86頁，共123頁。相對分子質(zhì)量越大,S值越大蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)：1～200S由沉降系數(shù)S可根據(jù)斯維得貝格〔Svedberg〕方程計算蛋白質(zhì)分子的相對分子質(zhì)量：第87頁，共123頁。b)分子篩層析法,也叫凝膠過濾法所用介質(zhì)為凝膠珠,其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu).一定型號的凝膠網(wǎng)孔只允許相應大小的分子進入凝膠顆粒內(nèi)部,大分子則被排阻在外.洗脫時大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來,洗脫液體積小;小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來穿去,歷程長,后洗脫下來,洗脫體積大.第88頁，共123頁。測定蛋白質(zhì)分子量一般用葡聚糖,商品名:Sephadex先測得幾種標準蛋白質(zhì)的洗脫體積〔Ve〕以相對分子質(zhì)量對數(shù)(logM)對Ve作圖,得一標準曲線再測出未知樣品洗脫體積〔Ve〕從標準曲線上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量一定范圍內(nèi):Ve＝K1－K2logM第89頁，共123頁。c)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS)SDS:十二烷基硫酸鈉,變性劑普通蛋白質(zhì)電泳的泳動速率取決于荷質(zhì)比:凈電荷,大小,形狀用SDS和巰基乙醇(打開二硫鍵)處理蛋白質(zhì)變性并與SDS結(jié)合,形成SDS-蛋白質(zhì)復合物,使蛋白質(zhì)分子均帶負電.

0.4g-1.4gSDS/1g

此方法只能測得亞基肽鏈的相對分子質(zhì)量第90頁，共123頁。十二烷基硫酸鈉

Sodiumdodecylsulfate

分子式：CH3(CH2)11OSO3Na

分子量：C12H25NaO4S=288.38

性狀：白色或淺黃色結(jié)晶或粉末.

熔點：180℃（分解）.

十二烷基磺酸鈉

Dodecylsulfonicacidsodiumsalt

分子式：CH3(CH2)11SO3Na

分子量：C12H25NaO3S=272.38

性狀：白色或淺黃色結(jié)晶或粉末.

熔點：300℃.第91頁，共123頁。水平式電泳裝置垂直式電泳裝置第92頁，共123頁。用幾種標準蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的對數(shù)值對它們的遷移率作圖，測出待測樣品的遷移率，從標準曲線上查出樣品的相對分子量.d)生物質(zhì)譜法更準確的分子量測定方法第93頁，共123頁。二蛋白質(zhì)的變性(denaturation)變性是指蛋白質(zhì)受物理或化學因素的影響,使蛋白質(zhì)分子原有的特定的空間構(gòu)象發(fā)生改變,從而導致蛋白質(zhì)性質(zhì)的改變以及生物活性的喪失.但一級結(jié)構(gòu)未遭破壞.1.變性蛋白質(zhì)的特性：變性蛋白質(zhì)主要標志是生物學功能的喪失溶解度降低,易形成沉淀析出,粘度增加而擴散系數(shù)減小結(jié)晶能力喪失,分子形狀改變,肽鏈松散,反應基團增加,易被酶消化第94頁，共123頁。2.變性的因素物理因素:加熱、紫外線、X-射線、超聲波等.化學因素:酸、堿、有機溶劑、蛋白變性劑(尿素、鹽酸胍)、重金屬鹽等.3.蛋白質(zhì)的復性(renaturation)除去變性因素后,有的變性蛋白質(zhì)又可恢復其天然構(gòu)象和生物活性,這一現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的復性第95頁，共123頁。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)第96頁，共123頁。三蛋白質(zhì)的兩性電離與等電點

等電點(pI):在某一pH值溶液中,蛋白質(zhì)酸性基團和堿性基團的解離程度相當,蛋白質(zhì)分子所帶正負電荷相等,凈電荷為零.此時溶液的pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點(pI).第97頁，共123頁。四蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)分子顆粒大小1-100nm之間,屬膠體顆粒范圍,在溶液中能形成穩(wěn)定的膠體,具有膠體溶液的典型性質(zhì)如布郎運動、丁達爾現(xiàn)象、不能透過半透膜、具有吸附能力等.蛋白質(zhì)的親水膠體溶液相當穩(wěn)定：1.表面親水基團吸引周圍的水分子,使水分子定向排列在它的周圍,形成“水化層”.2.蛋白質(zhì)在非等電點時帶有同種電荷,同種電荷相斥,使蛋白質(zhì)分子保持一定的距離而不聚合.+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)第98頁，共123頁。五蛋白質(zhì)的沉淀反應(pre-cipitation)當破壞了維持蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素甚至蛋白質(zhì)的構(gòu)象時,蛋白質(zhì)就會從溶液中析出,這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的沉淀使蛋白質(zhì)沉淀的方法:鹽析法(saltingout)

向蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽低濃度中性鹽：鹽溶作用高濃度中性鹽：鹽析作用第99頁，共123頁。常用的中性鹽：硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等作用原理:鹽離子與水親和力極強,奪去蛋白質(zhì)的水化層,減少分子間靜電斥力特點：不破壞蛋白質(zhì)的構(gòu)象,蛋白質(zhì)不發(fā)生變性分段鹽析：調(diào)節(jié)鹽濃度,可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出.

