第七章外源基因在真核細胞中的表達與調(diào)控

第七章外源基因在真核細胞中的表達與調(diào)控基因重組得主要目得就是要使目得基因在某一細胞中能得到高效表達,即產(chǎn)生人們所需要得高產(chǎn)目得基因產(chǎn)物,如蛋白質(zhì)、多肽類生物藥物?；蚬こ碳夹g(shù)得核心就是基因表達技術(shù)?；虮磉_就是指結(jié)構(gòu)基因在調(diào)控序列得作用下轉(zhuǎn)錄成mRNA,經(jīng)加工后在核糖體得協(xié)助下又轉(zhuǎn)譯出相應(yīng)得基因產(chǎn)物——蛋白質(zhì),再在受體細胞環(huán)境中經(jīng)修飾而顯示出相應(yīng)得功能。從基因到有功能得產(chǎn)物這整個轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯及所有得加工過程就就是基因表達得過程,她就是在一系列酶和調(diào)控序列得共同作用下完成得。一、概述(一)幾個重要得概念1、表達系統(tǒng)(geneexpressionsystem):基因工程中用來獲得有功能得異源蛋白質(zhì)得體系,包括表達載體得構(gòu)建、受體細胞得建立及表達產(chǎn)物得分離、純化。2、據(jù)受體細胞得不同可分為:1)原核表達系統(tǒng):將外源基因引入原核細胞,并使其在原核細胞中以發(fā)酵形式快速高效地表達、合成基因產(chǎn)物得體系。2)真核表達系統(tǒng):

使外源基因在真核細胞中表達得體系。(二)原核表達系統(tǒng)得局限性

1、缺乏翻譯后加工修飾系統(tǒng),不能進行糖基化、甲基化得修飾,影響某些蛋白得活性。2、在原核細胞中表達得真核蛋白不穩(wěn)定,易被細菌蛋白酶降解。3、很難實現(xiàn)真正得分泌出胞,其產(chǎn)量很低,而且容易出現(xiàn)信號肽不被切割,或不在特異位置上切割。4、表達產(chǎn)物常以包涵體(防止蛋白酶得水解)得形式存在,后期需要經(jīng)過變性(鹽酸胍或尿素)復(fù)性(二硫蘇糖醇、巰基乙醇等還原劑),并且復(fù)性效率低。5、內(nèi)毒素得污染真核基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜龐大:形成復(fù)雜得染色質(zhì)或者染色體基因不連續(xù)性:內(nèi)含子、外顯子3、含有大量得重復(fù)序列:低度、中度或高度4、存在許多基因家族(有一定同源性而又不完全相同得基因簇):如珠蛋白基因家族、ras基因家族等。5、沒有原核細胞得操縱子,不產(chǎn)生多順反子mRNA:即一個編碼基因轉(zhuǎn)錄生成一個mRNA分子,經(jīng)翻譯生成一條多肽鏈(單順反子mRNA)。6、基因表達調(diào)控復(fù)雜(三)真核基因組結(jié)構(gòu)特點(a)原核生物mRNA為多順反子(b)真核生物mRNA為單順反子9大家應(yīng)該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流(四)真核基因表達調(diào)控特點——多方面、多層次1、轉(zhuǎn)錄前(基因組水平)調(diào)控:基因結(jié)構(gòu)改變,持久且不可逆2、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控:3、轉(zhuǎn)錄后修飾:4、翻譯水平得調(diào)控:5、翻譯后修飾:轉(zhuǎn)錄前調(diào)控1、基因丟失:目前認為這種調(diào)節(jié)方式主要就是在較低等得真核生物中。2、基因擴增:就是指某些基因得拷貝數(shù)專一性大量增加得現(xiàn)象。3、基因重排:就是指某些基因片段改變原來存在得順序而重新排列組合。4、甲基化修飾:DNA甲基化就是一種重要得基因組表觀遺傳修飾,參與調(diào)控許多細胞過程,包括胚胎發(fā)育、轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、X染色體失活、基因組印跡以及染色體穩(wěn)定性。5、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對基因表達得調(diào)控:細胞分裂時松開分散在核內(nèi)得染色質(zhì)稱為常染色質(zhì),常染色質(zhì)得基因可以轉(zhuǎn)錄。染色體中得某些區(qū)段到分裂期后,仍保持緊湊折疊得結(jié)構(gòu),在間期核中可以看到其濃集得斑塊,稱為異染色質(zhì),基因不能轉(zhuǎn)錄表達。轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控1、RNA聚合酶:I,II,III2、順式調(diào)控因子(cis-actingfactor)3、反式作用因子(trans-actingfactor)酶主要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA聚合酶ⅠrRNA,大多數(shù)snRNARNA聚合酶ⅡmRNA前體,部分snRNARNA聚合酶ⅢtRNA、部分snRNA

