分子生物學(xué)(化工1版)教案：第五章-分子生物學(xué)的研究方法

PAGEPAGE1第五章分子生物學(xué)的研究方法本單元或章節(jié)的教學(xué)目的與要求掌握瓊脂糖凝膠電泳的基本原理、薩瑟恩DNA印跡雜交、諾塞恩RNA印跡雜交、斑點印跡雜交和狹線印跡雜交、Westernblot的基本原理；掌握感受態(tài)菌的制備；了解ddNTP鏈終止法原理；掌握限制性內(nèi)切酶和DNA聚合酶的原理；了解堿性磷酸酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的作用；了解重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體、克隆載體的種類和植物的克隆載體輔助教學(xué)情況（多媒體課件、板書、繪圖、標(biāo)本、示教等）授課主要內(nèi)容及學(xué)時分配5學(xué)時分子生物學(xué)從20世紀(jì)中葉開始得到高速發(fā)展，主要原因之一是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究方法的進(jìn)步，特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步?；虿僮髦饕―NA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定點突變和PCR擴增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)?；蚬こ淌侵冈隗w外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子中，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)。因此，基因工程技術(shù)其實是核酸操作技術(shù)的一部分，但我們在這里強調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與表達(dá)。5.1重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件最近數(shù)十年來，分子生物學(xué)研究取得了前所未有的進(jìn)步，概括地說，主要有3大成就：(1)在20世紀(jì)40年代確定了遺傳信息的攜帶者、即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；(2)50年代提出了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機制，解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；(3)50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說，成功地破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流動與表達(dá)機制。自孟德爾以來，遺傳學(xué)研究的有效手段就是讓具有不同對應(yīng)性狀的兩個個體進(jìn)行交配。然后，根據(jù)子代出現(xiàn)的性狀的分離比來確定染色體上基因的排列。在這類研究中，有時候出現(xiàn)這種情況：即原來推斷在同一染色體上的基因，在子代中卻顯示在不同的染色休上。之所以出現(xiàn)這種情況，就是因為在雜交時，親本的一部分染色體發(fā)生交換所致。這樣一來，在后代會出現(xiàn)雙親所沒有的基因的組合。這種現(xiàn)象稱為遺傳性的重組，或者基因的重組(圖6．1)。第一個實驗美國斯坦福大學(xué)的伯格(P.Berg)進(jìn)行了第一個重組DNA實驗。他是一位曾經(jīng)在有關(guān)RNA和蛋白質(zhì)合成的研究上做過出色貢獻(xiàn)的生物化學(xué)家。自六十年代后期，人們對SV40病毒發(fā)生興趣。所謂SV，即為simianvirus(猿猴病毒)之簡稱。顧名思義，是從猿猴分離的病毒，它能夠使倉鼠、人、大鼠、兔子及猴類等許多動物的細(xì)胞發(fā)生癌變。其DNA很小，呈環(huán)狀，易侵染培養(yǎng)的腎細(xì)胞。1972年，伯格等做了把SV40與其他的DNA片段相連接的實驗。首先，分別用限制酶EcoRI切斷想要連接的兩種DNA。由于當(dāng)時在市場上尚來出售EcoRI，所以，伯格是從在附近的加州大學(xué)正從事該酶研究的博耶(H.W.Boyer)那里得到轉(zhuǎn)讓的。所用的兩種環(huán)狀DNA都只存在一個EcoRI的切點。其次，用核酸外切酶進(jìn)行處理，使兩個末端失去單鏈結(jié)構(gòu)，然后再加別的酶及核苷酸，分別使SV40一方產(chǎn)生一AAAAA一鏈，使λdvgal一方產(chǎn)生一TTTTT一那樣的互補鏈。最后，為了使二者互相結(jié)合，用DNA聚合酶和DNA連接酶等進(jìn)行處理。經(jīng)過這樣復(fù)雜的操作，形成了出兩種DNA連接而成的環(huán)狀的DNA(圖6.2)。伯格并沒有把如此制成的重組DNA(由于這是由兩種不同的DNA連接而成的，所以也叫做雜種DNA)拿來感染大腸桿菌，并讓它們在大腸桿菌中繁殖。他只是使用超速離心機等手段，確證了環(huán)狀DNA(如圖6.2所示)的產(chǎn)生。因此，雖然不能說伯格等的實驗是首次基因轉(zhuǎn)移的實際實驗，但至少可以說這是制造重組DNA的第一次實驗。伯格的這些成就受到高度的評價，遂與吉爾伯特(W.Gilbert)、桑格(F.Sanger)一起獲得了1980年度的諾貝爾化學(xué)獎。與伯格同樣在斯坦福大學(xué)工作的科恩(S.N．Cohen)等，開創(chuàng)了重組DNA實驗的基礎(chǔ)技術(shù)。他們選用了pSC101質(zhì)粒作為基因的“搬運工”。根據(jù)1973年發(fā)表的研究，他們使用限制酶EcoRI切割pSC101的環(huán)狀DNA，同時，也使用EcoRI切割擬轉(zhuǎn)移的DNA，將兩個樣品混合起來，再使用DNA連接酶把二者連接起來。然后，將經(jīng)過這種處理的質(zhì)粒加入到含有鈣鹽的大腸桿菌的培養(yǎng)液中，先保持一段時間的低溫，再加溫數(shù)分鐘，就可使質(zhì)粒侵染大腸桿菌。