DB32T-高粱屬品種鑒定 InDel分子標記法編制說明

地方標準編制說明一、目的意義簡述產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀，制定標準的必要性、可行性，預(yù)期經(jīng)濟社會效益分析等。（一）產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀我國高粱種植面積和產(chǎn)量正逐年增加。在中國釀造業(yè)拉動下，近年來高粱種植迅猛發(fā)展。高粱種植面積在2015-2021年間增幅58.86%，年均復(fù)合增長率約8.01%；產(chǎn)量增幅為42.26%，年均復(fù)合增長率約6.05%。高粱同時作為優(yōu)良的飼草，2021年全國工業(yè)飼料產(chǎn)量已達29344萬噸，環(huán)比增長5.4%。我國高粱產(chǎn)業(yè)化快速增長趨勢已帶動高粱種植業(yè)的顯著進步。江蘇作為我國釀酒產(chǎn)業(yè)強省之一，對高粱需求量大、品質(zhì)要求高。江蘇省蘇北洪淮地區(qū)因其人文、地理優(yōu)勢集中了多個國內(nèi)一流知名白酒企業(yè)（洋河、國緣等），2021年我省白酒產(chǎn)能已達10.18萬噸。但省內(nèi)現(xiàn)有高粱種植面積少，當前90%以上高粱原料依賴進口或外調(diào)，而原料品質(zhì)將直接影響最終白酒的產(chǎn)量及品質(zhì)，關(guān)系企業(yè)品牌價值。制定高粱品種鑒定技術(shù)規(guī)程，利于企業(yè)把控原料品種及品質(zhì)。不同風(fēng)味的白酒釀造所需高粱原料相差甚大，如醬香型貴州茅臺專用品種為紅纓子，而我省濃香和清香型白酒釀造的高粱原料以晉糯3號為主。流通的高粱品種不詳、品質(zhì)層次不齊的市場問題，顯著不利于我省白酒企業(yè)的原料品種和質(zhì)量把控。為了利于我省流通原料或種植高粱的市場監(jiān)管，制定高精準、短周期的高粱品種鑒定技術(shù)規(guī)程，嚴格把控高粱品種的準確性，迫在眉睫。相較于SSR分子標記，InDel標記分辨率和精準度更高、鑒定周期更短。SSR（Simplesequencerepeats）作為基因組的重要序列緩沖帶，保留了重組中的遺傳特征并廣泛用于遺傳多樣性分析，而SSR分子標記法仍存在片段差異小、難以精準分離/鑒定、操作性弱、分析效率低、運行成本高等缺點。InDel（Insertanddelete）是指一個基因型的基因組中相對于其他基因型有一定數(shù)量的核苷酸插入或缺失。根據(jù)InDel位點設(shè)計PCR引物的擴增標記即為InDel標記。該標記法優(yōu)勢在于：1).與目標基因功能關(guān)聯(lián)，更利于分子輔助篩選和鑒定；2).可篩選片段差異大于50bp，便于分離和精準鑒定；3).分離方式可使用最常見的瓊脂糖電泳，簡捷、方便，分析周期短，運行成本低。目前在番茄等作物中已制定該標記相關(guān)的國家行業(yè)標準（NY/T2471-2013）。（二）必要性與可行性當前江蘇省白酒釀造業(yè)的穩(wěn)定、可持續(xù)發(fā)展迫切需要更精準、更高效的高粱原料分子鑒定技術(shù)規(guī)程，而SSR分子標記法分辨率低、分析周期長的缺點一定程度限制了我省流通原料或種植高粱的快速、精準鑒定。本項目立足于InDel標記分辨率和鑒定準確度高、操作性強、鑒定周期短、運行成本低等優(yōu)勢，基于泛基因組分析技術(shù)自主開發(fā)、篩選出包含釀用、糧用和飼用高粱在內(nèi)的通用型InDel分子標記，為我省高粱屬品種分子鑒定及品種權(quán)保護提供更有利的技術(shù)創(chuàng)新?，F(xiàn)代分子遺傳研究方法可直接比對出基因InDels。2021年權(quán)威期刊Nature子刊最新高粱屬種質(zhì)泛基因組分析顯示，高粱屬種間（擬高粱、蘇丹草和甜高粱）基因結(jié)構(gòu)變異已超過64%，大量重要農(nóng)藝性狀變異與主效基因的InDel特征關(guān)聯(lián)。同時，泛基因組分析技術(shù)可直接篩選出編碼基因內(nèi)的結(jié)構(gòu)變異，例如位于1號染色體的yellowseed1基因編碼的MYB轉(zhuǎn)錄因子中存在大片段插入，造成不同高粱種質(zhì)內(nèi)外種皮顏色顯著變異。因此，依據(jù)泛基因組分析設(shè)計重要性狀的InDel標記，顯著有利于我省高粱屬育成品種的分子鑒定。（三）預(yù)期經(jīng)濟社會效益1.