醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院

微生物學(xué)教研室

第一次實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2.實(shí)驗(yàn)室規(guī)則

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容3.細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察技術(shù)

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容4.染色標(biāo)本的制備一革藍(lán)染色

實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求

醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課是該專(zhuān)業(yè)課程的重要組成部分，指導(dǎo)學(xué)生上好實(shí)驗(yàn)課是

教學(xué)過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)課的目的是：

1.使學(xué)生加深理解并鞏固理論知識(shí)，學(xué)習(xí)和掌握有關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)，為

以后的醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)課學(xué)習(xí)打好基礎(chǔ)：

2.在實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)學(xué)生觀察、思考和分析問(wèn)題的能力，主動(dòng)參與實(shí)驗(yàn)的動(dòng)

手能力及獨(dú)立工作的能力。訓(xùn)練學(xué)生嚴(yán)格的科學(xué)作風(fēng)、嚴(yán)肅白的科學(xué)態(tài)度和嚴(yán)密

的工作方法。

3.培養(yǎng)學(xué)生在集體工作環(huán)境中互幫互讓?zhuān)瑘F(tuán)結(jié)協(xié)作，共同完成好實(shí)驗(yàn)的精

神品德。

為了達(dá)到上述目的，提高實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)效果，特提出以下要求：

1.實(shí)驗(yàn)課前做好預(yù)習(xí)，明確本次實(shí)驗(yàn)課的內(nèi)容及其原理、方法及注意事項(xiàng);

2.實(shí)驗(yàn)中要仔細(xì)認(rèn)真，注意分工與協(xié)作，操作實(shí)驗(yàn)要按操作步驟進(jìn)行。學(xué)

會(huì)正確操作手法、準(zhǔn)確記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。示教實(shí)驗(yàn)要注意觀察，并記錄好相關(guān)內(nèi)容;

3.詳細(xì)討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提倡同學(xué)之間互幫互學(xué)，并緊密聯(lián)系理論課內(nèi)容。

要注意不論實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論符合與否，都有討論的價(jià)值，并分析其原因，有可能

的話(huà)還應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)；

4.嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室規(guī)則，在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課上，要樹(shù)立“有菌觀點(diǎn)”，嚴(yán)

格掌握和不斷完善無(wú)菌操作技術(shù)。

實(shí)驗(yàn)室規(guī)則

一、進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室須穿工作服、戴工作帽。除必要的書(shū)籍文具外，其它個(gè)人物

品一律不得帶入實(shí)驗(yàn)室。

二、在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，禁止飲食、吸煙及與學(xué)習(xí)無(wú)關(guān)的其它活動(dòng)，不得大聲喧嘩

或嘻戲。

三、未經(jīng)老師許可，不得擅自搬動(dòng)實(shí)驗(yàn)器材及示教物品，不準(zhǔn)隨意擺弄和旋

轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)儀器上的開(kāi)關(guān)及旋扭等。

四、按照實(shí)驗(yàn)要求，在老師的指導(dǎo)下，主動(dòng)安排要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，認(rèn)真進(jìn)行實(shí)

驗(yàn)操作，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，爭(zhēng)取順利地完成實(shí)驗(yàn)。

五、實(shí)驗(yàn)中使用完畢的器材和試劑，必須放回規(guī)定的位置。廢棄物必須按規(guī)

定進(jìn)行處理或歸放于指定的容器內(nèi)，不能隨便亂丟亂放。

六、實(shí)驗(yàn)中萬(wàn)一有菌液打翻、有菌材料污染桌面或衣物、割破手指等意外情

況，應(yīng)及時(shí)報(bào)告老師進(jìn)行處理，切勿自作主張不按規(guī)定處理。

七、愛(ài)護(hù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一切設(shè)備、掛圖、儀器。注意節(jié)約使用消耗材料及藥品試

劑，注意用電安全及節(jié)約水電。

八、實(shí)驗(yàn)結(jié)束，要清理桌面，將實(shí)驗(yàn)器材放回原處。值日同學(xué)要搞好實(shí)驗(yàn)室

的清潔衛(wèi)生，保持室內(nèi)整齊，離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室前要關(guān)好門(mén)窗、水、電，并將手洗干凈。

九、未經(jīng)許可，不得將實(shí)驗(yàn)室內(nèi)任何物品帶出實(shí)驗(yàn)室。

實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察技術(shù)

將細(xì)菌培養(yǎng)物或含菌標(biāo)本材料制備的染色標(biāo)本片，置顯微鏡油鏡頭下,

可以觀察到細(xì)菌的形狀、大小、結(jié)構(gòu)、排列及染色特性等，了解這些特征有助于

鑒別各種細(xì)菌。

一、顯微鏡油鏡頭的使用與保護(hù)

【使用原理】

用油鏡觀察標(biāo)本、是在使用高倍鏡的基礎(chǔ)上，采用同玻璃折光率相似的

油狀物（如香柏油、液體石臘等），滴加在標(biāo)本與油鏡頭中間，以避免光線(xiàn)散射,

提高顯微鏡的清晰度和分辨能力。使觀察物象更加清楚明了。

【操作方法】

1.調(diào)試：打開(kāi)電源，先采用低倍鏡，使視野達(dá)到清晰光亮。

2.加油：雙手向上轉(zhuǎn)動(dòng)粗螺旋，使鏡筒上升，將標(biāo)本片固定于載物臺(tái)

上，使染色面對(duì)準(zhǔn)集光器央，加鏡油于標(biāo)本面，調(diào)換油鏡頭對(duì)準(zhǔn)標(biāo)本面。

3.調(diào)焦點(diǎn)：用左手向下輕轉(zhuǎn)粗螺旋，使鏡筒下降，同時(shí)眼睛從右側(cè)觀

察下降程度，待鏡頭入油后接觸上玻片，用眼觀目鏡，反轉(zhuǎn)粗螺旋，使鏡筒慢慢

上升，待看到模糊物象時(shí)，改用細(xì)螺旋上下調(diào)節(jié)，使物像達(dá)到完全清晰為宜（一

般轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)前后半圈）。

4.觀察：觀察時(shí)只使用細(xì)調(diào)。需改換視野時(shí)，右手操縱推進(jìn)器，左手

轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)螺旋，做到配合自如。并養(yǎng)成左眼觀察，右眼繪圖的習(xí)慣。

【油鏡頭的保護(hù)】

油鏡頭使用完結(jié)后，必須用擦鏡紙滴加少量二甲苯將油擦洗干凈（二甲

苯用量宜少，以免鏡片間粘膠溶解）。下降集光器，半接物鏡轉(zhuǎn)成“八”字，再

下降鏡筒，輕觸鏡臺(tái)表面，雙手平持顯微放入鏡箱，避免直射日光，置于干燥處,

以防受潮。

【注意事項(xiàng)】

1.使用直筒顯微鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須兩眼同時(shí)睜開(kāi)，訓(xùn)練使用左眼觀

察，右眼繪圖。如用油鏡頭觀察，勿將鏡身歪斜，避免鏡油流出片面。

2.觀察染色標(biāo)本時(shí)，光線(xiàn)宜強(qiáng)，可上升集光器，開(kāi)大光圈。觀察不染

色標(biāo)本時(shí)，光源宜弱，可下降集光器，縮小光圈。

3.使用完畢，一定擦去鏡油。

二、細(xì)菌不染色標(biāo)本

不染色的細(xì)菌和標(biāo)本鏡檢，雖可觀察細(xì)菌在自然生活狀態(tài)下的大小、形

態(tài)、活動(dòng)等，但主要用于觀察細(xì)菌的動(dòng)力。

（一）懸滴法

【材料】

1.細(xì)菌：枯草桿菌8~12小時(shí)肉湯培養(yǎng)物。

2.凹玻片，蓋玻片，凡士林等。

【方法】

1.取凹玻片一張，于凹窩周?chē)可僭S凡士林（見(jiàn)圖1）。

圖1懸滴法

2.用接種環(huán)沾取枯草桿菌8?12小時(shí)培養(yǎng)物，置于蓋玻片中央。

3.反轉(zhuǎn)凹玻片，使凹窩對(duì)準(zhǔn)蓋玻片中央，蓋于其上，輕壓后，迅速翻轉(zhuǎn)玻

片，使蓋破片面向上。

4.標(biāo)本片置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用弱光線(xiàn)，低倍鏡找物象，再改換高倍