由于pSCl01中含有抗四環(huán)素的基因，所以可以通過把細(xì)菌接種在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中觀察細(xì)菌能否生存下來以判斷細(xì)菌是否受到了質(zhì)粒的侵染。這樣，凡存活下來的細(xì)菌，也就是侵染了質(zhì)粒的細(xì)菌，隨著這種細(xì)菌的增殖，菌體內(nèi)的質(zhì)粒也增加了(圖6.3)?？贫鞯仁褂玫倪@種方法，是一種將基因從某種生物轉(zhuǎn)移到另一種生物的基本方法，已成為基因工程的基礎(chǔ)技術(shù)。翌年，即1974年，斯坦福大學(xué)和加州大學(xué)共同進(jìn)行了令人感到奇妙的實驗。那就是，將非洲爪蟾的DNA切斷，把它連接到pSC101中，再轉(zhuǎn)移到大腸桿菌里的實驗(圖6.4)。5.2DNA操作技術(shù)5.2.1核酸的凝膠電泳自從瓊脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺(po1yacrylamide)凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分部分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段。同時也是現(xiàn)在通用的許多分子生物學(xué)研究方法，例如DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制酶切分析以及限制酶切作圖等的技術(shù)基礎(chǔ)，因此受到了有關(guān)科學(xué)工作者的高度重視。1.基本原理凝膠電泳的原理比較簡單。我們知道當(dāng)一種分子被放置在電場當(dāng)中時，它們就會以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它同電場的強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。也就是說，電場強度越大，電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)量越多，其遷移的速度也就越快，反之則較慢。由于在電泳中使用了一種無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)，如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等，從而降低了對流運動，故電泳的遷移率又是同分子的摩擦系數(shù)成反比的。已知摩擦系數(shù)是分子的大小、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù)，因此根據(jù)分子大小的不同、構(gòu)型或形狀的差異，以及所帶的凈電荷的多寡，便可以通過電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離開來。在生理條件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團，是呈離子化狀態(tài)的。從這種意義上講，DNA和RNA的多核苷酸鏈可叫做多聚陰離子(polyanions)。因此，當(dāng)核酸分子被放置在電場當(dāng)中時，它們就會向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場強度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。分子量較小的DNA分子，比分子量較大的DNA分子，具有較緊密的構(gòu)型，所以其電泳遷移率也就比同等分子量的松散型的開環(huán)DNA分子或線性DNA分子要快些。這就是應(yīng)用凝膠電泳技術(shù)分離DNA片段的基本原理。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，系從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來的。當(dāng)瓊脂糖溶液加熱到沸點后冷卻凝固便會形成良好的電泳介質(zhì)，其密度是由瓊脂糖的濃度決定的。經(jīng)過化學(xué)修飾的低熔點(LMP)的瓊脂糖，在結(jié)構(gòu)上比較脆弱，由此在較低的溫度下便會熔化，可用于DNA片段的制備電泳。凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關(guān)(表2-1)。瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范因為0.2～50kb之間；而要分辨較小分子量的DNA片段，則要用聚丙烯酰胺凝膠，其分辨范圍為1個堿基對到1000個堿基對之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越強；反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。例如，20％的聚丙烯酰胺凝膠的分辨力可達(dá)1～6bpDNA小片段，而要分離1000bp的DNA片段，則要用3％的聚丙烯酰胺的凝膠。再如，2％的瓊脂糖凝膠可分辨小到300bp的雙鏈DNA分子，而對于較大片段的DNA，則要用低濃度(0.3％～1.0％)的瓊脂糖凝膠。在凝膠電泳中，加入溴化乙錠〔ethidiumbromide，簡稱EtBr〕染料對核酸分子染色之后，將電泳標(biāo)本放置在紫外光下觀察，便可以十分敏感而方便地檢測出凝膠介質(zhì)中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05μg的微量DNA也可以被清晰地檢測出來。溴化乙錠是一種具扁平分子的核酸染料，能插入到DNA或RNA分子的相鄰堿基之間，并在300nm波長的紫外光照射下發(fā)出熒光。在適當(dāng)?shù)娜旧珬l件下，熒光強度與DNA片段的大小（或數(shù)量）成正比。3.脈沖電場凝膠電泳根據(jù)表2-1所列的數(shù)據(jù)可以看到，隨著濃度的降低凝膠的孔徑也就相應(yīng)變大，故原則上講可用低濃度的瓊脂糖凝膠分離高分子量的DNA片段。但是實驗表明，即便是濃度為0.1％～0.2％的瓊脂糖凝膠，亦不能分離分子量大于750kb的DNA大分子，況且處于這種情況的凝膠十分脆弱，極難操作。