制定高粱屬的InDel分子標記品種鑒定方法，將更加有效地保護育種者權(quán)益，保護原始創(chuàng)新。經(jīng)查詢農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種業(yè)大數(shù)據(jù)平臺（45/bigdataNew/home/ManageOrg），當前高粱品種權(quán)申請數(shù)為176個，授權(quán)70個，已登記品種761個。隨著鄉(xiāng)村振興和地方特色經(jīng)濟的快速推進，高粱育種將更加活躍。高粱屬InDel分子標記品種鑒定方法將為品種DUS測試過程中的近似品種篩選、特異性輔助判定提供快速手段。2.制定高粱屬的InDel分子標記品種鑒定方法，將為規(guī)范高粱屬種業(yè)市場提供技術(shù)支撐。目前高粱的已登記品種942個，常年推廣應(yīng)用品種100多個。除釀用、糧用高粱外，飼用高粱等育成品種已出現(xiàn)蘇丹草雜交種“冀草6號”、高丹草“多糖”（甜高粱×蘇丹草雜交種）、擬丹草“蘇牧3號”（擬高粱×蘇丹草雜交種）等近/遠緣雜交后代。通用型InDel分子標記品種鑒定方法可為種子市場執(zhí)法檢查、糾紛鑒定提供快速、精準的依據(jù)與參考。3.制定高粱屬的InDel分子標記品種鑒定方法，將為高粱實質(zhì)性派生品種鑒定技術(shù)提供有益探索。實質(zhì)性派生品種的概念和保護已寫入新修訂的《種子法》。是指由原始品種實質(zhì)性派生，或者由該原始品種的實質(zhì)性派生品種派生出來的品種，與原始品種有明顯區(qū)別，并且除派生引起的性狀差異外，在表達由原始品種基因型或者基因型組合產(chǎn)生的基本性狀方面與原始品種相同。InDel分子標記品種鑒定方法可為快速分析遺傳親緣關(guān)系，利于實質(zhì)性派生系的鑒定。二、任務(wù)來源說明項目來源文件。本標準研制任務(wù)由江蘇省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出，根據(jù)《省市場監(jiān)管局關(guān)于下達2023年度江蘇省地方標準項目計劃的通知》（蘇市監(jiān)標〔2023〕173號），由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院承擔《高粱書品種鑒定InDel分子標記法》的制定工作，項目編號115。三、編制過程按時間節(jié)點或工作進度簡述編制過程。（一）起草階段2022年01-08月。高粱屬種質(zhì)資源收集及擴繁。收集全世界高粱屬種質(zhì)資源276份。其中105份來源于貴州省旱糧研究所，80份來源于國家農(nóng)作物種子資源中期庫（江蘇），91份來源于江蘇省牧草種質(zhì)資源庫。對276份高粱屬種質(zhì)進行浸種催芽、取樣和提取DNA。2022年08-12月。高粱屬InDel位點篩選。對已發(fā)表的13個參考基因組進行大片段比對并篩選片段>25bp的高頻二態(tài)性缺失位點，并依據(jù)染色體物體圖譜均勻分布的篩選原則，共計獲得有效InDel位點540個。2023年01-03月。高粱屬InDel位點引物篩選。對276份高粱屬種質(zhì)DNA等份混合獲得12個基因池，篩選560個InDel位點的引物，獲得高頻位點111個。2023年04-12月。高粱屬核心InDel標記的確定。優(yōu)化111個位點的引物至瓊脂糖電泳無雜帶后，對276份高粱屬種質(zhì)逐一進行分析，獲得遺傳多樣性矩陣。進行聚類等差異分析后發(fā)現(xiàn)，可完全區(qū)別276份高粱屬種質(zhì)。依據(jù)染色體物體圖譜均勻分布的篩選原則，每條染色體保留不同物理位置的標記共6條，且PCR擴增產(chǎn)物在1200bp之內(nèi)（熒光毛細管電泳的最大檢出區(qū)間），并結(jié)合對276份種質(zhì)的區(qū)分力，最終獲得60對InDel核心引物。2024年01-06月。核心標記測序和毛細管熒光電泳驗證。依據(jù)高粱屬Harlen&Wet的Bicolor/Caudatum/Durra/Guinea/Kafir分類法，挑選以上5類中的6個代表性種質(zhì)：BTx623、Rio、Tx430、紅纓子、甜高粱江蘇地方種和蘇丹草2098。對以上60對核心InDel引物的6個代表性種質(zhì)PCR擴增片段逐一基因Sanger測序驗證，測得序列Blast參考基因組后確定與設(shè)計位點的物理位置和序列相同，6個代表性種質(zhì)的測序片段比對后確認InDel真實存在，且無第三等位片段。