鏡觀察，密切注意，勿壓破蓋玻片。

5.觀察：細(xì)菌在鏡下為灰色半透明體，并呈現(xiàn)真運(yùn)動(dòng)，如在明亮的海洋中,

深入淺出游來(lái)動(dòng)去。

（二）壓滴法

用途同懸滴法。

【材料】

1.細(xì)菌：枯草桿菌8~12小時(shí)肉湯培養(yǎng)物。

2.載物玻片：蓋玻片等。

【方法】

1.取無(wú)油污物玻片1張。

2.用接種環(huán)沾取枯草桿菌8~12小時(shí)肉湯培養(yǎng)物置于載物玻片中央。

3.加蓋玻片于菌液表面，觀察方法同懸滴法。

三、細(xì)菌染色標(biāo)本片的制備（操作）

由于細(xì)菌個(gè)體微小，基本上無(wú)色透明，故將其用適當(dāng)染料染色觀察，方能

顯示它的形態(tài)、大小、構(gòu)造及染色特性等，在細(xì)菌和鑒別上有重要意義。

【材料】

1.葡萄球菌大腸桿菌18~24小時(shí)普通瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.革蘭染色液。

3.生理鹽水，載物玻片，接種環(huán)等。

【方法】

（一）細(xì)菌涂片的制作

1.涂片：取清潔無(wú)油污載物玻片一張，接種環(huán)沾取生理鹽水1~2環(huán)置于玻

片中央，再將接種環(huán)火焰滅菌待冷后，沾取葡萄球菌或大腸桿菌菌苔少許，混于

生理鹽水中，輕輕涂成均勻薄膜。

2.干燥：室溫自然干燥，也可將涂面向上，遠(yuǎn)離火焰上方微加溫干燥（切

勿加熱過(guò)度，以防將標(biāo)本燒枯）。

3.固定：標(biāo)本干燥后，通過(guò)酒精燈火焰三次（約2~3秒鐘），以殺死細(xì)菌

并使之固定于玻片上。

4.染色：可根據(jù)不同的染色要求，用相應(yīng)染色液進(jìn)行染色。

（二）革蘭染色法：涂片的制備方法同前，革蘭染色方法可分為四步。

1.初染：于涂抹面上滴加結(jié)晶紫染液數(shù)滴，覆蓋整個(gè)涂面，室溫作用一分

鐘。用自來(lái)水輕輕沖洗，甩干水分。

2.媒染：滴加魯戈碘液，室溫作用一分鐘，自來(lái)水沖洗，甩干水分。

3.脫色：將載物玻片浸于95%酒精缸中，上下提取，邊提邊看，見(jiàn)涂面無(wú)

色素下流為止（約30秒鐘）。自來(lái)水沖洗，甩干水分。

4.復(fù)染：加稀釋復(fù)紅染液染30秒鐘，自來(lái)水沖洗，吸水紙吸干玻片水分。

5.加油鏡檢：染色片待干后，于油鏡下，調(diào)強(qiáng)光視野觀察，呈紫色的為革

蘭陽(yáng)性菌，呈紅色的為革蘭陰性菌。

（三）美蘭染色法

【方法】

將涂片固定滴加美蘭染液于玻片上，染1~2分鐘，水洗、待干、鏡檢。

【結(jié)果】

此法為單染色法，菌體和細(xì)胞均染成藍(lán)色。常用于腦膜炎球菌及白喉?xiàng)U菌

等細(xì)菌染色。

四、細(xì)菌基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)觀察

（一）基本形態(tài)（示教）

1.球形：葡萄球菌革蘭染色標(biāo)本片一一菌體正園形，染成蘭紫色，呈現(xiàn)葡

萄串狀排列。G+球菌。

2.桿形：大腸桿菌革蘭染色標(biāo)本片一一菌體短桿狀，染成紅色，呈分散排

列。G桿菌。

3.螺形：霍亂弧菌革蘭染色標(biāo)本片一一菌體弧形，染成紅色，呈分散排列。

G-弧菌。

（二）特殊結(jié)構(gòu)示教

1.鞭毛：傷寒桿菌鞭毛染色片一一菌體較粗大桿狀，染成蘭灰色，單個(gè)或

成堆存在，周?chē)梢?jiàn)到波浪狀彎曲、較長(zhǎng)、呈蘭灰色的鞭毛。

2.莢膜：肺炎雙球菌莢膜染色片一一視野背景為紅色，其中可見(jiàn)到染色呈

深紅色，矛頭狀菌體，縱向成雙排列，菌體周?chē)形慈旧项伾目瞻讌^(qū)，即莢膜。

3.芽胞：破傷風(fēng)梭菌芽胞染色片一一菌體為細(xì)長(zhǎng)桿狀，頂端有染成紅色、

并大于菌體的球狀物即芽胞，呈“鼓槌狀”，其他散亂分布的紅色球體，為菌體

脫落的成熟芽胞。

《附錄》

革蘭（Gram）染液的配制

1.結(jié)晶紫染液

將1份結(jié)晶紫酒精飽和液與4份1%草酸鏤水溶液混合即成（14克結(jié)晶紫加

95%酒精100毫升即為酒精飽和溶液）。

2.魯戈（Lugol）碘液

碘1克碘化鉀2克蒸儲(chǔ)水300毫升

3.稀釋復(fù)紅液

1份磴性復(fù)紅飽和液（磴性復(fù)紅3.2克溶于95%酒精100毫升中。即為磴性復(fù)

紅飽和溶液）力口9份5%石炭酸水溶液，先配成石炭酸復(fù)紅染液（抗酸染色用），

取1份石炭酸復(fù)紅染液加9份蒸儲(chǔ)水即為稀釋復(fù)紅染液。

第二次實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1;細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)（操作）

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2；細(xì)菌的生化反應(yīng)檢測(cè)（示教）

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容3：播放錄象一《細(xì)菌感染的檢查方法和防治原則》

實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)

給細(xì)菌提供適宜的條件，細(xì)菌即可以生長(zhǎng)繁殖，形成具有一定特征的培養(yǎng)

物，學(xué)習(xí)細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)可以純化細(xì)菌，了解細(xì)菌的生長(zhǎng)特征，并能進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)

菌生化反應(yīng)、變異性，制備細(xì)菌抗原，深入進(jìn)行分子生物學(xué)工作等。了解細(xì)菌的

培養(yǎng)特征也有助于鑒別細(xì)菌。

細(xì)菌培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)基是用人工方法將適合細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的各種營(yíng)養(yǎng)物配制而成的營(yíng)養(yǎng)

基質(zhì)，以供細(xì)菌培養(yǎng)使用。一般培養(yǎng)基的主要成份為蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、鹽類(lèi)、水分

等。另外還有一些營(yíng)養(yǎng)要求較高的細(xì)菌，還必須加入血液或血清、雞蛋、維生素

等其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。有時(shí)為了鑒別或抑制某些細(xì)菌，則可加入各種專(zhuān)用基質(zhì)（如某

種糖類(lèi)、氨基酸等），指示劑，染料等。由于對(duì)培養(yǎng)基的使用目的不同，故在培

養(yǎng)基的選擇上有所不同。按其物理性質(zhì)可分為液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體

培養(yǎng)基。按其成分和用途可分為普通培養(yǎng)基，鑒別培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)基和專(zhuān)用培

養(yǎng)基等。培養(yǎng)基需加入小試管、中試管、三角瓶、平皿等內(nèi)使用。

培養(yǎng)基的種類(lèi)很多，但一般制備原則有三條：

1.足夠和適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)成份。籍以滿(mǎn)足細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的要求，獲得典型細(xì)菌

培養(yǎng)物，達(dá)到研究細(xì)菌的形態(tài)，生化反應(yīng)，抗原結(jié)構(gòu)及致病力等方面的目的。

2.合適的酸磴度。培養(yǎng)基的酸磴度直接影響細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。一般細(xì)菌最