然而我們知道，像大腸桿菌這樣的原核生物，其染色體基因組DNA的長度超過4000kb，再如哺乳動物主要組織相容性基因座(locus)所占的DNA長度亦達(dá)數(shù)千kb。由此可見，運用普通的凝膠電泳技術(shù)顯然是無法分離如此超大分子量的DNA分子的。1984年，D．C．Schwarts和C．R．Cantor發(fā)明的脈沖電場凝膠電泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis，簡稱PFGE)技術(shù)，可以成功地用來分離整條染色體這樣的超大分子量的DNA分子。在常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳中，超過一定大小范圍的所有的雙鏈DNA分子，都是按相同的速率遷移的。這是因為它們在單向恒定電場的作用下，僅以“一端向前”(end-on)的方式游動穿過整個膠板。而在脈沖電場中，DNA分子的遷移方向是隨著所用的電場方向的周期性變化而不斷改變的。在標(biāo)準(zhǔn)的PFGE中，頭一個脈沖的電場方向與核酸移動方向成45o夾角，而下一個脈沖的電場方向與核酸移動方向在另一側(cè)亦成45o夾角(圖2-3)。由于加壓在瓊脂糖凝膠上的電場方向、電流大小、及作用時間都在交替地變換著，這就使得DNA分子能夠隨時地調(diào)整其游動方向，以適應(yīng)凝膠孔隙的無規(guī)則變化。與分子量較小的DNA分子相比，較大分子量的DNA分子需要更多的次數(shù)來更換其構(gòu)型和方位，以使其可以按新的方向游動。因此，在瓊脂搪介質(zhì)中的遷移速率也就顯得更慢一些，從而達(dá)到了分離超大分子量DNA分子的目的。已報道，應(yīng)用脈沖電場凝膠電泳技術(shù)，可成功地分離到分子量高達(dá)107bp的DNA大分子。5.2.2核酸的分子雜交核酸分子雜交技術(shù)，是在1968年由華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院(CavnegieInstituteofWashington)的RoyBritten及其同事發(fā)明的。所依據(jù)的原理是，帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)，如果彼此退火的核酸來自不同的生物有機體，那么如此形成的雙鏈分子就叫做雜種核酸分子。能夠雜交形成雜種分子的不同來源的DNA分子，其親綠關(guān)系較為密切；反之，其親緣關(guān)系則比較疏遠(yuǎn)。因此，DNA／DNA的雜交作用，可以用來檢測特定生物有機體之間是否存在著親緣關(guān)系。而形成DNA／DNA或DNA／RNA雜種分子的這種能力，可以用來揭示核酸片段中某一特定基因的位置。這種核酸雜交技術(shù)，如同DNA快速分離法以及凝膠電泳技術(shù)一樣，都是分子生物學(xué)中DNA分析方法的基礎(chǔ)。在大多數(shù)的核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都是在雜交之前，通過毛細(xì)管作用或電導(dǎo)作用被轉(zhuǎn)移到濾漠上，而且是按其在凝膠中的位置原封不動地“吸印”上去的。常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜，疊氮苯氧甲基纖維素濾紙(DBM)和二乙氨基乙基纖維素濾膜(DEAE)等。之所以采用濾膜進(jìn)行核酸雜交，是因為它們易于操作，同時比脆弱的凝膠也容易保藏。一般來說，在核酸雜交中究競選用哪一種濾膜，這是由核酸的特殊性、分子大小和在雜交過程中所涉及的步驟的多寡、以及敏感性等參數(shù)來決定的。在早期。是比較喜歡選用硝酸纖維素濾膜，但由于它不能滯留小于150bp的DNA片段，又不能同RNA結(jié)合，所以在使用上受到一定的限制。1980年G．E．Smith等人發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用1mol/L的醋酸銨和0.2mol/L的NaOH緩沖液代替SSC緩沖液，改善了硝酸纖維素濾膜對小片段DNA的滯留能力。隨后P.S.Thomas(1983)報道，經(jīng)廣泛變性之后的RNA，也可十分容易地轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上去。J.C.Alwine等人(1977、1979)應(yīng)用DBM濾紙轉(zhuǎn)移和共價結(jié)合DNA和RNA。不久之后便有人發(fā)現(xiàn)，小片段DNA能夠轉(zhuǎn)移到這種濾紙上。其辦法是在通過毛細(xì)管作用或電導(dǎo)作用之前，小片段的DNA先在低濃度（＜4％）的聚丙烯酰胺凝膠上作分部分離。表2-2列舉了若干種用于核酸轉(zhuǎn)移和雜交的濾膜的主要性能。此種通常是在尼龍濾膜或硝酸纖維素濾膜上進(jìn)行的核酸分子雜交實驗，包括如下兩個不同的步驟：第一，將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上，這個過程特稱為核酸印跡(nucleicacidblotting)轉(zhuǎn)移，主要的有電泳凝膠核酸印跡法、斑點和狹線印跡法(dotandslotblotting)、菌落和噬菌斑印跡法(colonyandplaqueblotting)；第二是將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。所以有時也稱這類核酸雜交為印跡雜交。1.薩瑟恩DNA印跡雜交綜合凝膠電泳和核酸內(nèi)切限制酶分析的結(jié)果，便可以準(zhǔn)確地繪制出DNA分子的限制圖譜。但為了進(jìn)一步構(gòu)建出DNA分子的遺傳圖，或進(jìn)行目的基因的序列測定以滿足基因克隆的特殊要求，還必須掌握DNA分子中基因編碼區(qū)的大小和位置。有關(guān)這類的數(shù)據(jù)資料則要應(yīng)用薩瑟恩印跡雜交技術(shù)(Southernblotting)才能獲得。根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。由于它是由E.Southern于1975年首先設(shè)計出來的，故又叫做SouthernDNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。