對正向引物5’堿基進行6-FAM熒光標記修飾后，進行核心引物PCR產(chǎn)物的毛細管熒光電泳，擴增的PCR產(chǎn)物均能獲得清晰、穩(wěn)定的主峰，且易于識別，并確認6個代表性種質(zhì)的片段多態(tài)性與測序大小相符。（二）征求意見階段2024年07-08月。成立了由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所、貴州省旱糧研究所等單位組成的標準起草小組，經(jīng)研討修改形成標準征求意見稿。截止目前，已書面征求了科研教學(xué)、種子管理、新品種管理、種子檢驗機構(gòu)等方面20位高級職稱專家意見，共收到100條，采納58條，部分采納8條，不采納34條。根據(jù)相關(guān)意見修改形成送審稿。（三）審定階段暫無（四）報批階段暫無四、主要內(nèi)容技術(shù)指標確立簡述標準主要內(nèi)容技術(shù)指標確定的依據(jù)，包括實地調(diào)研、查閱資料、試驗論證等。（一）編制原則根據(jù)高粱屬品種的特點，按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部制定的《植物品種鑒定DNA分子標記法總則》標準編寫要求，采用以下原則編寫《高粱屬品種鑒定InDel分子標記法》：規(guī)范性原則：本標準的制定符合法律法規(guī)，符合有關(guān)標準要求，包括GB/T1.1-2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》、GB/T3543.1《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程總則》、GB/T3543.2《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程扦樣》、GB/T6682《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》。適用性原則：本規(guī)程的全部內(nèi)容具有可操作性，本標準適用于高粱屬各類（釀用、糧用和飼用）高粱及蘇丹草品種的鑒定。統(tǒng)一性原則：本規(guī)程與現(xiàn)行相關(guān)標準協(xié)調(diào)統(tǒng)一，不發(fā)生沖突。先進性原則：本規(guī)程采用利用國際前沿的泛基因組分析技術(shù)獲得高粱屬基因組二態(tài)性、大片段、高頻InDel位點并開發(fā)InDel標記，以瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合熒光毛細管電泳的高粱屬鑒定技術(shù)，證明采用InDel標記技術(shù)檢測高粱屬品種真實性可以保證檢測結(jié)果的規(guī)?；?、準確性和時效性。該方法的先進性在于檢測方法簡便、時間短、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析簡單、易實現(xiàn)數(shù)據(jù)共享、重復(fù)性穩(wěn)定性較高。（二）標準主要內(nèi)容1.樣品DNA提取方法鑒于市場流通的高粱多以種子形態(tài)為主，本標準除了采用常規(guī)CTAB提取葉片等組織樣品的DNA方法，還額外增加了SDS提取種子粉末DNA的方法，利于市場糾察中種子品種及純度的檢測。因高粱種子粉末內(nèi)淀粉和蛋白質(zhì)含量過高，常規(guī)的CTAB法提取后的DNA濃度低、雜質(zhì)多且完整性較差（圖1-1），相比SDS裂解法提取高粱種子粉末后的DNA濃度、純度和完整性更好（圖1-2）。圖1CTAB法和SDS法提取高粱種子DNA后的電泳比較。2.引物篩選利用已發(fā)表13個高粱屬不同種質(zhì)基因組序列與高粱測序品種BT×623參考基因組序列進行比對。利用軟件MUMmer進行大片段同源序列比對篩選目標區(qū)域中序列差異≥25bp的InDel位點560個，利用PrimerPremier6.0軟件設(shè)計InDel標記引物。引物設(shè)計的條件：PCR擴增產(chǎn)物長度為100-1200bp；變性溫度（Tm）在54-63℃之間；引物長度在18-30bp。本標準自主開發(fā)了一種快速預(yù)測Indel標記最小等位基因頻率的方法，在不需要逐一分析大群體中單個樣品的前提下，快速準確的測算出該標記的MAF值。