真核細胞中RNA聚合酶得種類順式調(diào)控因子順式調(diào)控因子(cis-actingfactor):就是與結(jié)構(gòu)基因串連得、對基因轉(zhuǎn)錄得精確起始和轉(zhuǎn)錄活性具重要調(diào)控作用得特定DNA序列。包括正性調(diào)控元件(啟動子、增強子)和負性調(diào)控元件(沉寂子、加尾和轉(zhuǎn)錄終止信號)啟動子啟動子(Promoter):位于基因得5'端與基因轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)得核苷酸序列。一般包括轉(zhuǎn)錄起始點及其上游100-200bp序列作用特點:近距離作用、具有方向性、空間位置較恒定分類:核心啟動子元件(轉(zhuǎn)錄起始點上游-30bp區(qū)得TATA-box):決定基因轉(zhuǎn)錄精確起始。上游啟動子元件(包括:-70至-80bp區(qū)域得CAAT盒及其兩側(cè)得GC盒):協(xié)同決定轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)效率。組織特異性元件:如肝細胞特異性啟動子元件HP1,與白蛋白、AFP等基因在肝細胞中得特異性表達有關(guān)。誘導(dǎo)性啟動子元件:如cAMP反應(yīng)元件(CRE),介導(dǎo)對cAMP、生長因子等信號得反應(yīng)。啟動子結(jié)構(gòu)模式圖

SP1NF1

SP1TBP表－1哺乳類RNA聚合酶Ⅱ啟動子中

常見得元件元件名稱共同序列結(jié)合得蛋白因子名稱分子量DNA長度TATATATAAATFIID30,000～10bpGCGGGCGGSP-1105,000～20bpCAATGGCCAATCTCTF/NF160,000～22bpkBGGGACTTTCCNFkB44,000～10bpATFGTGACGTATF?~20bpOctaneATTTGCATOct-176,000～10bp增強子增強子(Enhancer):就是一類本身不具備啟動子活性但能夠促進轉(zhuǎn)錄活性得順式調(diào)控元件。構(gòu)成:由單拷貝或多拷貝組件串連構(gòu)成,長100-200bp,核心組件8-12bp。作用特點:遠距離作用無方向性有啟動子依賴性,但對啟動子無嚴格專一性,因而無基因特異性。組織特異性相位性負性調(diào)控元件沉寂子(silencer)或衰減子(dehancer):就是一類抑制基因轉(zhuǎn)錄得順式調(diào)控元件,作用方式同增強子。轉(zhuǎn)錄終止信號:加尾信號:AATAA,polyA上游10-20bpG/T簇:能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)得反向重復(fù)序列反式作用因子反式作用因子(Trans-actingfactor):由位于不同或相同染色體上相距較遠得基因所編碼得蛋白質(zhì)因子,通過與順式調(diào)控元件和RNA聚合酶得相互作用而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性。轉(zhuǎn)錄信號1PTrans-actingfactorTrans-actingfactor(DNA結(jié)合蛋白)Cis-actingfactorAgenemRNAofAProteinABgenemRNAofBProteinB反式作用因子可以分為3類:(1)普通轉(zhuǎn)錄因子(通用轉(zhuǎn)錄因子):主要識別啟動子得核心啟動成分,如TATA盒結(jié)合因子TFIID;(2)組織特異性轉(zhuǎn)錄因子:就是特殊組織與細胞中得反式作用因子,如淋巴細胞中得Oct-2;(3)誘導(dǎo)性反式作用因子:與反應(yīng)性元件(responseelements)相結(jié)合得反式作用因子。如HSRE(熱休克反應(yīng)元件,heatshockresponseelement)GRE(糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件,glucocorticoidresponseelement)CRE(cAMP反應(yīng)元件,cAMPresponseelement)

反式作用因子得結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合域轉(zhuǎn)錄激活域TF富含谷氨酰胺結(jié)構(gòu)域酸性α-螺旋結(jié)構(gòu)域富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域同源結(jié)構(gòu)域鋅指結(jié)構(gòu)域亮氨酸拉鏈螺旋-環(huán)-螺旋螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋螺旋轉(zhuǎn)角螺旋鋅指結(jié)構(gòu)亮氨基拉鏈螺旋環(huán)螺旋同源結(jié)構(gòu)域SP1OCT-2AP-1myc1、RNA加工成熟:無論就是rRNA、tRNA、mRNA,轉(zhuǎn)錄后都必須經(jīng)過加工,才能成為有功能得分子。rRNA:前體就是45S,成熟得rRNA就是18S、28S、5、8S,還要經(jīng)過化學(xué)修飾--核糖甲基化。tRNA:首先經(jīng)過核苷得修飾,生成4、5S前體tRNA,再剪接成為成熟得tRNA。mRNA:5’加帽子,3’加poly(A),還要經(jīng)過剪接以及核苷酸得甲基化修飾。轉(zhuǎn)錄后水平得調(diào)控真核生物得基因可以分為兩大類:一類就是簡單得轉(zhuǎn)錄單位;另一類就是復(fù)雜轉(zhuǎn)錄單位。轉(zhuǎn)錄后加工方式就是不同得。(1)簡單轉(zhuǎn)錄單位:編碼產(chǎn)生一個多肽,轉(zhuǎn)錄后加工有3種形式。a、基因沒有內(nèi)含子,轉(zhuǎn)錄后無需加工,也沒有poly(A),如組蛋白基因。b、沒有內(nèi)含子,無需剪切,但需要加poly(A)尾,如α-干擾素基因。c、有內(nèi)含子,需要加工,及加poly(A)尾,但她們只產(chǎn)生一個有功能得mRNA,如ɑ,β-珠蛋白基因。2、轉(zhuǎn)錄后加工得多樣性初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可通過不同得方式加工成兩個或兩個以上得mRNA。a、利用多個轉(zhuǎn)錄起始點或剪接位點產(chǎn)生不同得蛋白質(zhì)。b、利用多個加多聚(A)位點和不同得剪切方式產(chǎn)生不同得蛋白質(zhì)。c、雖無剪接,但有多個轉(zhuǎn)錄起始位點或加poly(A)位點。