已經(jīng)觀察到，如果應(yīng)用硝酸纖維素濾膜進(jìn)行Southern印跡轉(zhuǎn)移，那么只要當(dāng)濾膜結(jié)合上DNA兩條互補鏈之一，便能夠成功地發(fā)生核酸的雜交作用。具體步驟是將作了DNA電泳分離的瓊脂糖凝膠，經(jīng)過堿變性等預(yù)處理之后平鋪在已用電泳緩沖液飽和了的兩張濾紙上，在凝膠上部覆蓋一張硝酸纖維素濾膜，接著加一疊干濾紙，最后再壓上一重物。這樣由于干濾紙的吸引作用，凝膠中的單鏈DNA便隨著電泳緩沖液一起轉(zhuǎn)移。這些DNA分子一旦同硝酸纖維素濾膜接觸，就會牢牢地縛結(jié)在它的上面，而且是嚴(yán)格地按照它們在凝膠中的譜帶模式，原祥地被吸印到濾膜上的。在80℃下烘烤1～2小時，DNA片段就會穩(wěn)定地固定在硝酸纖維素濾膜上。另一種辦法是應(yīng)用紫外線交聯(lián)法固定DNA。其基本原理是，DNA分子上的一小部分胸腺嘧啶殘基同尼龍膜表面上的帶正電荷的氨基基團之間形成交聯(lián)鍵(crosslinks)。然后將此濾膜移放在加有放射性同位素標(biāo)記探針的溶液中進(jìn)行核酸雜交。這些探針是同被吸印的DNA序列互補的RNA或單鏈DNA，一旦同濾膜上的單鏈DNA雜交之后，就很難再解鏈。因此，可以用漂洗法去掉游離的沒有雜交上的探針分子。用X光底片曝光后所得的放射自顯影圖片(圖2-4)，同溴化乙錠染色的凝膠譜帶作對照比較，便可鑒定出究竟哪一條限制片段是同探針的核苷酸序列同源的。薩瑟恩印跡雜交方法十分靈敏，在理想的條件下，應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記的特異性探針和放射自顯影技術(shù)，即便每條電泳條帶僅含有2ng的DNA也能被清晰地檢測出來，它幾乎可以同時用于構(gòu)建出DNA分子的酶切圖譜和遺傳圖，在分子生物學(xué)及基因克隆實驗中的應(yīng)用極為普遍。早期是使用硝酸纖維素濾膜進(jìn)行Southern印跡轉(zhuǎn)移，但它的主要缺點是容易碎裂，因而近年來常被尼龍濾膜所取代。后者不僅具有很強的抗張性易于操作，而且亦有更大的同核酸分子的結(jié)合能力。然而，為了消除尼龍膜所帶的正電荷，需要延長電泳凝膠的預(yù)處理時間。值得指出的是，在使用尼龍膜的情況下，DNA是以天然的形式，而不是變性的形式，從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到膜上的。因此，DNA是在尼龍膜上進(jìn)行原位堿變性的。2．諾塞恩RNA印跡雜交關(guān)于印跡雜交技術(shù)的應(yīng)用，最初只局限于DNA的轉(zhuǎn)移雜交，后來逐步擴展到包括RNA和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移雜交在內(nèi)的更加廣泛的領(lǐng)域。由于RNA分子不能夠同硝酸纖維素濾膜結(jié)合，所以薩瑟恩技術(shù)不能直接地應(yīng)用于RNA的吸印轉(zhuǎn)移。1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展出了一種新的方法，其基本步驟是將電泳凝膠中的RNA轉(zhuǎn)移到疊氮化的或其它化學(xué)修飾的活性濾紙上，通過共價交聯(lián)作用而使它們永久地結(jié)合在一起。由此可見，這種方法同薩瑟恩的DNA印跡雜交技術(shù)十分類似，所以叫做諾塞恩RNA吸印雜交技術(shù)(Norhernblotting)。而將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移并結(jié)合到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射同位素125I標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進(jìn)行反應(yīng)，這種技術(shù)叫做韋斯頓蛋白質(zhì)雜交技術(shù)(Westernblotting)。在諾塞恩RNA吸印雜交中，RNA分子同活性濾紙共價結(jié)合得十分牢固。所以，在雜種核酸分子呈不穩(wěn)定狀態(tài)的溫度條件下漂洗雜交濾紙，便可以將上次雜交反應(yīng)中已同RNA分子同源結(jié)合的放射性探針分子洗脫掉。因此，這類吸印轉(zhuǎn)移的濾紙，是可以反復(fù)使用的。應(yīng)當(dāng)指出，活性濾紙不光能夠同RNA分子牢固地結(jié)合，而目也能夠相當(dāng)有效地結(jié)合變性的DNA分子。事實上，疊氮化的活性濾紙，比硝酸纖維素濾膜能夠更加有效地轉(zhuǎn)移并結(jié)合小片段的DNA。l980年，P.S.Thomas發(fā)現(xiàn)，在適當(dāng)?shù)膶嶒灄l件下，硝酸纖維素濾膜也能夠直接用來轉(zhuǎn)移RNA分子。之后，人們還發(fā)展出可以用來轉(zhuǎn)移RNA的適用的尼龍濾膜。因為這種形式的諾塞恩吸印技術(shù)，已不需要預(yù)先制備活性濾紙，顯得簡單省事，所以得到廣泛的采用?，F(xiàn)在關(guān)于諾塞恩吸印轉(zhuǎn)移技術(shù)更全面的定義應(yīng)該是：將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其它化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實驗方法。3．斑點印跡雜交和狹線印跡雜交斑點印跡雜交(dotblotting)和狹線印跡雜交(slotblotting)，是在Southern印跡雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展的兩種類似的快速檢測特異核酸(DNA或RNA)分子的核酸雜交技術(shù)。它們的基本原理和操作步驟是相同的，都是通過抽真空的方式將加在多孔過濾進(jìn)樣器上的核酸樣品，直接轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)碾s交濾膜上，然后再按如同Southern或Northern印跡雜交一樣的方式同核酸探針分子進(jìn)行雜交。