合適PH為7.2~7.6。測(cè)定的方法常用普通比色法或精密PH試紙來(lái)測(cè)定（見(jiàn)附錄）。

3.絕對(duì)無(wú)菌。培養(yǎng)基務(wù)必進(jìn)行除菌處理，由于培養(yǎng)基所含成份不同，除菌

的方法也不同。如普通培養(yǎng)基常用高壓蒸氣滅菌法。

一、常用培養(yǎng)基的制備

（一）普通肉湯培養(yǎng)基

【材料】

1.新鮮牛肉或牛肉膏，蛋白腺，氯化鈉，瓊脂，蒸儲(chǔ)水。

2.酚紅指標(biāo)劑，比色架及標(biāo)準(zhǔn)比色管或精密PH試紙。

3.漏斗，量筒，三角燒瓶，試管等。

【方法】

1.稱(chēng)取去脂去腱絞碎的鮮牛肉500克，浸于1000毫升蒸儲(chǔ)水中，冰箱過(guò)夜，

次日煮沸30分鐘，紗布過(guò)濾，蒸儲(chǔ)水補(bǔ)足其量，（也可用牛肉膏3克加蒸儲(chǔ)水1000

毫升加熱溶化），即為肉浸液。

2.取肉浸液1000毫，氯化鈉5克，蛋白膝10克混合加熱溶化。

3.調(diào)整PH為7.6,用濾紙過(guò)濾分裝于中試管或三角燒瓶?jī)?nèi)，塞緊棉塞。

【用途】

供基礎(chǔ)培養(yǎng)基用，營(yíng)養(yǎng)比肉膏湯好，一般營(yíng)養(yǎng)要求不高的菌均可生長(zhǎng)。

（二）普通瓊脂培養(yǎng)基

瓊脂是石花菜等海藻類(lèi)提取的膠體物質(zhì)，其化學(xué)成份主要是多糖。當(dāng)溫度

達(dá)到98℃以上可溶解于水，45℃以下則凝固。瓊脂對(duì)細(xì)菌一般無(wú)營(yíng)養(yǎng)作用（除自

然界中極少數(shù)菌可利用瓊脂之外），純屬賦形劑。便于人們制做斜面、平板、高

層等不同類(lèi)型的固體培養(yǎng)基。

【材料與方法】

普通肉湯培養(yǎng)基100毫升，加入瓊脂2~3克，加熱溶化，用蒸儲(chǔ)水補(bǔ)足失

去水分，調(diào)整PH為7.6后分裝中試管、平皿等器皿，高壓蒸氣15磅滅菌20分鐘，

可制成普通瓊脂斜面和普通瓊脂平板。

【用途】

供一般細(xì)菌培養(yǎng)用，并可作無(wú)糖基培養(yǎng)基。

（三）半固體培養(yǎng)基

【材料與方法】

取普通肉湯培養(yǎng)基100毫升，力口入瓊脂0.5~0.7克，加熱溶化。調(diào)整PH為7.6,

分裝于小試管內(nèi)，每管1~5毫升，高壓蒸氣磅滅菌20分鐘，待冷后放入4℃冰箱

備用。

【用途】

保存一般菌種用，并可觀察細(xì)菌的動(dòng)力及生化反應(yīng)。

（四）血液瓊脂培養(yǎng)基

【材料與方法】

將高壓滅菌后普通瓊脂培養(yǎng)基。冷至45℃~50℃時(shí)以無(wú)菌手續(xù)操作加入

5%~10%血液（人或動(dòng)物脫纖維無(wú)菌血液）。可制成血平板和血斜面。

【用途】

供營(yíng)養(yǎng)要求較高的細(xì)菌分離培養(yǎng)用，亦可觀察細(xì)菌的溶血特征。

二、細(xì)菌接種技術(shù)及生長(zhǎng)表現(xiàn)

由于細(xì)菌感染而致病的各種標(biāo)本及帶菌者所需檢查的各種標(biāo)本，往往并非單

一的細(xì)菌，而混有其它非致病菌（人體正常菌群）。因此當(dāng)對(duì)此標(biāo)本須作出細(xì)菌

鑒定時(shí)，就必須從標(biāo)本中分離出致病菌，稱(chēng)為細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)。另外，對(duì)已

得到可疑病菌進(jìn)行細(xì)菌鑒定及菌種保存等培養(yǎng)，稱(chēng)為純培養(yǎng)接種技術(shù)。

（一）平板劃線(xiàn)接種法（又稱(chēng)分離培養(yǎng)法）

平板分離劃線(xiàn)的方法較多，其中以分區(qū)劃線(xiàn)法與曲線(xiàn)劃線(xiàn)法較為常用。其目

的都要使細(xì)菌呈現(xiàn)單個(gè)菌落生長(zhǎng)，便于同雜菌菌落鑒別。現(xiàn)只介紹分區(qū)劃線(xiàn)法。

【材料】

1.細(xì)菌：大腸桿菌、葡萄球菌18~24小時(shí)普通瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：普通瓊脂平板。

3.酒精燈，接種環(huán)等。

【方法】

1.右手持接種環(huán)，經(jīng)火焰滅菌，待涼后，挑取大腸桿菌（或葡萄球菌）培

養(yǎng)物少許。

2.左手斜持瓊脂平板，皿蓋留在桌上，于火焰近處將菌涂于瓊脂平板上端,

來(lái)回劃線(xiàn)，涂成薄膜（約占平板總表面積的1/10）,劃線(xiàn)時(shí)接種環(huán)與平板表面成

30~40°角，輕輕接觸，以腕力在平板表面行輕快地滑移動(dòng)作，接種環(huán)不應(yīng)劃破

培養(yǎng)基表面。

3.燒灼接種環(huán)，殺滅環(huán)上殘留細(xì)菌，待冷（是否冷卻，可先在培養(yǎng)基邊緣

處試觸，若瓊脂溶化，表示未涼，稍等再試），從薄膜處取菌作連續(xù)平行劃線(xiàn)（見(jiàn)