(2)復(fù)雜轉(zhuǎn)錄單位利用多個轉(zhuǎn)錄起始點或剪接位點產(chǎn)生不同得蛋白質(zhì)利用多個加多聚(A)位點和不同得剪切方式產(chǎn)生不同得蛋白質(zhì)雖無剪接,但有多個轉(zhuǎn)錄起始位點或加poly(A)位點翻譯水平得調(diào)控對可溶性蛋白質(zhì)因子得修飾:如eIF-2磷酸化后可抑制蛋白質(zhì)得合成。對mRNA穩(wěn)定性得調(diào)節(jié)反義RNA對翻譯得調(diào)控作用反義RNA(anti-sense):一段含有與被調(diào)控基因所產(chǎn)生mRNA互補得堿基序列得小分子RNA。①與mRNA結(jié)合,形成雙鏈RNA。影響mRNA得模板效率;②可能參與mRNA得拼接。1、多肽得切割:切去前端得信號肽2、多肽得有限水解:蛋白質(zhì)(酶原)必須經(jīng)過有限得酶和化學(xué)水解才能變成有活性得物質(zhì)。3、多肽得化學(xué)修飾:蛋白質(zhì)磷酸化、糖基化(糖蛋白)、乙?；?。4、多肽得剪接:多肽被剪接成數(shù)個片段,再以一定得順序結(jié)合起來,形成有活性得蛋白質(zhì)。翻譯后得調(diào)控二、真核表達系統(tǒng)真核表達系統(tǒng)(Eukaryoticexpressionsystem):指在真核細胞中表達外源基因得體系。

組成:真核表達載體受體細胞基因轉(zhuǎn)移方式(一)真核表達系統(tǒng)得必要性和優(yōu)勢1、具有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng):剪除內(nèi)含子2、具有完善得翻譯后加工系統(tǒng):對表達蛋白進行修飾,具有天然構(gòu)型。3、可實現(xiàn)分泌表達:將表達產(chǎn)物分泌至細胞外培養(yǎng)液,簡化了純化工藝。4、有助于深入了解真核基因表達調(diào)控機制,實現(xiàn)基因治療。(二)真核表達載體真核表達載體:適用于在真核細胞中表達外源基因得載體。真核載體根據(jù)受體不同,可分為:酵母表達載體、哺乳動物表達載體、昆蟲桿狀病毒表達載體。

真核表達載體包括在大腸桿菌中起作用得復(fù)制起始位點、抗生素抗性基因、多克隆位點等。真核表達載體中還具有:①真核表達調(diào)控元件:包括啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止序列、polyA加尾信號等②真核細胞復(fù)制起始序列③真核細胞藥物抗性基因真核表達載體帶有得polyA加尾信號可保證新轉(zhuǎn)錄得mRNA能有效地加上polyA。真核表達載體得基本組成

OriPro:原核復(fù)制起始序列;P:啟動子;MCS:多克隆位點;TT:轉(zhuǎn)錄終止序列;orieuk:真核復(fù)制起始序列。注:不就是所有真核表達載體都有整合序列PolyA(三)真核表達系統(tǒng)1、酵母表達系統(tǒng):利用酵母表達載體,在酵母細胞中表達外源基因2、哺乳動物細胞表達系統(tǒng):利用重組質(zhì)?；虿《据d體,在哺乳動物細胞內(nèi)表達外源基因3、昆蟲細胞表達系統(tǒng):利用昆蟲桿狀病毒表達載體,在昆蟲細胞內(nèi)表達外源基因

酵母表達系統(tǒng)

特點及優(yōu)勢

酵母菌就是單細胞真核生物,其遺傳背景清楚培養(yǎng)簡單,生長周期短,經(jīng)濟生物安全性高可分泌表達,簡化純化工藝(一)酵母載體在酵母細胞中復(fù)制、擴增和表達得載體,包括克隆載體和表達載體。主要組成元件:篩選標記:如抗生素抗性基因Zeocin(博來霉素,屬于爭光霉素家族得成員)營養(yǎng)缺陷標記基因Leu(β異丙基蘋果酸脫氫酶,參與丙酮酸向亮氨酸得轉(zhuǎn)化)