由于在實驗的加樣過程中，使用了特殊設(shè)計的加樣裝置，使眾多待測的核酸樣品能夠一次同步轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，并有規(guī)律地排列成點陣或線陣。因此，人們通常又稱此兩種核酸雜交方法分別為斑點印跡雜交和狹線印跡雜交。無論是斑點印跡雜交還是狹線印跡雜交，都更適用于核酸樣品的定量檢測，而不是定性檢測。例如，在實驗中補加有已知其濃度的靶核酸序列作為對照樣品的情況下，此類技術(shù)便可用來檢測核酸混合物中某種特殊DNA(或RNA)序列的相對含量；同時使用光密度測定法亦可對核酸斑點印跡或狹線印跡的相應(yīng)雜交信號作定量分析。已有許多研究者，都使用RNA斑點印跡雜交技術(shù)，測定目的基因在某種特定組織或培養(yǎng)細(xì)胞中的相對表達(dá)強度。實踐表明，它們在核酸定量測定中有著相當(dāng)廣泛的用途。4．菌落(或噬菌斑)雜交1975年，M．Grunstein和D．Hogness根據(jù)檢測重組體DNA分子的核酸雜交技術(shù)原理，對Southern吸印技術(shù)作了一些修改，發(fā)展出了一種菌落雜交技術(shù)。之后，在1977年，W．D．Benton和R．W．DNAvis又發(fā)展出了與此類似的篩選含有克隆DNA的噬菌斑的雜交技術(shù)。這類技術(shù)是把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，使溶菌變性的DNA同濾膜原位結(jié)合。這些帶有DNA印跡的濾膜烤干后，再與放射性同位素標(biāo)記的特異性DNA或RNA探針雜交。漂洗除去未雜交的探針，同X光底片一道曝光。根據(jù)放射自顯影所揭示的同探針序列具有同源性的DNA的印跡位置，對照原來的平板，便可以從中挑選出含有插入序列的菌落或噬菌斑(圖2-6)。菌落雜交或噬菌斑雜交有時也叫做原位雜交(insituhybridization)，因為生長在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑，是按照其原來的位置不變地轉(zhuǎn)移到濾膜上，并在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用。要從由成千上萬大量的菌落或噬菌斑組成的真核基因組克隆庫中，鑒定出含有期望的重組體分子的苗落或噬菌斑，菌落原位雜交技術(shù)有著特殊的應(yīng)用價值。這樣的實驗中往往要檢測大量的菌落或噬菌斑，可以想象其工作量是相當(dāng)大的。?

WesternblotWesternblot是轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到硝酸纖維薄膜上，以親和反應(yīng)或免疫反應(yīng)或結(jié)合反應(yīng)測定蛋白質(zhì)的技術(shù)。蛋白質(zhì)用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳并染色，然后，以電泳法或非電泳法進(jìn)行蛋白質(zhì)帶的轉(zhuǎn)移。電泳法的轉(zhuǎn)移效率和轉(zhuǎn)移速度都比較高，—般多用電泳法。轉(zhuǎn)膜裝置按如下順序進(jìn)行裝配：電極，一層吸收泡沫，三層濾紙，電泳后的凝膠，硝酸纖維薄膜，三層濾紙，一層吸收泡沫，電極。安裝前，每層材料均需用緩沖液浸透，并排除每層材料間的氣泡。所有材料放在磁盤中，加轉(zhuǎn)移緩沖液。如電冰凝膠為SDS，則轉(zhuǎn)移緩沖液為：20mmol／LTri堿，150mmol／L甘氨酸和20％甲醇。6～8V／cm，轉(zhuǎn)移16～22小時。如果凝膠中含尿素?zé)oSDS，僅用0.7％醋酸作轉(zhuǎn)移緩沖液即可，6～8V／cm，時間3～4小時(圖8.8)。5.2.3細(xì)菌轉(zhuǎn)化所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自另一種細(xì)菌菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫作供體菌株，接受轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫作受體菌株。細(xì)菌轉(zhuǎn)化常用低滲的氯化鈣溶液進(jìn)行。轉(zhuǎn)化反應(yīng)⑴感受態(tài)菌的制備（DH5α、JM109）整個過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，動作要溫柔、準(zhǔn)確，嚴(yán)格按無菌操作規(guī)程進(jìn)行。?

將-70℃凍存的JM109菌、DH5α菌在LB瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，37℃培養(yǎng)16~20小時。?

從平板中取出一環(huán)新鮮的菌落（2~3mm），移至含2ml（或4~5ml）LB培養(yǎng)基的15ml試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，約16~20小時。注意，LB中無Amp+，否則JM109菌或DH5α菌不能生長。?

取上述1ml菌液，加入到100mlLB液體培養(yǎng)基中（接菌濃度為1%），37℃，搖床（225r/min），強烈振蕩培養(yǎng)2~3小時，測定A600值為0.4~0.6時停止，使細(xì)胞的濃度達(dá)到5×107個/ml，此時細(xì)胞為對數(shù)生長期。注意，測定A600值取菌液時，要在無菌室超凈工作臺上進(jìn)行，避免細(xì)菌污染。?

無菌下，將菌液轉(zhuǎn)移至無菌的、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50ml離心管中，將培養(yǎng)物于冰上放置10min，使培養(yǎng)物冷卻至0℃。?

4000r/min，4℃，離心10min，回收沉淀。?

倒出上清液，將管倒置1min（無菌干燥的濾紙上），以使最后殘留的痕量培養(yǎng)物流盡。?

使用10ml用冰預(yù)冷的0.1MCaCl2溶液重懸每份細(xì)胞，放置于冰上20~30min。?

4000r/min，4℃，離心10min，回收細(xì)胞。?