圖3）,約占平板表面1/5左右，再次燒灼接種環(huán)，等三次平行劃線(xiàn)……以同樣方

法作第四次，第五次劃線(xiàn)，將平板表面劃完。

4.劃線(xiàn)完畢，蓋上平皿蓋，底面向上，用標(biāo)簽或臘筆注明菌名檢驗(yàn)號(hào)碼，

接種者班級(jí)，姓名，組別等，置37℃孵育培養(yǎng)24小時(shí)后觀察結(jié)果（見(jiàn)圖4）。

（二）純培養(yǎng)細(xì)菌接種法

1.斜面培養(yǎng)基接種法：用于培養(yǎng)，保存菌種及其它實(shí)驗(yàn)用。

【材料】

（1）大腸桿菌，葡萄球菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

（2）普通瓊脂斜面培養(yǎng)基。

（3）接種環(huán)，接種針，酒精燈等。

【方法】

（1）取一支斜面培養(yǎng)基及一支純菌種管，并排傾斜放在左手四指中拇指壓

住并以手掌支住兩試管底部。右手將白金環(huán)于火焰上滅菌、冷卻。并拔起兩試管

的棉塞。（勿放置桌上，如棉塞太緊時(shí)應(yīng)預(yù)先松動(dòng)）。

（2）試管口部于火焰上往返通過(guò)2~3次滅菌，將滅菌白金環(huán)伸入有菌試管

中，取少量細(xì)菌（一般應(yīng)從斜面底部沾取），然后小心移至準(zhǔn)備接種的試管中。

（3）接種方法是自管底向上連續(xù)平劃線(xiàn)，若以保存菌為目的時(shí)可自管底上

劃一粗直線(xiàn)即可。

（4）取出接種環(huán)，將試管上部再經(jīng)火焰滅菌，塞好棉塞，接種環(huán)滅菌后放

回原處。

（5）若自平皿培養(yǎng)物中取菌時(shí)，只應(yīng)沾取一個(gè)單個(gè)菌落。

（6）接種菌應(yīng)作好標(biāo)記，標(biāo)明菌種名稱(chēng)，日期等，置37℃溫箱中培養(yǎng)，次

日觀察結(jié)果。

2.液體培養(yǎng)基接種法：用于增菌及鑒定細(xì)菌生長(zhǎng)特點(diǎn)，如表面生長(zhǎng)，沉淀

生長(zhǎng)，均勻混濁生長(zhǎng)等。

【材料與方法】

操作技術(shù)基本與上法相同，只是接種時(shí)應(yīng)將沾菌之接種環(huán)沿接近液體表面之

管內(nèi)壁輕輕摩擦（勿用力振蕩）使細(xì)菌混入培養(yǎng)基內(nèi)，置37℃溫箱中培養(yǎng)，次日

觀察結(jié)果。

3.半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)法

用于保存菌種及間接觀察細(xì)菌之動(dòng)力（無(wú)動(dòng)力之細(xì)菌僅沿穿刺線(xiàn)生長(zhǎng)，清晰

可見(jiàn)；有動(dòng)力的細(xì)菌使培養(yǎng)基呈現(xiàn)混濁樣，穿刺線(xiàn)甚至難以看出）。

用無(wú)菌操作技術(shù)，滅菌穿刺針沾取細(xì)菌后，垂直刺入半固體培養(yǎng)基中央直達(dá)

近管底處，再沿原穿刺線(xiàn)抽出即可，置37℃溫箱培養(yǎng)，次日觀察結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2；實(shí)驗(yàn)三細(xì)菌的生化反應(yīng)檢測(cè)（示教）

不同細(xì)菌由于所含的酶系統(tǒng)不完全相同，因而對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解能力及代謝

產(chǎn)物亦不一致，據(jù)此，可用以鑒別細(xì)菌的種類(lèi)。

一、單糖發(fā)酵試驗(yàn)

【原理】

單糖發(fā)酵是將葡萄糖，乳糖或麥芽糖等分別加入蛋白陳水培養(yǎng)基內(nèi)，使其最

終濃度為0.75~1%。并加入一定量酚紅指示劑及小倒管，制成單糖發(fā)酵管，接種

細(xì)菌經(jīng)37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)，若能分解糖產(chǎn)酸則酚紅指示劑由紅變黃，若能分解

甲酸有C02和H2等氣體形成，小倒管內(nèi)則聚集有氣泡；不分解，則指示劑不變色。

【材料】

1.菌種：大腸桿菌，傷寒桿菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：葡萄糖發(fā)酵管，乳糖發(fā)酵管等。

【方法】

1.將傷寒桿菌，大腸桿菌按照液體接種方法分別接種于葡萄糖及乳糖發(fā)酵

管內(nèi)。

2.置37℃孵箱培養(yǎng)18~24小時(shí)。

3.觀察結(jié)果：由于一些細(xì)菌能分解某種糖類(lèi)產(chǎn)酸，所以培養(yǎng)基中PH下降到

7.0以下，在酚紅指示劑的顯示下，培養(yǎng)基顏色由紅變黃。產(chǎn)酸者以“+”表示，

如果同時(shí)產(chǎn)生氣體，則培養(yǎng)基中小倒管內(nèi)有氣泡出現(xiàn)，此乃產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，以“十”

表示，不分解，則指示劑不變色，用“-”表示。

【結(jié)果】

傷寒桿菌大腸桿菌

葡萄糖+十

乳糖-?

二、V-P（Voges-Proskauer）試驗(yàn)

【原理】

有些細(xì)菌如產(chǎn)氣桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫峻，生成乙酰甲基

甲醇，在堿性環(huán)境中被氧化為二乙酰，再與培養(yǎng)基內(nèi)股基結(jié)合，生成紅色化合物,

V—P試驗(yàn)陽(yáng)性。

【材料】

1.菌種：大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基。

3.試劑：V-P試劑［40%氫氧化鉀水溶液（內(nèi)含0.3%肌酸）和6%a-奈酚酒精

溶液］。

【方法】

1.分別接種大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌于兩支葡萄糖蛋白陳水中。

2.置37℃培養(yǎng)48小時(shí)后，取出分別加入KOHlml和a一奈酚溶液1ml,搖勻，

靜置試管架上5~15分鐘。

3.觀察結(jié)果：培養(yǎng)液變?yōu)榧t色為陽(yáng)性，不變色為陰性。

【結(jié)果】

大腸桿菌：-；產(chǎn)氣桿菌：+

三、甲基紅（M、R）試驗(yàn)

【原理】

某些細(xì)菌如大腸桿菌等分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，繼而分解為甲酸、乙酸、乳

酸等，使培養(yǎng)基PH值降至4.5以下，加入甲基紅指示劑呈紅色，此為陽(yáng)性反應(yīng)；

若產(chǎn)酸量少或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為醇、醛、氣體和水等，則培養(yǎng)基的酸堿度仍

在PH6.2以上，加入甲基紅指示劑呈現(xiàn)黃色，為陰性反應(yīng)。

【材料】

1.菌種：大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基。

3.試劑：甲基紅試劑。

【方法】

1.分別將大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌接種于兩支葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基中。

2.置37℃培養(yǎng)2~3天取出，分別滴加甲基紅試劑2~3滴，混勻，觀察結(jié)果。

【結(jié)果】

大腸桿菌：+,產(chǎn)氣桿菌：-0

四、枸椽酸鹽利用試驗(yàn)

【原理】

枸椽酸鹽培養(yǎng)基系一綜合性培養(yǎng)基，其中枸椽酸鈉為唯一碳源，磷酸二氫鏤

為唯一氮源。一般細(xì)菌能利用磷酸二氫鏤作為氮源，但不一定能分解枸椽酸鹽取

得碳源。因此，根據(jù)可否利用枸椽酸鹽來(lái)鑒別細(xì)菌，如產(chǎn)氣桿菌可利用枸椽鹽作

為碳源，細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，形成菌苔，分解枸椽酸鹽生成堿性碳酸鹽，使培養(yǎng)基

PH上升到7.0以上，由綠色變?yōu)樯钐m色，為枸椽酸鹽利用試驗(yàn)陽(yáng)性；而大腸桿菌

則不能分解枸椽酸鹽，得不到碳源，不能生長(zhǎng)，無(wú)菌苔形成，培養(yǎng)基顏色不發(fā)生

變化，為枸椽酸鹽利用試驗(yàn)陰性。

【材料】

1.菌種：大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：枸椽酸鹽斜面。

【方法】

1.分別將大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌接種于兩支枸椽酸鹽斜面培養(yǎng)基。

2.置37℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)后觀察結(jié)果。

【結(jié)果】

產(chǎn)氣桿菌：+（有菌苔生長(zhǎng)，培養(yǎng)基變色）

大腸桿菌：-（無(wú)菌苔生長(zhǎng)，培養(yǎng)基不變色）

五、靛基質(zhì)（IndoD試驗(yàn)

【原理】

某些細(xì)菌如大腸桿菌，變形桿菌等具有色氨酸酶，能分解蛋白陳水培養(yǎng)基中

的色氨酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)（無(wú)色吧跺），再與歐立希試劑（對(duì)二甲基氨基苯甲醛）

反應(yīng)，形成紅色化合物一玫瑰喝I口朵，即為陽(yáng)性反應(yīng)。

【材料】

1.菌種：大腸桿菌，傷寒桿菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：蛋白陳水培養(yǎng)基。

3.試劑，歐立希（Ehrlich）試劑（對(duì)二甲基氨基苯甲醛）

【方法】

1.分別將大腸桿菌，傷寒桿菌接種于兩支蛋白陳水培養(yǎng)基中。

2.置37℃培養(yǎng)2~3天后，每管沿管壁各加歐立希試劑于培養(yǎng)液面上,

待1-2分鐘后觀察結(jié)果：在交界面出現(xiàn)玫瑰紅色環(huán)即為嗎|躲試驗(yàn)陽(yáng)性，無(wú)紅色環(huán)

即為陰性。

【結(jié)果】

大腸桿菌：+;傷寒桿菌：-。

六、硫化氫（H2S）產(chǎn)生試驗(yàn)