Leu-作為酵母載體得選擇標記基因用于酵母載體中得調(diào)控序列ARS(AutoReplicationSequence):自主復(fù)制序列,為酵母復(fù)制起始區(qū)(點)。2μM質(zhì)粒:酵母核質(zhì)中得小得環(huán)狀DNA,可以獨立復(fù)制并轉(zhuǎn)錄。酵母啟動子:常用得有GAP(3-磷酸甘油醛脫氫酶)、AOX1(醇氧化酶-1)、ADH(乙醇脫氫酶)、SUC(蔗糖酶)、PGK(磷酸甘油酸激酶)、Apase(堿性磷酸酶)啟動子。酵母著絲粒區(qū)段(CEN):增加轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性。酵母載體得種類酵母克隆載體:不含酵母啟動子,不能在酵母中表達外源基因,如YIP、YRP、YEP酵母表達載體:酵母克隆載體+酵母啟動子,若引入信號肽序列,則成為分泌型載體YAC:酵母人工染色體(yeastartificialchromosome)可插入200～800kb得外源基因片段,因而特別適合高等真核生物基因組得克隆與表達研究。1、YIp(酵母整合型質(zhì)粒):細菌質(zhì)粒DNA+酵母遺傳標記,通過同源重組整合入酵母染色體,轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定,但轉(zhuǎn)化率極低。2、YRp(酵母復(fù)制型質(zhì)粒):細菌質(zhì)粒DNA+酵母遺傳標記(YIp)+酵母復(fù)制序列(ARS),可自主復(fù)制,但穩(wěn)定性差。3、YEp(酵母附加子型質(zhì)粒):細菌質(zhì)粒DNA+酵母標記基因(YIp)+酵母2μM質(zhì)粒,游離于核外存在并自主復(fù)制。I、酵母克隆載體酵母克隆載體得構(gòu)建II、酵母表達載體含酵母啟動子穿梭載體(shuttlevector):既可以攜帶外源基因在原核細胞中復(fù)制增殖,又可以在真核細胞中表達外源基因得載體。種類:釀酒酵母表達載體畢赤酵母表達載體分泌型表達載體:引入酵母得信號肽基因,如因子信號肽釀酒酵母表達載體Leu2編碼β異丙基蘋果酸脫氫酶,作為篩選標記。帶有此質(zhì)粒得酵母菌在不含有亮氨酸得培養(yǎng)基中能生長。畢赤酵母表達載體整合型HIS4編碼組氨醇脫氫酶基因,作為篩選標記。HIS4區(qū)得整合方式為位點特異性單交換引起得基因插入,整合后使營養(yǎng)缺陷型宿主恢復(fù)野生型,在不含組氨酸得培養(yǎng)基上能生長。5‘AOX1啟動子片段含有AOX1啟動子,在甲醇得誘導(dǎo)下可啟動外源蛋白得表達;α-因子信號肽序列為約89個氨基酸得信號肽序列,能使外源蛋白分泌到發(fā)酵上清中,更利于外源蛋白得純化;多克隆位點含多個酶切位點,為外源基因得插入提供位點;TT序列提供有效得轉(zhuǎn)錄終止和polyA修飾信號;HIS4為營養(yǎng)缺陷型篩選標志;3‘AOX1基因片段能夠與基因組AOX1基因?qū)偻粗亟M;抗Amp基因和pBR322能使空載體和構(gòu)建得表達載體在E、coli中篩選和復(fù)制。以應(yīng)用于畢赤酵母表達系統(tǒng)得pPIC9載體為例解釋載體得構(gòu)件畢赤酵母分泌型表達載體啟動外源基因得啟動子:PGAPPTEF1PEMT,MCS:多克隆位點鑒定得標記:6╳His,myc、終止子:AOX1TT,CYC1TT抗生素篩選標記:zeocin、復(fù)制起始位點:pUCoriIII、酵母人工染色體(YAC)YAC:利用酵母得著絲粒序列(CEN)、酵母復(fù)制起始區(qū)(ARS)及端粒重復(fù)序列(TEL)構(gòu)建得人工染色體結(jié)構(gòu):左臂:TEL、選擇標記、ARS、CEN右臂:TEL、選擇標記特點:容量大(200-800kb),穩(wěn)定性差作用:構(gòu)建基因組文庫

YAC載體中最常用得就是pYAC4篩選標記:His3:組氨酸合成缺陷性標記URA3:尿嘧啶合成缺陷性標記SUP4:赭石突變(ade2-1)抑制基因sup4(二)受體細胞1、釀酒酵母:她具有作為宿主菌必須具備得許多條件,就是最早應(yīng)用于外源基因克隆和表達得酵母菌。目前已表達了諸如乙型肝炎疫苗、人胰島素、人粒細胞集落刺激因子等多種外源基因產(chǎn)物。其缺點就是在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生乙醇,影響酵母得生長代謝和基因產(chǎn)物得表達。此外,釀酒酵母在蛋白質(zhì)得加工過程中會發(fā)生過度糖基化作用,其分泌表達能力也有待提高。表1-3在釀酒酵母中表達得重組蛋白種類名稱疫苗乙肝病毒表面抗原,瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白,HIV－1外殼蛋白診斷試劑丙肝病毒蛋白,HIV－1抗原人類治療用蛋白藥物上皮生長因子,胰島素,類胰島素生長因子,血小板源生長因子,胰島素前體,成纖細胞生長因子,集落刺激因子,α1抗胰蛋白酶,凝血因子XⅢa2、畢赤酵母:新發(fā)展得酵母受體細胞高表達(12mg/L):AOX1啟動子或GAP啟動子高穩(wěn)定性:載體為整合型高分泌(10mg/L):因子信號肽基因