倒出上清液，將管倒置1min（無菌干燥的濾紙上），以使最后殘留的痕量培養(yǎng)物流盡。每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0.1MCaCl2溶液重懸每份細(xì)胞。若不立即使用，可采用下述方法冷凍保存該感受態(tài)菌。取0.5ml無菌的、一次性使用的EP管，每管內(nèi)加入100μl感受態(tài)菌，再在每管內(nèi)加入100μl30~50%的甘油（甘油需濕熱滅菌），混勻后，放置于冰浴中15min，再放到-70℃冰箱中凍存?zhèn)溆?，?dāng)需要時將其從冰箱中取出，把管握在手心，使細(xì)胞快速融化，細(xì)胞一經(jīng)融化，立即把管轉(zhuǎn)移至冰浴中，在冰上放置10min。⑵轉(zhuǎn)化反應(yīng)

①從上述新制備的或凍存的感受態(tài)菌中，取6個EP管，四管加入已連接好的重組DNA5~10μl（體積≤10μl，DNA≤50ng），輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰水中放置30min。另兩個管不加重組DNA。②將管放在42℃水浴中90sec，不要搖動EP管。③快速將管轉(zhuǎn)至冰浴中2min，使細(xì)胞冷卻。④每份EP管加入350μlLB液體培養(yǎng)基，用水浴或溫箱將培養(yǎng)基加溫至37℃，或直接放在搖床上，225r/min，37℃，溫育1~2小時，使細(xì)胞復(fù)蘇。⑤涂平板（用LB固體培養(yǎng)基）⑥將平板涂好后半開蓋，在超凈臺上吹風(fēng)，直至液體被吸收。⑦倒置平板，37℃，溫育12~16小時后即可個觀察到有無重組子菌落。⑧若采用藍(lán)白篩選，則更利于直接觀察到有無重組子菌落，方法如下：T-載體（包括PUC系列）含有一個大腸桿菌DNA的短區(qū)段，其中含有β-半乳糖苷基因（LacZ）的調(diào)控序列和頭146個氨基酸的編碼信息（N端）。這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點，它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端，而不影響功能。這種載體適用于編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。雖然宿主和質(zhì)粒編碼的片段各自都沒有酶活性，但它們可以融為一體，形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，LacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酶陰性的突變體之間實現(xiàn)互補，這種互補現(xiàn)象叫作α互補。載體與宿主結(jié)合后可產(chǎn)生有活性的β-半乳糖苷酶，在底物中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）存在下，形成藍(lán)色菌落，而插入有目的基因的重組子菌落無此酶活性，故呈白色。所以選重組子菌落時挑選白色菌落。培養(yǎng)基中涂X-gal方法如下：A.在事先準(zhǔn)備好的含相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上（內(nèi)含100IU/ml的Amp+），已涼干。B.X-gal（20mg/ml）40μl與IPTG（200mg/ml）4μl,在0.5mlEP管中混合均勻，用Tip頭吸上，在培養(yǎng)皿幾個位點上滴幾滴，用涂布棒將X-gal與IPTG涂均勻，應(yīng)從中間開始向外緣涂布。C.涂均勻后培養(yǎng)皿半開蓋，關(guān)掉超凈臺上的紫外燈打開風(fēng)機，20min左右直至液體被吸收。D.將培養(yǎng)皿放在溫箱中，37℃，1小時。E.此平板即可用于上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)，挑選重組子菌落。若轉(zhuǎn)化完成后，陰陽對照正常，可進(jìn)行下一步的鑒定工作。5.2.4核苷酸序列分析核酸的序列分析，即核酸一級結(jié)構(gòu)的測定，是現(xiàn)代分子生物學(xué)中一項難度較大而重要的技術(shù)。1963年，Sanger和Thompson第一次完成了胰島素51個氨基酸的順序測定。1965年Ho11ey用經(jīng)典法測定了酵母tRNAala的75個核苷酸順序。同年，Sanger提出了指紋圖譜法測定小RNA序列。1975年，Sanger又提出了測定DNA序列的加減法，經(jīng)過2年的努力，排出了ΦXl74的5375bp序列。1977年，Maxam和Gilbert發(fā)展了化學(xué)直讀法；1978年，F(xiàn)iers，就用此法測出了SV40的5224bp序列。Sanger于l977年又創(chuàng)立了測定DNA序列的雙脫氧核苷酸(ddNTP)鏈終止法；不久，Messing等組建了一系列的噬菌體M13載體系統(tǒng)，為ddNTP鏈終止法提供了天然模板和萬能引物。因此，Messing的M13克隆系統(tǒng)與Sanger的ddNTP順序法相結(jié)合，成為較完整的測序系統(tǒng)，使DNA序列的測定工作提高到了一個嶄新的水平。DNA序列測定的ddNTP鏈終止法1ddNTP鏈終止法原理DNA的復(fù)制有4個基本條件，即：DNA聚合酶，單鏈DNA模板，帶有3'-OH末端的單鏈寡核苷酸引物，4種dNTP（DNATP，dCTP，dGTP，dTTP）。DNA聚合酶用模板作指導(dǎo)，不斷地將dNTP加到引物的3'-OH末端，使引物延伸，合成出新的互補DNA鏈。當(dāng)在低溫下進(jìn)行反應(yīng)時，新鏈的合成是不同步的，用聚丙烯酰胺凝膠電泳可以測出各種不同長度的DNA片段。DNA的兩個核苷酸之間是通過3',5'磷酸二酯鍵連接的。Sanger指出，如果能找到一種特殊核苷酸，其5'末端是正常的，在合成中，它能加到正常核苷酸的末端；但其3'-OH位點由于脫氧或取代，下一個核苷酸不能通過5'磷酸與之形成3',5'磷酸二酯鍵，使DNA鏈的延伸被終止在這個不正常的核苷酸處。這類核苷酸稱鏈終止劑(chain-terminator)。