【原理】

某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸），生成硫化

氫。硫化氫遇到培養(yǎng)基中的鉛鹽（醋酸鉛）或鐵鹽（硫酸亞鐵），則形成黑褐色

硫化鉛或硫化亞鐵沉淀物。培養(yǎng)基內(nèi)含有還原劑硫代硫酸鈉，使形成的硫化氫不

再氧化。

【材料】

1.菌種：大腸桿菌，傷塞桿菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基。

【方法】

1.分別以半固體穿刺接種法將大腸桿菌，傷寒桿菌穿刺接種地兩支醋酸鉛

培養(yǎng)基內(nèi)。

2.置37℃培養(yǎng)48-72小時(shí)（2-3天）。

3.觀察結(jié)果：取出后對(duì)光觀察，若沿穿刺線(xiàn)有黑褐色沉淀物，即表示該菌

能產(chǎn)生硫化氫（H2S）,否則反之。

【結(jié)果】

大腸桿菌：-（無(wú)黑色沉淀線(xiàn)生成）

傷寒桿菌：+（有黑色沉淀線(xiàn)生成）

七、尿素分解試驗(yàn)

【原理】

某些細(xì)菌如變形桿菌，具有尿素分解酶，能分解尿素而產(chǎn)生氨，氨溶于水變

成氫氧化鏤，使培養(yǎng)基變堿而呈紅色即為陽(yáng)性。

【材料】

1.菌種：變形桿菌，傷寒桿菌18-24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基。

【方法】

1.分別以斜面接種法將變形桿菌，傷寒桿菌接種于兩支尿素斜面培養(yǎng)基上。

2.置37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)。

3.取出觀察結(jié)果，培養(yǎng)基變?yōu)榧t色，即尿素分解試驗(yàn)陽(yáng)性，若不變色，即

為尿素分解試驗(yàn)陰性。

【結(jié)果】

變形桿菌：+；傷寒桿菌：-。

八、氧化酶試驗(yàn)

【原理】

某些細(xì)菌如奈瑟菌和綠膿桿菌，具有氧化酶（靛基酚氧化酶），能將氧化酶

試劑（鹽酸二甲基對(duì)苯二胺或四甲基對(duì)苯二胺）氧化成紅色的醍類(lèi)化合物，即為

氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性。

【材料】

1.菌種：淋球菌或腦膜炎球菌，白色葡萄球菌18-24小時(shí)巧克力斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：巧克力平板。

3.試劑：0.5-1%鹽酸對(duì)二甲基苯胺（或鹽酸二甲基對(duì)苯二胺或鹽酸對(duì)氨基

二甲苯胺）水溶液。

【方法】

1.將腦膜炎球菌或淋球菌，白色葡萄球菌分別接種于巧克力平板；

2.置37℃培養(yǎng)24小時(shí)后取出；

3.滴加新鮮配制的0.5-1%鹽酸對(duì)二甲基苯胺水溶液于固體培養(yǎng)基上；

4.觀察結(jié)果：加試劑后，若菌落出現(xiàn)紅色一深紅色一紫黑色變化均為陽(yáng)性;

反之陰性。

【結(jié)果】

腦膜炎球菌和淋球菌：+;白色葡萄球菌：-。

【注意事項(xiàng)】

1.此項(xiàng)試驗(yàn)應(yīng)避免含鐵物質(zhì)，因遇鐵會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。

2.試劑在空氣中易氧化，故應(yīng)新鮮配制。冰箱保存使用不超過(guò)兩周。

3.若要分離培養(yǎng)腦膜炎球菌，應(yīng)在菌落變成紫黑色之前立即轉(zhuǎn)種。否則細(xì)