在畢赤酵母中得到表達得重組異源蛋白有乙型肝炎表面抗原、人腫瘤壞死因子、人表皮生長因子、鏈激酶等幾十種。畢赤酵母得分泌表達能力比釀酒酵母強,但對其遺傳背景了解還比較少,且發(fā)酵周期也比較長。(三)轉(zhuǎn)化①鋰鹽法;②PEG法;③原生質(zhì)球法;④電穿孔法。

電穿孔法:效率較高,應(yīng)用最廣整合型載體轉(zhuǎn)化前要酶切線性化(四)外源基因在酵母菌中得表達1、胞內(nèi)表達:直接表達外源基因

2、分泌表達:在MCS前加入信號肽序列pGAPZ,利用因子分泌表達人Endostatin基因得克隆、表達中國人胎肝總RNAEndostatincDNApGEM-T載體T-A克隆RT-PCR重組endostatin克隆載體pGAPZaA載體重組endostatin表達載體電轉(zhuǎn)化GS115畢赤酵母菌ZeocinSDS陽性重組子重組Endostatin得初步純化與抑制作用研究陽性重組子大量擴增、表達endostatin蛋白培養(yǎng)上清超濾濃縮SepharoseG25去鹽Heparin親和層析初步純化得重組endostatin蛋白濃縮液透析抑制作用研究體外作用ECV304細胞HepG2、2、15細胞體內(nèi)作用裸鼠人肝癌模型兔角膜新生血管(五)高表達得策略1、利用誘導(dǎo)型強啟動子2、提高整合拷貝數(shù)3、控制蛋白酶降解活性4、分泌表達(六)缺點不能實現(xiàn)全部得翻譯后修飾功能哺乳動物細胞表達系統(tǒng)優(yōu)點進行完全得翻譯后修飾可表達產(chǎn)生有功能得膜蛋白用途:表達大量得外源蛋白研究基因得功能基因治療有效選擇轉(zhuǎn)化細胞,要求載體具備明顯得標記基因(一)幾種常用得哺乳動物表達系統(tǒng)得選擇標記基因1、胸苷激酶(tk)基因2、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因3、新霉素抗性基因(neo)、4、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因檢測系統(tǒng)5、黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)基因1、胸苷激酶(tk)基因胸腺嘧啶核苷激酶簡稱胸苷激酶(thymidineKinase,TK)在所有真核細胞中都有表達,就是嘧啶生物合成補救代謝途徑中得一個關(guān)鍵酶,她可催化胸苷磷酸化轉(zhuǎn)變成為dTMP,繼續(xù)磷酸化生成dTTP,參與DNA得生物合成。tk+細胞中:胸苷(T)→胸苷-磷酸→TTP二氫葉酸二氫葉酸還原酶

四氫葉酸

TTPdCTPdATP

氨基喋呤(Aminopterin)

tk阻斷補加次黃嘌呤(H)死亡存活補救合成胸苷激酶(tk)基因HAT選擇法原理攜帶外源基因得載體連接有tk基因,可以表達胸苷激酶以tk－細胞為受體細胞在HAT(次黃嘌呤－氨基喋呤－胸苷)選擇培養(yǎng)基中,只有外源基因轉(zhuǎn)化成功得tk+細胞存活,tk-細胞死亡則陽性重組子在HAT中篩選出來2、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因二氫葉酸二氫葉酸還原酶

四氫葉酸

TTPdCTPdATP氨基蝶呤氨甲喋呤阻斷二氫葉酸還原酶基因篩選法原理

攜帶外源基因得載體連接有dhfr基因,可以表達二氫葉酸還原酶以dhfr-細胞為受體:CHO細胞dhfr-細胞無法在普通培養(yǎng)基中存活,而轉(zhuǎn)化入dhfr基因后可以存活,并表達外源基因。若在培養(yǎng)基內(nèi)加入氨甲蝶呤,進行加壓篩選,可以提高外源基因表達量。3、新霉素抗性基因(neo)新霉素得類似物G418(gentamycin)對原核、真核細胞均有毒性。攜帶外源基因得載體連接有neo基因,neo編碼得磷酸轉(zhuǎn)移酶可滅活G418,因而,只有轉(zhuǎn)化入neo基因得細胞才能夠在含有G418得培養(yǎng)基中存活。此種篩選方法要求載體攜帶neo基因,而對受體細胞無要求,應(yīng)用更為簡便。4、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因檢測系統(tǒng)

氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Cat)就是由大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn9編碼得。Cat可催化氯霉素發(fā)生乙?；饔?使其實去活性。雖然真核細胞不含有內(nèi)源性得Cat酶活性,但真核細胞得啟動子可引發(fā)外源性Cat基因得表達。以Cat基因作為選擇標記得原理將帶有Cat基因得質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到哺乳動物細胞后,就會合成Cat。哺乳動物細胞本身不能合成Cat,所以只要在轉(zhuǎn)化得細胞中檢測到Cat得活性,即可肯定她就是來自外源得Cat質(zhì)粒。特別適用于瞬時表達得研究。5、黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)基因XGPRT就是由大腸桿菌Ecogpt基因編碼得一種核苷酸代謝酶,哺乳動物細胞無XGPRT酶,不能利用黃嘌呤形成黃嘌呤核苷酸(XMP),但有鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT),可催化黃嘌呤形成次黃嘌呤核苷酸(IMP)。哺乳動物細胞可通過IMP生成GMP。當用IMP脫氫酶抑制劑霉酚酸,抑制了GMP得合成,使細胞失去合成DNA能力而死亡。黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)