鏈終止劑被找到了，如2'，3'-雙脫氧核苷5'-三磷酸(ddNTP)和3'-阿拉伯糖脫氧核苷酸。DNA順序測定中常用的終止劑是ddNTP。在DNA合成時，鏈終止劑以其正常的5'末端摻入生長的DNA鏈，一經(jīng)摻入，由于3'位無羥基存在，鏈的進(jìn)一步延伸被終止(圖9.1)。從圖9.1看出，當(dāng)加雙脫氧TTP(ddT)到4種核苷酸的正?；旌衔镏袝r，在與模板的A相對應(yīng)處，DNA聚合酶催化一個T加入。如果ddT被利用，則下一個核苷酸不能加上來；如果摻入的是dT，生長鏈仍可繼續(xù)延伸到下一個T的位置。在這里，聚合酶又面臨著兩種選擇：摻入ddT或摻入dT，因而，各種不同長度的DNA鏈就可被合成出來，并且它們的3'末端都被ddT終止。其他三種核苷酸鏈終止劑如dDNA，ddC，ddG也能以同樣的方式終止新生的DNA鏈。所以，如果用相同的4組引物-模板混合物，每一組加4種dNTP，其中1種用32P標(biāo)記，加1種ddNTP。每組將產(chǎn)生以一種特異性的ddNTP為末端的不同長度的核苷酸鏈。用PAGE電泳分離，即可讀出被測定的DNA的全部順序。2DNA鏈終止法測定系統(tǒng)有幾種系統(tǒng)可用于ddNTP鏈終止法的序列測定，如M13／ddNTP單鏈測定系統(tǒng)，pUC／pBluescript雙鏈測定系統(tǒng)，PCR銀染測定系統(tǒng)等。其中M13／ddNTP單鏈測定系統(tǒng)是最基本、最主要的程序，掌握了M13單鏈測定系統(tǒng)，對其他系統(tǒng)的理解也就容易了。(1)M13／ddNTP法單鏈測定系統(tǒng)①M13噬菌體載體M13載體系統(tǒng)是Messing等1977年構(gòu)建的，可以說是專門為Sanger的ddNTP鏈終止序列測定配套的載體，這個系統(tǒng)的載體有如下特點。M13系列中的載體都是成對的，如M13mp8和9，M13mpl0和11，M13mpl8和19等等。成對的M13載體有同樣的Polylinker，即限制位點的數(shù)目和排列順序相同，但方向相反。M13載體系列的編號與Polylinker的長短和限制位點數(shù)有關(guān)，編號從小到大，則Polylinker愈長，所含限制位點愈多，用途愈廣。相對應(yīng)的載體在序列測定中的用途不同，雙號載體(M13mp8，M13mp10，M13mp18)用于克隆負(fù)鏈，單號載體(M13mp9，M13mp11，M13mp19)用于克隆正鏈。由于它們的引物位點區(qū)是固定的，所以前者用于測定DNA的正鏈，后者用于測定DNA的負(fù)鏈。②外源DNA片段在M13載體中的克隆Messing和Viera(1982)構(gòu)建的一對新的M13mp8和M13mp9載體是專門用于定向克隆戰(zhàn)略，以便測定DNA全序列的，它們具有同樣的限制性酶切位點和順序，但方向正好相反，即EcoRI，XmaI，BamHI，HindII，SalI，PstI，HindIII。那么同一個外源片段如何與成對的M13載體DNA連接?連接方法是比較簡單的，但理解是不容易的。M13克隆一般均需采用雙酶消化——定向克隆法，若用BamHI和SalI消化待測DNA，得到不同長度的小片段，大部分片段都有BamHI和SalI兩個粘性末端，再以BamHI和SalI分別混合消化這一對載體，并同已消化的待測DNA片段連接，插入片段與M13mp8和M13mp9的克隆方式見圖9.2。從圖9.2看出，在DNA片段與M13mp9復(fù)制型克隆時，片段按照下式方向插入，從噬菌體顆?？煞蛛x5'SalI====BamHI3'克隆了正鏈的單鏈M13mp9模板，在這個載體的EcoRI位點附近有一個正向的引物結(jié)合位點，經(jīng)與引物融合后，DNA聚合酶沿5'→3'方向，以此插入的正鏈為模板合成新的負(fù)鏈，故以M13mp9為載體，測定的是此DNA的負(fù)鏈的順序，閱讀方向是從5'→3'。如以M13mp8為載體，同樣用BamHI和SalI消化，則上述片段將按5'BamHI====SalI5'的方向插入，因而，從噬菌體顆?？煞蛛x出克隆了負(fù)鏈的單鏈Ml3mp8模板。通俗地說，這種插入，需要打個筋斗再翻個身才能實現(xiàn)。這兩個載體的引物位點是相同的，因此新生鏈的合成方向仍然是5'→3'，DNA聚合酶以此插入的負(fù)鏈為模板合成新的正鏈，閱讀方向是從正鏈的5'→3'，將測定結(jié)果換成對應(yīng)的互補堿基，即可得到負(fù)鏈3'末端的順序。