菌容易死亡。

《附錄》

1.V-P試驗(yàn)劑的配制

甲液：a一祭酚6g95%灑精100ml

乙液：KOH40g肌酸0.3g蒸儲(chǔ)水100ml

2.甲基紅試劑的配制

甲基紅0.04g95%酒精60ml蒸儲(chǔ)水40ml

先使甲基紅溶解于酒精中，再加入蒸儲(chǔ)水，混合，搖勻即成。

3.歐立希(Ehrlich)試劑的配制

對(duì)位二甲基氨基苯甲醛4g

95%酒精380ml

濃硫酸或濃鹽酸80nli

三種成分混合即成，瓶口要嚴(yán)密，以免揮發(fā)。

4.蛋白陳水培養(yǎng)基的制備

成分：蛋白陳10g氯化鈉5g蒸儲(chǔ)水1000ml

制法：

(1)先用少量蒸儲(chǔ)水將蛋白月東和氯化鈉相混合溶解，再加足蒸儲(chǔ)水量。

(2)調(diào)節(jié)pH至7.6、用濾紙過(guò)濾。

(3)分裝中試管，每管約3-4ml,加塞滅菌后備用。

用途：供嗎I口朵試驗(yàn)用

5.單糖發(fā)酵管的制備

成分：蛋白陳水培養(yǎng)基100ml

0.2%酚紅1ml

所需糖(葡萄糖或乳糖)0.75-lg

制法：

(1)將上述成分溶化，混勻分裝于內(nèi)含有倒置小玻璃管的小試管中，每

管約2ml,加塞。

（2）小倒管排氣，滅菌（8-10磅，20-30分鐘），貯存?zhèn)溆谩?/p>

用途：供單糖發(fā)酵試驗(yàn)用。

附注：0.2%酚紅配制法

酚紅（phenolred）0.2g

1/10N苛性鈉（NaOH）8ml

蒸播水92ml

將酚紅入研缽徐徐加入苛性鈉研磨，再補(bǔ)足蒸儲(chǔ)水即成。若需長(zhǎng)時(shí)間保存,

可高壓滅菌后貯存?zhèn)溆谩?/p>

6.葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)物

成分：蛋白膝5g葡萄糖5g

制法：

（1）將上述成分溶解于蒸儲(chǔ)水中。

（2）調(diào)節(jié)pH至7.6,用濾紙過(guò)濾除渣。

（3）分裝中試管，每管約3-4ml,滅菌后備用。

用途：供甲基紅及V-P試驗(yàn)用。

7.枸椽酸鹽斜面培養(yǎng)基的制備

成分：磷酸二氫鏤0.1g磷酸氫二鉀0.1g

硫酸鎂0.02g枸椽酸鈉0.23g

氯化鈉0.5g瓊脂2g

蒸播水100ml0.5%漠麝香草酚藍(lán)酒精溶液2ml

制法：

（1）先將上述各種鹽類(lèi)溶解于蒸儲(chǔ)水中，使其完全溶解。

（2）矯正pH至6.8,然后加入瓊脂和指標(biāo)劑。

（3）搖勻，脫脂棉過(guò)濾，分裝中試管，每管約3-5面。

（4）滅菌后置成斜面?zhèn)溆茫ɡ浜鬄榫G色）

用途：供枸椽酸鹽利用試驗(yàn)用。

8.醋酸鉛培養(yǎng)基的制備

成分：2%肉湯瓊脂200ml硫代硫酸鈉0.05g

醋酸鉛10g蒸儲(chǔ)水100ml

制法：

(1)先將10g醋酸鉛加入100ml蒸儲(chǔ)水中融化，間歇滅菌或低壓菌后備

用(10%醋酸鉛溶液)。

(2)加熱溶化2%肉湯瓊脂200ml,加入硫代硫酸鈉0.05g,混合后高壓

滅菌。

(3)從高壓滅菌鍋取出，待冷卻至45℃左右時(shí)。無(wú)菌操作加入無(wú)菌的10%

醋酸鉛溶液1毫升，搖勻。

(4)分裝小試管，每管約2mL直立待冷凝后備用。

用途：供硫代氫生成試驗(yàn)用。

說(shuō)明：醋酸鉛與硫代硫酸鈉不宜久然。

9.尿素培養(yǎng)基的制備

成分：蛋白月東1g氯化鈉5g

葡萄糖1g蒸儲(chǔ)水900ml

瓊脂15~20g0.1%酚紅12ml

20%尿素水溶液(無(wú)菌)100ml

制法：(1)除尿素、瓊脂和酚紅外，其余成分溶于水中，加熱溶化，矯

正pH至6.8~6.9。

(2)加入瓊脂和酚紅，8~10磅10分鐘滅菌。

(3)冷卻至60℃后加入無(wú)菌尿素溶液，搖勻。

(4)分裝中試管(無(wú)菌)，每管3~4ml,置成斜面?zhèn)溆谩?/p>

用途：供尿素分解試驗(yàn)用。

說(shuō)明：(1)尿素不耐熱，也不能久存，只能用濾器除菌。

(2)無(wú)菌尿素溶液制備：稱(chēng)取尿素20g,混合于100ml蒸儲(chǔ)水中,

充分搖勻，用G6濾菌器過(guò)濾除菌，以達(dá)到無(wú)菌的目的。

10.巧克力色瓊脂平板的制備

成分：肉湯瓊脂100ml無(wú)菌脫纖維羊或兔血10ml。

制法：

(1)將肉湯瓊脂加熱溶化，趁熱加入脫纖維血，搖勻。

(2)傾注平板，待冷卻成巧克力色，備用。

用途：用于培養(yǎng)腦膜炎雙球菌或淋球菌。

說(shuō)明：加血一定要趁熱加。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容3：播放錄象一《細(xì)菌感染的檢查方法和防治原則》

第三次實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)四細(xì)菌分布及外界因素對(duì)細(xì)菌影響的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：L課堂上全部操作；

2.次日預(yù)約看結(jié)果

一、自然沉降法檢查空氣中的細(xì)菌

【材料】

普通瓊脂平板。

【方法】

取普通瓊脂平板一個(gè)，打開(kāi)皿蓋，讓培養(yǎng)基直接暴露于空氣中，置于實(shí)

驗(yàn)臺(tái)上或需要測(cè)定的地方15~30分鐘。蓋上皿蓋，用記號(hào)筆或蠟筆注明放置地點(diǎn)、

實(shí)驗(yàn)日期和實(shí)驗(yàn)者班級(jí)、姓名等，放入37℃溫箱培養(yǎng)18~24小時(shí)，觀察細(xì)菌的生

長(zhǎng)情況和數(shù)量。并分析其意義。

二、傾注法檢查水中的細(xì)菌

【材料與方法】

1.用無(wú)菌吸管吸取勝0.5ml水樣加入肉湯培養(yǎng)基中。

2.另取一支未接種的肉湯管做對(duì)照，與上管一起置于37℃溫箱培養(yǎng)

18~24小時(shí)，觀察結(jié)果。

【結(jié)果】

對(duì)照管應(yīng)透明清亮，試驗(yàn)管變混濁，說(shuō)明水樣中有活菌存在。并可通過(guò)

比濁法估計(jì)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖后的數(shù)量。

三、人體體表及各種物品表面的細(xì)菌檢查一拭子法和涂抹法

【材料】普通瓊脂平板。

【方法】

取普通瓊脂平板一個(gè)，在平板底面用記號(hào)筆或蠟筆將平板分成若干等

份，于每份培養(yǎng)基表面分別用手指、衣物、書(shū)本、筆等輕輕涂抹（不要擦破培養(yǎng)

基）。也可用無(wú)菌生理鹽水擦洗衣物等，用無(wú)菌棉拭子涂于培養(yǎng)基表面，蓋上皿

蓋，分別標(biāo)記清楚。置37℃溫箱培養(yǎng)18~24小時(shí)觀察結(jié)果。觀察各種物品中細(xì)菌的

數(shù)量及類(lèi)別，并分析其意義。

【注意事項(xiàng)】

本實(shí)驗(yàn)檢出的除細(xì)菌外，尚可能有真菌、放線(xiàn)菌等，請(qǐng)注意加以區(qū)別。

四、人咽喉部位的細(xì)菌檢查

【材料】血液瓊脂平板。

【方法】

1.咳碟法

取血液瓊脂平板一個(gè)，打開(kāi)皿蓋，將培養(yǎng)基面置于口腔前約10厘米處,

用力咳嗽數(shù)次（讓飛沫落在培養(yǎng)基表面），然后蓋上皿蓋，注明被檢查者姓名、

實(shí)驗(yàn)日期等。置37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)觀察結(jié)果。觀察細(xì)菌的數(shù)量、種類(lèi)等，注意

是否有溶血環(huán)，并分析其意義。

2.試子法

用無(wú)菌棉簽涂取扁桃腺兩旁的分泌物，在血瓊脂平板表面涂布成線(xiàn)，然

后改用接種環(huán)，作分區(qū)劃線(xiàn)接種，置37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)觀察結(jié)果。觀察細(xì)菌的

數(shù)量、種類(lèi)等。注意是否有溶血環(huán)，并分析其意義。

五、化學(xué)因素對(duì)細(xì)菌的影響（化學(xué)消毒劑的殺菌試驗(yàn)）

【材料】

1.菌種：葡萄球菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：普通瓊脂平板。

3.化學(xué)消毒劑：5%石炭酸、2%碘酒、70%酒精、0.1%升汞。

4.其他：直徑0.6cm無(wú)菌圓形濾紙片、小鑲子、接種環(huán)等。

【方法】

1.將瓊脂平板分為四等分，并在其底面做標(biāo)記。

2.用接種環(huán)取葡萄球菌瓊脂斜面培養(yǎng)物，密涂于整個(gè)瓊脂培養(yǎng)基表面。

3.用小鏡子夾取無(wú)菌小濾紙片，分別蘸取上述消毒劑（消毒劑不宜蘸得

過(guò)多，防止外流）。平貼于各相應(yīng)分區(qū)的中央，蓋上皿蓋，標(biāo)明日期和試驗(yàn)者。

4.置37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)后觀察各種化學(xué)消毒劑的殺菌作用。紙片周?chē)鸁o(wú)

細(xì)菌生長(zhǎng)的區(qū)域，稱(chēng)為抑菌圈，分別測(cè)量四種消毒劑抑菌圈的直徑，以毫米為單

位記錄之。

六、細(xì)菌的藥物敏感試驗(yàn)

【材料】

1.菌種：大腸桿菌，葡萄球菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：普通瓊脂平板。

3.分別含各種抗生素的直徑0.6cm的圓形紙片（青霉素、鏈霉素、紅霉素、

慶大霉素、卡那霉素）、小鏡子等。

【方法】

1.取瓊脂平板兩個(gè)，每個(gè)平板分為五等份，并做相應(yīng)標(biāo)記。

2.用接種環(huán)分別密涂大腸桿菌及葡萄球菌于兩個(gè)瓊脂平板培養(yǎng)基表面。

3.用小鑲子以無(wú)菌操作技術(shù)先夾取一無(wú)菌不含抗生素的濾紙片平貼于平板

中央，再分別夾取含抗生素的各種濾紙片平貼于各相應(yīng)區(qū)中央，蓋上皿蓋。注明

班級(jí)、姓名、日期等。

4.置37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)，觀察各種抗生素的抑菌情況。

5.抑菌程度判定：

抑菌程度的判定是依照濾紙片周?chē)?xì)菌的生長(zhǎng)與抑菌圈直徑大小來(lái)判定。

對(duì)藥物的敏感程度抑菌環(huán)直徑（mm）

不敏感無(wú)抑菌環(huán)

輕度敏感<10

中度敏感10-15

高度敏感>15

《附錄》

抗生素濾紙片的制備方法

1.取直徑0.6cm園形濾紙片，每100片置于一小平皿中，15磅滅菌20分鐘，

再置于烤箱（60~100℃）烘干。

2.取一定濃度的不同抗生素（見(jiàn)表1）分別注入裝有無(wú)菌濾紙片的小平皿內(nèi)，

每100片加入1ml抗菌素，浸泡半小時(shí)后，再置37℃溫箱中2~3小時(shí)干燥。干燥后

保存冰箱備用。有效期約一年左右。

表1常用幾種抗生素的濃度表_________________________________________

抗生素名稱(chēng)濃度（每毫升）標(biāo)記字樣/符號(hào)

青霉素200P青（P）

鏈霉素Img鏈(S)