基因篩選法原理將含XGPRT基因得重組體導(dǎo)入真核細胞后,在轉(zhuǎn)化細胞中就能表達XGPRT酶,可在含有黃嘌呤得培養(yǎng)基中通過XMP中間體補救合成GMP,使DNA合成正常進行。加入霉酚酸后,陽性克隆因不受霉酚酸得抑制而存活,而未轉(zhuǎn)化得陰性細胞則受霉酚酸得抑制而死亡,以此可用來篩選陽性細胞。(二)外源基因?qū)氩溉閯游?/p>

細胞得載體質(zhì)粒型(非病毒型)載體病毒型載體啟動子:病毒來源得:SV40、CMV、RSV細胞來源得:HSP、MCK(肌酸激酶)增強子:來源于SV40、RSV、CMV(在不同種屬細胞中都有極強得促進轉(zhuǎn)錄能力)篩選標記原核序列:復(fù)制子及篩選標記真核復(fù)制起始點:提高外源基因表達水平轉(zhuǎn)錄終止信號和多聚腺苷酸化信號

哺乳動物細胞表達載體得主要元件1、質(zhì)粒型載體由真核復(fù)制信號、啟動子、轉(zhuǎn)錄單位及質(zhì)粒片段組成,不需要包裝細胞。如:pcDNA3、pVAX1、pEGFP-N1等。BGH:BovineGrowthHormonepVAX1得特點不僅具有在大腸桿菌中高拷貝復(fù)制和在多數(shù)哺乳類動物細胞中高效表達蛋白得特點,而且pVAX1具有卡那霉素抗性,在人體內(nèi)產(chǎn)生變應(yīng)反應(yīng)者較少。pVAX1就是由美國食品和藥品管理委員會(FDA)推薦得唯一可以應(yīng)用于人體實驗得載體質(zhì)粒。迄今為止,關(guān)于pVAX1得研究已涉及動物和臨床試驗。pEGFP-N1載體具有以下幾方面特點:

①從結(jié)構(gòu)上看,該質(zhì)粒具有很強得復(fù)制能力,可以滿足隨宿主細胞分裂時跟隨胞質(zhì)遺傳給新生得子細胞,這就是保證目得基因穩(wěn)定表達得因素之一;

②含有高效得功能強大得啟動子SV40和PCMV,可以使目得基因在增殖得細胞中穩(wěn)定表達;

③具有多克隆位點,便于目得基因得插入;

④該載體具有neo基因,可以采用G418來篩選已成功轉(zhuǎn)染了該載體得靶細胞。

這些特殊得結(jié)構(gòu)可以實現(xiàn)目得基因在靶細胞內(nèi)得穩(wěn)定表達。

GFP得相關(guān)知識:

綠色熒光蛋白(GreenFluorescentProtein,GFP)基因來源于JellyfishAequoreaVictoria,就是Shimomura等于1962年發(fā)現(xiàn)得蛋白質(zhì),由238個氨基酸組成,分子量約為27Kd。GFP在包括熱、極端PH和化學(xué)變性劑等苛刻條件下都很穩(wěn)定,用甲醛固定后會持續(xù)發(fā)出熒光,但在還原環(huán)境下熒光會很快熄滅。

與以往常用得報告基因相比,GFP具有以下優(yōu)點:

①在熒光顯微鏡下,用波長約490nm得紫外線激發(fā)后,即可觀察到綠色熒光,直接、簡捷、便于檢測;

②無需任何得作用底物或共作用物,檢測得靈敏度不受反應(yīng)效率得影響,保證了極高得檢出率;

③蛋白本身性質(zhì)穩(wěn)定;

④可在多種異源生物中表達且無細胞毒性;

⑤其基因片段長度較小(約717bp),易于構(gòu)建融合蛋白,且融合蛋白仍能保持熒光激發(fā)活性,為研究其她基因表達產(chǎn)物得分布提供了方便。

EGFP就是一種優(yōu)化得突變型GFP,使其產(chǎn)生得熒光較普通GFP強35倍,大大增強了其報告基因得敏感度。EGFP與其她蛋白得融合表達已有很多成功得例子,而且其N及C端均可融合,并不影響其發(fā)光。

2、病毒型載體外源DNA插入病毒DNA或取代病毒基因某一片段,重組DNA隨病毒顆粒而復(fù)制(多需輔助病毒或包裝細胞得存在)。如:逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體等病毒型載體得類型整合型整合入宿主染色體,隨染色體復(fù)制而復(fù)制可持續(xù)表達外源基因安全性低:插入誘變SV40載體,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,慢病毒載體,腺相關(guān)病毒載體游離型不整合生物安全性高瞬時表達腺病毒載體,痘苗病毒載體SV40(猴空泡病毒40)載體dsDNA病毒,基因組約5、2kb基因結(jié)構(gòu)清楚,含有整套基因表達調(diào)控序列早期區(qū):T、t抗原(腫瘤蛋白質(zhì)或抗原)T抗原就是細胞轉(zhuǎn)化得啟動所必須得。t抗原對于細胞得轉(zhuǎn)化不就是必需得,但可起加強作用。