如血清球蛋白(50硫酸銨飽和度)

清蛋白(飽和硫酸銨)第100頁，共123頁。(2)有機溶劑沉淀法原理:使蛋白質(zhì)脫去水化層,又能降低溶液的介電常數(shù)使蛋白質(zhì)表面電荷減少,導致蛋白質(zhì)分子聚集而沉淀.常用有機溶劑:甲醇、乙醇、丙酮缺點：常會使蛋白質(zhì)變性注意事項:必須低溫下操作,盡量縮短處理的時間第101頁，共123頁。重金屬鹽沉淀法原理:重金屬離子如Hg2+、Ag+、Pb2+等帶有正電荷,能與蛋白質(zhì)分子中帶負電基團結(jié)合,生成不溶性的重金屬蛋白鹽而沉淀.

若溶液pH大于蛋白質(zhì)的pI,沉淀更易發(fā)生缺點：此法常使蛋白質(zhì)變性失活(4)加熱:變性導致沉淀第102頁，共123頁。(5)生物堿試劑和某些酸類沉淀法原理:生物堿試劑(如鞣酸、苦味酸、鎢酸等),某些酸類(三氯乙酸、磺酰水楊酸和硝酸等),與帶正電的蛋白質(zhì)結(jié)合生成不溶性的鹽而沉淀注意事項:反應溶液的pH<pI,確保蛋白質(zhì)以陽離子形式存在缺點：此法常使蛋白質(zhì)變性失活第103頁，共123頁。六蛋白質(zhì)的顏色反應第104頁，共123頁。七蛋白質(zhì)的免疫學性質(zhì)1.抗原(antigen,Ag):外源和非自身的能被免疫系統(tǒng)識別并產(chǎn)生免疫應答的物質(zhì).免疫原性(Immunogenicity):能刺激生物體產(chǎn)生免疫應答并產(chǎn)生抗體或免疫淋巴細胞的特性.免疫反應性(Specificreactivity):能與所產(chǎn)生免疫應答產(chǎn)物進行結(jié)合并發(fā)生反應的能力.半抗原(Hapten)-不具免疫原性只具免疫反應性的物質(zhì).抗原決定簇(Determinant):是抗原引起免疫應答和與抗體結(jié)合反應的基本結(jié)構(gòu)單位.常位于抗原分子的表面,由3-8個氨基酸構(gòu)成.

分為a.構(gòu)象決定簇b.順序決定簇第105頁，共123頁。2.抗體(antibody,Ab):能與抗原特異性結(jié)合,并具免疫功能的球蛋白.免疫球蛋白(immunoglobulinIg)抗體活性及和抗體結(jié)構(gòu)類似的球蛋白家族多克隆抗體(polyclonalantibodies)：針對各種抗原決定簇的許多不同的抗體.單克隆抗體(monoclonalantibodyMcAb)：針對單一抗原決定簇第106頁，共123頁?？乖贵w反應具有高度特異性3蛋白質(zhì)免疫性的應用疾病的免疫預防,免疫診斷,免疫治療免疫分析:放射免疫分析(RIA)酶聯(lián)免疫分析:(EIA)免疫分離純化:免疫親和層析BACK第107頁，共123頁。第六節(jié)蛋白質(zhì)分離與純化的基本原理一蛋白質(zhì)的提取1.材料的選擇.含目的蛋白多,來源方便,注意處理過程2.組織細胞破碎.有機械方法、超聲法等3.提取分離.合適的溶劑和方法、防止酶解.第108頁，共123頁。

二蛋白質(zhì)的分離與純化(一)根據(jù)溶解度不同的分離純化方法

1等電點沉淀法

2鹽析沉淀法

3低溫有機溶劑沉淀法

4溫度對蛋白質(zhì)溶解度的響

(二)根據(jù)分子大小不同的分離純化方法

1透析(dialysis)和超濾法(ultrafiltration)第109頁，共123頁。透析:將蛋白質(zhì)溶液放在半透膜袋內(nèi),置于適當?shù)木彌_液中,小分子雜質(zhì)(如硫酸銨等)可從袋中透出,而蛋白質(zhì)保留于袋中,從而將蛋白質(zhì)純化.第110頁，共123頁。

超濾法：利用壓力或離心力強行使水和小分子雜質(zhì)通過超濾膜(一種半透膜)除去,而蛋白質(zhì)留在膜上.第111頁，共123頁。2分子篩層析(molecular-sievehormatography)

也叫凝膠過濾(gel-