紅霉素Img紅（E）

卡那霉素200H卡（K）

慶大霉素40U慶（G）

七、噬菌體的噬菌作用

噬菌體（bacteriophage）具有嚴(yán)格寄生性，對(duì)相應(yīng)的易感細(xì)胞，具有高度的

種特異性和型特異性。感染細(xì)胞后，或者裂解宿主細(xì)胞，或者處于溶原狀態(tài)?？?/p>

應(yīng)用噬菌體作細(xì)菌的鑒定、分型、檢查未知細(xì)菌和防治某些疾病。

【材料與方法】

1.噬菌體的溶菌現(xiàn)象

（1）取4支肉湯管，2支接種金黃色葡萄球菌，2支接種大腸桿菌。

（2）將上述兩種菌肉湯管各取1支，分別加入金黃色葡萄球菌噬菌體肉湯液

0.2mlo

（3）將上述4支肉湯管，置37℃培養(yǎng)6~12小時(shí)后觀察結(jié)果。

2.噬菌體的溶菌斑

（1）取普通瓊脂平板1只，分為4等分，注明①、②、③、④。

（2）用無(wú)菌棉簽在①、②處涂布接種痢疾桿菌，在③處接種大腸桿菌，在

④處接種白色葡萄球菌。

（3）在②、③、④處各加1小滴痢疾桿菌噬菌體肉泌液，在①處加1滴肉湯。

（4）置37℃培養(yǎng)16~18小時(shí)后觀察結(jié)果。

圖5噬菌體的溶菌斑

【結(jié)果】

1.溶菌現(xiàn)象加有噬菌體的金黃色葡萄球菌肉湯管清亮，其余均混濁。

2.溶菌斑如圖5,在②處的中央有一無(wú)菌生長(zhǎng)的空斑，即溶菌斑（或蝕斑），

其余部位無(wú)此現(xiàn)象。

八、紫外線(xiàn)的殺菌試驗(yàn)

【原理】

波長(zhǎng)240nm~280nm的紫外線(xiàn)，因與DNA吸收光譜一致，而具有明顯的殺菌

作用。其機(jī)制是使細(xì)菌DNA鏈中兩個(gè)相鄰的胸腺喀咤形成二聚體，從而破壞DNA

構(gòu)型，干擾其正常復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

【材料】

1.菌種：大腸桿菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：普通瓊脂平板。

3.無(wú)菌黑色圖案紙片，紫外線(xiàn)燈，消毒液。

【方法】

1.用接種環(huán)取大腸桿菌瓊脂斜面培養(yǎng)物，密涂于普通瓊脂平板培養(yǎng)基表面。

2.火焰滅菌小鑲子、待稍涼后，打開(kāi)平皿蓋，取無(wú)菌黑紙片一片平貼于涂

有細(xì)菌的平板培養(yǎng)基表面中間。

3.將平板暴露于距紫外燈管20~30cm處，打開(kāi)紫外線(xiàn)燈照射30分鐘。

4.照射完畢，無(wú)菌操作取出黑紙片，投入消毒液中，蓋上皿蓋，做標(biāo)記，

注明日期，試驗(yàn)者等。

5.置37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)，觀察培養(yǎng)基表面細(xì)菌生長(zhǎng)情況、并分析其結(jié)果。

【結(jié)果】

黑紙片遮蓋處細(xì)菌生長(zhǎng)形成灰白色菌苔，形狀同黑紙片形狀。直接暴露在紫

外線(xiàn)燈下的培養(yǎng)基表面無(wú)生長(zhǎng)或僅有少量的細(xì)菌生長(zhǎng)，形成菌落。

【應(yīng)用】

紫外線(xiàn)的殺菌力雖強(qiáng)，但穿透力弱，故僅用于實(shí)驗(yàn)室、手術(shù)室空氣及物體表

面的消毒滅菌。

【注意事項(xiàng)】

殺菌波長(zhǎng)的紫外線(xiàn)對(duì)人體皮膚，眼睛有損傷作用，使用時(shí)應(yīng)注意防護(hù)。

九、濾過(guò)除菌

【原理】

濾過(guò)是一種機(jī)械除菌法，主要用于一些不耐高溫液體的除菌，例如：血清、

毒素、抗毒素、藥物等。但濾過(guò)不能除去病毒、支原體和L型細(xì)菌。

【材料】

1.待濾的血清肉湯（燒瓶分裝、有菌）。

2.肉湯管

3.濾器（已滅菌）和過(guò)濾裝置、無(wú)菌刻度吸管和試管等。

【方法】

1.無(wú)菌取一環(huán)待濾血清肉湯接種于肉湯管內(nèi)。

2.將燒瓶中的血清肉湯倒入濾斗，啟動(dòng)抽氣機(jī)，減壓抽濾。濾畢，關(guān)閉抽

氣機(jī)。迅速以無(wú)菌刻度吸管吸取瓶中濾液，移置于無(wú)菌試管中。

3.無(wú)菌取一環(huán)濾液接種于另1管肉湯。

4.將2管肉湯置37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。

【結(jié)果】

接種待濾血清肉湯的管呈混濁，接種已濾血清肉湯的管澄清。

第四次實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1:血漿凝固酶試驗(yàn)（操作）

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2：腸桿菌科細(xì)菌的檢測(cè)（綜合實(shí)驗(yàn)一）

1）糞便材料的分離、培養(yǎng)一鑒別培養(yǎng)基；

2）次日，雙糖鐵培養(yǎng)基接種初步鑒定。

實(shí)驗(yàn)七病原性球菌的檢測(cè)