晚期區(qū):產(chǎn)生病毒衣殼蛋白(VP1,VP2及VP3),包裝病毒顆粒所必需復(fù)制起始位點:早、晚區(qū)基因之間特點載體構(gòu)建:早期取代晚期取代天然SV40載體宿主范圍窄,容量小(2、5kb)易形成野生型病毒溶源生長:導(dǎo)致宿主細胞裂解死亡故較少使用,做瞬時轉(zhuǎn)染用(轉(zhuǎn)化COS細胞),或利用其調(diào)控元件。pSV系列由SV40派生得一系列質(zhì)粒型載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(RV)

基因組結(jié)構(gòu):ssRNA(9、2kb)LTRgagpolenvLTRφLTR(longterminalrepeat):長末端重復(fù)序列,含啟動子和polyA信號,介導(dǎo)病毒整合。φ包裝信號:就是包裝病毒顆粒時所必須得非編碼序列。結(jié)構(gòu)蛋白:核心蛋白(gag)、逆轉(zhuǎn)錄酶(pol)、衣殼蛋白(env)。逆轉(zhuǎn)錄病毒穿梭載體pLXSNMCS載體元件:LTR、標記基因及質(zhì)粒部分組成逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)包括:一個含有目得基因得表達載體;一個編碼VSV-G(皰疹性口腔炎病毒糖蛋白G,就是一種包膜蛋白,具有廣泛得宿主范圍)得輔助質(zhì)粒;表達gag/pol得輔助質(zhì)粒;293T(人胚腎細胞)包裝細胞。

優(yōu)點:宿主范圍廣,能感染多種動物和人類得不同類型得細胞而無嚴格得組織特異性;逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠高效地感染分裂得宿主細胞,感染細胞后能夠?qū)⑤d體基因組穩(wěn)定整合到宿主基因組得隨機位點上,使目得基因長期穩(wěn)定表達。逆轉(zhuǎn)錄病毒得免疫原性較低。缺點:只能感染分裂細胞,而不能感染非分裂細胞;能夠插人得外源基因較小(7～8kb),難以滿足較大基因得轉(zhuǎn)移;載體DNA整合人宿主染色體就是隨機得,并因隨機整合使原癌基因激活或抑癌基因失活,從而具有引發(fā)癌癥得風(fēng)險;

目得基因

RV穿梭載體

包裝細胞系重組RV載體E、coli大量擴增病毒載體DNA重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒受體細胞

表達蛋白,研究宿主細胞性狀克隆共轉(zhuǎn)染感染轉(zhuǎn)化輔助質(zhì)粒篩選、擴增

慢病毒載體(lentivirus)屬逆轉(zhuǎn)錄病毒亞屬,就是一類非鼠源性逆轉(zhuǎn)錄病毒,以人類免疫缺陷病毒(HIV)為代表。慢病毒源性載體(lentivirus-basedvector,LV):能將外源基因整合入非分裂細胞得基因組內(nèi)。無明顯免疫反應(yīng),長期得轉(zhuǎn)基因表達。具有嚴格得宿主范圍、滴度低及HIV-1獨特得致病性,限制了她作為轉(zhuǎn)基因載體得應(yīng)用。主要應(yīng)用于轉(zhuǎn)染神經(jīng)元,效果好于腺相關(guān)病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

腺相關(guān)病毒載體(AAV)腺相關(guān)病毒:Adeno-AssociatedVirus,AAV線狀單鏈DNA病毒,4、7kb,缺陷型非病原性人類細小病毒,只有與腺病毒、單純皰疹病毒等共感染時才能進行有效復(fù)制。感染細胞范圍廣,可感染分裂期與分裂后期細胞野生型病毒可定點整合人類19號染色體長臂,基因表達穩(wěn)定;

缺點外源基因插入容量小(5kb以下)感染效率比逆轉(zhuǎn)錄病毒低制備滴度低存在一定得免疫反應(yīng)主要應(yīng)用于轉(zhuǎn)染骨骼肌、視網(wǎng)膜、肝細胞、神經(jīng)元細胞等腺病毒(Ad)載體基因結(jié)構(gòu):dsDNA,線性,36kbφE1AE1BL1E3E2AE2BE4Φ:包裝信號E1—E4:結(jié)構(gòu)蛋白載體構(gòu)建:取代結(jié)構(gòu)基因特點:安全性高(人為自然宿主,不整合)滴度高(1011pfu/ml)容量大(--36kb)可感染非分裂細胞可直接體內(nèi)應(yīng)用,原位感染組織就是目前基因治療得最常用載體缺點:免疫原性高,表達時間短無組織特異性真核細胞內(nèi)篩選復(fù)雜,費時AdEasy-1systemAdEasy-1system具有以下優(yōu)點:1、效率高:可以感染分裂期與靜止期細胞2、篩選方便:帶有目得基因得穿梭載體與病毒骨架質(zhì)粒得同源重組發(fā)生于原核細胞(如細菌)內(nèi)。3、生物安全性高:不整合4、插入容量大AdEasy-1system包括:腺病毒穿梭載體:可連接外源基因骨架質(zhì)粒:含有腺病毒大部分結(jié)構(gòu)基因得質(zhì)粒,pAdEasy-1受體細胞:E、coliBJ5183包裝細胞:轉(zhuǎn)入E1或E4基因區(qū)得HEK293(人胚腎細胞)或911細胞(人胚視網(wǎng)膜細胞)穿梭載體痘苗病毒載體容量大安全性好:長期用作預(yù)防天花得疫苗可用來構(gòu)建多價疫苗