所以，以M13mp8為載體，在放射自顯影圖譜上核苷酸順序的閱讀是其互補堿基的3'→5'方向。于是，從待測DNA(負(fù)鏈)的3'，5'兩端閱讀，一個大的DNA片段的順序即可全部測出。③M13-ddNTP鏈終止法的程序設(shè)計9.5DNA序列的激光測定法應(yīng)用生物系統(tǒng)（AppliedBiosystems）公司1987年推出—種快速、準(zhǔn)確的自動測定DNA序列的新方法——激光測定法。這種方法是在ddNTP鏈終止法的基礎(chǔ)上的進(jìn)一步發(fā)展，但卻具有ddNTP鏈終止法無可比擬的優(yōu)點。激光法的關(guān)鍵措施是合成四種不同的熒光染料，分別和引物結(jié)合起來，以與ddNTP鏈終止法相同的方式，在4種dNTP、一種ddNTP存在下，用E.coliDNApolI進(jìn)行新鏈的合成。在4個反應(yīng)管中，新合成的不同長度的片段以加入的那個ddNTP而終止。當(dāng)每一個片段變性脫離模板后，在與新鏈相連的引物上都帶有自己特異的熒光染料(圖9.24)。在DNA合成之后，將4個反應(yīng)管的產(chǎn)物混合在一起，加在PAG的—個點樣槽里，電泳。所有染料-DNA片段之間的大小僅相差一個核苷酸，它們按大小不同向下泳動。發(fā)射儀產(chǎn)生的激光(1aser)在凝膠底部的固定位置掃描，當(dāng)帶有染料的片段泳動到這里時，受到激光的激發(fā)，產(chǎn)生熒光。熒光通過一個裝有4個濾光片的轉(zhuǎn)盤，到達(dá)光電測定管，發(fā)出信號，輸入到計算機里去，帶有染料的片段一個一個的按大小向下泳動，激光不斷的掃描、激發(fā)，計算機就能自動地讀出這個DNA的全部核苷酸序列(圖9.25)。激光測定法的優(yōu)點是很明顯的。(1)高負(fù)荷：激光測定法的4個反應(yīng)管的產(chǎn)物只需加在一個凝膠樣品槽，而不是像ddNTP鏈終止法那樣用4個樣品槽。因此，在一塊凝膠上可以同時測定16個樣品，極大地增加了激光測定的負(fù)荷。(2)直接測定：激光法通過鐳射激發(fā)4種不同的染料發(fā)射出熒光，而直接讀出A、C、G、T4種核苷酸。電泳結(jié)束，測定也就結(jié)束了。不需要像傳統(tǒng)法那樣用X光片的放射自顯影。安全：激光法不使用放射性同位素，序列分析的傳統(tǒng)方法所不具備的最大優(yōu)點。(4)迅速：從上樣到電泳結(jié)束，僅需8～10小時，就可得出與ddNTP鏈終止法同樣的結(jié)果。(5)簡單：避免了ddNTP鏈終止法的許多繁瑣程序如多次加樣，梯度凝膠、寬凝膠等等?？傊す夥烧f是現(xiàn)代測定DNA序列的最先進(jìn)方法。由于它是最近才提出的，估計國內(nèi)應(yīng)用不廣，這里只是作為一個新信息予以介紹，以饗讀者。5.2.6DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究1.凝膠阻滯試驗?zāi)z阻滯試驗(gelretarDNAtionassay)，又叫做DNA遷移率變動試驗(DNAmobilityshtftassay)，是在80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝放電泳技術(shù)。它具有簡單、快捷等優(yōu)點，也是當(dāng)前被選作分離純化特定DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的一種典型的實驗方法。凝膠阻滯試驗的原理比較簡單。我們知道在凝放電泳中，由于電場的作用，裸露的DNA朝正電極移動的距離是同其分子量的對數(shù)成反比，如果DNA分子結(jié)合上一種蛋白質(zhì)，那么由于分子量加大在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯，朝正電極移動的距離也就相應(yīng)縮短了。所以當(dāng)特定的DNA片段同細(xì)胞提取物混合之后，若其在凝膠電泳中的移動距離變小了，這就說明它已同提取物中的某種特殊蛋白質(zhì)分子發(fā)生了結(jié)合作用(圖2-41)。在凝膠阻滯試驗中，首先是用放射性同位素標(biāo)記待檢測的DNA片段(亦稱探針DNA)，然后同細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物一道溫育，于是便有可能形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。將它加樣到非變性的聚丙烯酰胺凝膠中，在控制使蛋白質(zhì)仍與DNA保持結(jié)合狀態(tài)的條件下進(jìn)行電泳分離，并應(yīng)用放射自顯影技術(shù)顯現(xiàn)具放射性標(biāo)記的DNA條帶位置。如果細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物中不存在可同放射性標(biāo)記的探針DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，那么所有放射性標(biāo)記都將集中出現(xiàn)在凝膠的底部，反之，將會形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，由于凝膠阻滯的緣故，其特有的放射性標(biāo)記的探針DNA條帶就將滯后出現(xiàn)在較靠近凝膠頂部的位置。所以在有的文獻(xiàn)中也稱這種試驗為條帶阻滯試驗(bandretarDNAtionassay)。?凝膠阻滯試驗不僅可以用來鑒定在特殊類型細(xì)胞的提取物中，是否存在著能夠同某一特定DNA片段結(jié)合的蛋白質(zhì)分子(比如特異的轉(zhuǎn)錄因子等)，而且還可以用來研究發(fā)生此種結(jié)合作用之精確的DNA序列的特異性。其辦法是在DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)體系中，加入超量的非標(biāo)記的競爭DNA(competitorDNA)。如果它與同位素標(biāo)記的探針DNA結(jié)合的是同一種蛋白質(zhì)，那么由于競爭DNA與探針DNA相比是極大超量的，這樣絕大部分蛋白質(zhì)都會被其競爭結(jié)合掉而使探針DNA仍處于自由的狀態(tài)，所以在電泳凝膠的放射自顯影圖片上就不會出現(xiàn)