一、主要病原性球菌的形態(tài)、培養(yǎng)特征

【形態(tài)示數(shù)】

1.葡萄球菌（革蘭染標(biāo)本）：革蘭染色陽(yáng)性，為正圓形，呈葡萄串狀排列，

亦有單個(gè)散在分布。

2.鏈球菌（革蘭染色標(biāo)本）：革蘭染色陽(yáng)性，圓形或卵圓形，呈鏈狀排列。

3.肺炎雙球菌（小鼠腹腔液涂片，HiSS染色）：革蘭陽(yáng)性球菌，矛頭狀成

雙排列，平端相對(duì)，尖端相背。莢膜染色片中，菌體呈紅色，菌體周?chē)那v膜呈

淡紅色或無(wú)色。

4.腦膜炎雙球菌（腦脊液涂片，美蘭染色）：革蘭陰性球菌，腎形成雙排

列，凹面相對(duì)，菌體呈淺蘭色，多位于中性粒細(xì)胞漿內(nèi)，胞漿外也有少數(shù)散在分

布。

【培養(yǎng)特征】

1.葡萄球菌在血液瓊脂平板上的生長(zhǎng)表現(xiàn)：菌落為圓形，中等大小，表面

光滑，邊緣整齊，不透明；金黃色葡萄球菌菌落呈現(xiàn)金黃色，而白色葡萄球菌,

檸檬色葡萄球菌菌落呈白色或檸檬色（如菌落色素不易區(qū)別時(shí)，用白紙片沾菌落

少許有助觀察）；金黃色葡萄球菌的菌落周?chē)嘤型该魅苎h(huán)，而其他葡萄球菌

一般無(wú)溶血環(huán)（僅少數(shù)新分離白色葡萄球菌可呈現(xiàn)微溶血現(xiàn)象）。

2.鏈球菌在血液瓊脂平板上的生長(zhǎng)表現(xiàn)：除丙型鏈球菌外，菌落均較微小,

如針尖大，圓形，灰色，半透明。根據(jù)溶血性將鏈球菌分為三類(lèi)。甲型鏈球菌的

菌落周?chē)行〉牟菥G色溶血環(huán)，乙型鏈球菌有較大的透明溶血環(huán)，丙型鏈球菌不

溶血。

二、葡萄球菌血漿凝固酶試驗(yàn)（操作）

【原理】

血漿凝固酶試驗(yàn)是區(qū)別致病性葡萄球菌與非致病葡萄球菌的最重要指標(biāo)。致

病性葡萄球能產(chǎn)生血漿凝固酶，此酶的作用類(lèi)似凝血酶原，在血漿中激活劑的作

用下，可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘睦w維蛋白，從而導(dǎo)致血漿凝固（呈

現(xiàn)塊狀或顆粒狀）。非致病性葡萄球菌不產(chǎn)生此酶，因而不能凝固血漿。此酶有

兩種存在形式：結(jié)合于細(xì)胞壁上血漿凝固酶，采用玻片法測(cè)；游離形式的血漿凝

固酶，采用試管法檢測(cè)。

【材料】

1.金黃色、白色葡萄球菌瓊脂斜面18~24小時(shí)培養(yǎng)物。

2.1:2人或兔血漿。

3.生理鹽水、玻片、接種環(huán)等。

【方法】

1.取載玻片一張，用蠟筆分成三等份。

2.于第一、二格內(nèi)滴加入血漿各1滴，于第三格內(nèi)滴加生理鹽水1滴。

3.取金黃色葡萄球菌斜面培養(yǎng)物少許，分別混懸于第三格及第一格內(nèi)，取

白色葡萄菌混懸于第二格內(nèi)，分別研磨混勻。靜置2~3分鐘。

【結(jié)果】

第三格和第二格中細(xì)菌呈出均勻混濁，而第一格中細(xì)菌呈現(xiàn)塊裝或顆粒狀凝

固現(xiàn)象，即判定為血漿凝固酶陽(yáng)性。

三、抗鏈球菌溶血素“0”試驗(yàn)

【原理】

鏈球菌“0”溶血素是A族溶血性鏈球菌的代謝產(chǎn)物之一，能溶解人或兔的

紅細(xì)胞，對(duì)氧敏感，如與空氣中的氧接觸；能使蛋白質(zhì)上的-SH基氧化成-S-S基,

失去溶血活性。在實(shí)驗(yàn)中可借還原劑的作用，使它重新恢復(fù)溶血活力。

溶血素“0”具有很強(qiáng)的抗原性，人感染該菌后，2~3周產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，

此種抗體能中和溶血素“0”的溶血活力。因此，測(cè)定患者血清中抗鏈球菌溶血

素“0”抗體的效價(jià)，可作為風(fēng)濕熱等疾病的輔助診斷?？埂?”試驗(yàn)的效價(jià)是

指完全不溶血之血清最高稀釋度。

【材料】

1.患者血清：1：50稀釋

2.溶血素“0”及還原劑片劑（按說(shuō)明配制）

3.1%兔紅細(xì)胞

4.生理鹽水，試管、吸管，37℃水浴箱等。

【方法】

1.取清潔小試管5支，依次排列編號(hào)。

2.于第一管注入生理鹽水1.8ml,第二管0.1mL第三管0.2ml,第四管0.3ml,

第五管0.5ml。

3.于第一管注入0.2ml1：50稀釋的患者的血清，反復(fù)吹吸三次，混勻。吸

出0.4注入第二管，吸出0.3ml注入第三管，吸出0.2ml注入第四管，吸出0.6ml棄

去，第五管不加，作為對(duì)照管，此時(shí)，各管的血清稀釋度為1:500、1:625、1:833、

l:1250o

4.于每管注入還原溶血素“O”0.25ml,置37℃水浴15分鐘。

5.取出后于每管注入1%紅細(xì)胞懸液0.25ml,置37℃水浴45分鐘，觀察結(jié)果。

抗“O”試驗(yàn)操作表

材12345

管號(hào)

生理鹽水1.80.10.20.30.5（棄去0.6）

1：50稀釋血清(ml)0.20.40.30.2-

血清稀釋度1:5001:6251:8331:1250對(duì)照

還原溶血素“0”0.250.250.250.250.25

置37℃水浴45分鐘

1%紅血球0.250.250.250.250.25

置37℃水浴45分鐘

【結(jié)果】

先觀察對(duì)照管，再依次觀察試驗(yàn)管，溶血者上清呈透明紅色為抗“O”抗體

陰性。不溶血者呈均勻混濁為抗“O”抗體陽(yáng)性。以完全不溶血之血清最高稀釋

度作為抗體的效價(jià)。

效價(jià)在1：500單位以上者表示病人曾經(jīng)受過(guò)溶血性鏈球菌感染，多次試驗(yàn)逐

步增高者可作為活動(dòng)性風(fēng)濕病的輔助診斷。逐漸下降者，多處于緩解期。；恒定

不變者，多為非活動(dòng)期。

四、肺炎雙球菌小鼠毒力試驗(yàn)

肺炎球菌中，有少數(shù)菌不產(chǎn)生莢膜，故無(wú)致病力，具有莢膜的肺炎球菌致病

力強(qiáng)，小白鼠對(duì)肺炎球菌很敏感，故可用作肺炎球菌的毒力鑒定，同時(shí)可用以純

化肺炎球菌。

【材料與方法】

1.取20g左右重的健康小白鼠1只，腹腔或皮下注射肺炎菌菌液0.2ml,飼養(yǎng)

觀察。

2.待瀕臨死亡時(shí)，及時(shí)解剖，取心血接種血平板作細(xì)菌培養(yǎng)。

3.取其腹腔液涂片，作莢膜染色鏡檢。

【結(jié)果】

1.有毒力的肺炎球菌，能使小白鼠在注射菌液后12~36小時(shí)瀕臨死亡。

2.血培養(yǎng)可獲得肺炎球菌純培養(yǎng)物。

3.有毒力的肺炎球菌，莢膜染色鏡檢，可見(jiàn)有明顯的莢膜。

【注意事項(xiàng)】

1.在實(shí)驗(yàn)中要特別注意無(wú)菌操作。

2.實(shí)驗(yàn)中，可用無(wú)毒力的肺炎球菌作對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

五、臨床標(biāo)本中化膿性球菌的分離鑒定

從臨床標(biāo)本中分離鑒別化膿性球菌時(shí)，可根據(jù)各種化膿球菌不同的生物學(xué)特

征，直接涂片鏡檢、分離培養(yǎng)等方法，鑒定出未知的化膿球菌，不僅可為化膿性

感染的臨床診斷提供依據(jù)，而且可進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，為臨床選用有效的抗菌藥

物提供參考。

1.標(biāo)本的采集和處理

(1)膿標(biāo)本用無(wú)菌棉簽，蘸取患處深部膿液少許，置入無(wú)菌小試管內(nèi)，

送檢。

(2)痰標(biāo)本、用無(wú)菌棉簽，挑取病人膿稠痰塊，置放無(wú)菌小試管內(nèi)，送檢。

(3)咽喉部標(biāo)本令病人把口張大，用壓舌板壓住舌根部，用無(wú)菌棉簽，

迅速蘸取咽喉部分泌物，置入無(wú)菌小試管，送檢。

(4)血標(biāo)本疑為化膿性球菌敗血癥患者，在嚴(yán)格無(wú)菌操作下，靜脈采血

5n11,直接加入50ml的肉湯瓶?jī)?nèi)，立即搖勻，送檢。

(5)腦脊液標(biāo)本在嚴(yán)格無(wú)菌操作下，作腰椎穿刺取腦脊液，送檢。

2.檢驗(yàn)程序根據(jù)檢查的目的要求，按下圖所示，進(jìn)行檢查。

「形態(tài)

排列

（涂片染色鏡檢

結(jié)構(gòu)

、染色性

一菌落特點(diǎn)

膿、痰、咽喉拭子\，觀察生長(zhǎng)情況Y溶血性

病灶分泌物標(biāo)本\

、色素

涂片染色鏡檢

直接《

轉(zhuǎn)種液體,定向性

接種

【血平板培養(yǎng)基特殊試驗(yàn)

'生化反應(yīng)

TI挑選可疑菌落轉(zhuǎn)種血

Y動(dòng)物試驗(yàn)

斜面

、血清學(xué)試驗(yàn)

血液i（直接接種）、內(nèi)L

------------?肉湯瓶I藥敏試驗(yàn)

穿刺液J

（培養(yǎng)生長(zhǎng)后）

涂片染色鏡檢

【注意事項(xiàng)】

1.上面只表明一般的檢查原則，在實(shí)驗(yàn)檢查中，還需