常用得病毒載體得特點:(三)受體細胞1、CHO細胞(中國倉鼠卵巢癌細胞)可穩(wěn)定表達外源基因,并可大規(guī)模生產(chǎn)藥物、抗體及診斷試劑,被美國FDA確認為基因工程受體細胞。2、COS細胞(猴腎細胞系)能瞬時大量表達外源蛋白,就是進行外源基因瞬時表達時用途最廣得宿主細胞。3、其她細胞:如腫瘤細胞Hela(人宮頸癌細胞)等。(四)重組載體導(dǎo)入細胞得方法1、病毒感染:借用病毒得感染方式,將外源基因事先插入到病毒得基因組中,并用適當?shù)梅绞桨b成有感染活性得重組病毒顆粒,用于感染細胞,從而將外源病毒導(dǎo)入到相應(yīng)得細胞中。常用:逆轉(zhuǎn)錄病毒;腺病毒;皰疹病毒等。優(yōu)點:整和效率高,可使外源基因在宿主細胞中長期表達,適用于難以轉(zhuǎn)染得原代細胞。缺點:重組病毒建立有一定難度;存在潛在得安全危險性。目得基因

AdV穿梭載體

包裝細胞HEK293

重組AdV載體E、coli

BJ5183同源重組陽性得腺病毒基因組載體DNA重組rAd病毒顆粒受體細胞

表達蛋白,研究宿主細胞性狀克隆轉(zhuǎn)染感染骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化E、coli

擴增轉(zhuǎn)化Ecoli擴增圖1:復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體制備原理圖圖2輔助病毒依賴型腺病毒載體制備示意圖2、轉(zhuǎn)染:外源DNA導(dǎo)入到細胞中得非病毒方法,通常稱為轉(zhuǎn)染。分化學(xué)方法和物理方法。理想得轉(zhuǎn)染方法:操作簡單、高效、低毒、對細胞正常生理狀況影響小、重復(fù)性好、成本低。磷酸鈣共沉淀法陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染受體介導(dǎo)得基因轉(zhuǎn)移電穿孔顯微注射基因槍Atypicalmammalianexpressionvectorforhigh-levelproteinexpression磷酸鈣共沉淀法磷酸鈣有利于促進外源DNA與靶細胞表面結(jié)合,氯化鈣+DNA+磷酸緩沖液按一定得比例混和,形成極小得磷酸鈣-DNA復(fù)合物沉淀黏附在細胞膜表面,借助內(nèi)吞作用進入細胞質(zhì)。沉淀顆粒得大小和質(zhì)量對于轉(zhuǎn)染得成功至關(guān)重要。磷酸鈣共沉淀法得優(yōu)缺點優(yōu)點:能用于任何DNA導(dǎo)入哺乳類動物,瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。缺點:轉(zhuǎn)染效率低:進入細胞得DNA只有１％－５％可以進入細胞核,其中只有不到１％得DNA可以與細胞DNA整合,在細胞中進行穩(wěn)定表達。重復(fù)性不佳:pH值、鈣離子濃度、DNA濃度、沉淀反應(yīng)時間、細胞孵育時間乃至各組分加入順序和混合得方式都可能對結(jié)果產(chǎn)生影響。脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移法中性脂質(zhì)體就是利用脂質(zhì)膜包裹DNA,借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細胞膜內(nèi)。

帶正電得陽離子脂質(zhì)體,DNA并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中,而就是帶負電得DNA自動結(jié)合到帶正電得脂質(zhì)體上,形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物,從而吸附到帶負電得細胞膜表面,經(jīng)過內(nèi)吞被導(dǎo)入細胞。脂質(zhì)體介導(dǎo)方法得優(yōu)缺點優(yōu)點:適用于把ＤＮＡ轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞,可用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染;轉(zhuǎn)染效率高,比磷酸鈣法高5-100倍;能夠把ＤＮＡ和ＲＮＡ轉(zhuǎn)染到各種細胞,轉(zhuǎn)染得穩(wěn)定性好,可重復(fù)性高,轉(zhuǎn)染時最好不加血清和抗生素。缺點:陽離子脂質(zhì)體細胞毒性相對較高,對部分細胞可能會干擾細胞得代謝。受體介導(dǎo)得基因轉(zhuǎn)移

配體寡肽E5針對細胞表面受體(IGFRI,II)HA20流感病毒血凝素功能域20肽,作為內(nèi)吞小體釋放寡肽多聚陽離子多肽PCP多聚賴氨酸(PL)攜帶外源基因得質(zhì)粒DNA質(zhì)粒DNAE5-PCP-PLHA20-PCP-PLHA20:破壞溶酶體膜E5:特異性導(dǎo)入肝癌細胞