具體方法為：將種質(zhì)資源分別提取DNA后，n數(shù)量基因型等份混池共獲得N個混池樣品，再分別對N個混池DNA進行特異引物的PCR，所得N個產(chǎn)物二次混池為一個最終產(chǎn)物，利用4%瓊脂糖進行電泳分離，對同一泳道上的不同Indel條帶強弱進行量化分析后，計算MAF（%）=Intensity(弱帶)/[Intensity(弱帶)+Intensity(強帶)]*100。預(yù)測MAF方法如圖1所示。因此，等體積取母液濃度為200ng/μL的單個種質(zhì)DNA并隨機混合13個種質(zhì)DNA于一個離心管內(nèi)即為一個混池DNA樣品，276個種質(zhì)共計獲得12個混池DNA樣品。利用合成的560對引物對12個混池DNA樣品進行PCR，擴增程序為63-57℃的降落PCR。擴增結(jié)束后將12個混池DNA的PCR產(chǎn)物混勻至一個離心管內(nèi)后，在進行4%濃度的瓊脂糖凝膠電泳。經(jīng)以上方法預(yù)測出111對InDel引物的MAF>5%。圖2高粱屬Indel標記MAF預(yù)測流程。3.核心引物的確定利用篩選出的111對高頻InDel引物對276份高粱種質(zhì)DNA進行逐一分析，依據(jù)其二態(tài)性獲得遺傳多樣性矩陣，并利用Neighbor-joining(NJ)聚類法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3-A所示。為了便于觀察引物的區(qū)分力，特在數(shù)據(jù)組中插入JS172VSJS172_2的重復(fù)對照，JS172和JS172_2的多態(tài)性數(shù)據(jù)完全相同。結(jié)果顯示，除JS172VSJS172_2（圖3-A，紅色）以外，其他種質(zhì)間均存在顯著遺傳距離，說明115對高頻InDel引物可完全區(qū)分276份高粱屬種質(zhì)。依據(jù)引物對物理位置、MAF值及兼容毛細管熒光電泳（最大片段<1200bp）的原則，優(yōu)選60對引物構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3-B所示。結(jié)果中仍然除JS172VSJS172_2（圖3-B，紅色）以外，其他種質(zhì)間均存在顯著遺傳距離，說明該60對引物的區(qū)分力足以辨別276份高粱屬種質(zhì)，特認定為核心引物，編號WS01-60。此外，將核心60對引物數(shù)量將至30個后的高粱屬種質(zhì)遺傳多樣性矩陣進一步構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3-C所示，出現(xiàn)了除JS172VSJS172_2對照外的大量種質(zhì)重復(fù)，說明縮減60對核心降低了種質(zhì)區(qū)分力。分別對以上60對引物的擴增產(chǎn)物進行Sanger雙向測序后并BLAST高粱屬測序品種BT×623參考基因組，確認其擴增序列染色體物理位置與設(shè)計位置相符。具體物理位置如圖4所示。依據(jù)高粱屬數(shù)據(jù)庫中品種間差異位點的分布，綜合考慮實際檢測過程中種子批次、試劑等對檢測結(jié)果的影響，結(jié)合DUS表型數(shù)據(jù)并參考國家行業(yè)標準，將檢測結(jié)果判定閾值定為2，當2個樣品差異位點數(shù)≤2時，判定為“疑同”；差異位點數(shù)＞2，判定為“不同”。圖3高粱屬276份種質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育樹對比。圖4高粱屬60對核心Indel標記染色體物理圖譜。4.引物帶型和峰型以4%瓊脂糖電泳對參考樣品BTx623、Rio、Tx430、紅纓子、甜高粱江蘇地方種、蘇丹草2098/蘇牧3號6組樣品的60對核心引物進行電泳，其電泳帶型如圖5所示。僅甜高粱江蘇地方種在WS11引物出現(xiàn)缺失位點，其他核心引物中至少有一份種質(zhì)的InDel多態(tài)性與其他種質(zhì)不同。WS04引物為擬高粱特異標記，僅在含有擬高粱遺傳背景的蘇牧3號中有特異帶。WS14引物中僅蘇丹草含有雜合帶型。以毛細管熒光電泳對以上參考樣品的60對熒光修飾引物PCR產(chǎn)物進行驗證，其WS04和WS05的毛細管全譜比較如圖6所示，譜圖中均檢測到顯著單峰。60對核心引物的熒光毛細管電泳單峰比較如7所示，所得PCR產(chǎn)物大小與Sanger測序結(jié)果相符。圖5高粱屬60對核心Indel標記的瓊脂糖電泳條帶圖。圖6高粱屬Indel標記毛細管熒光電泳全譜比較。圖7高粱屬60對核心Indel標記的毛細管熒光電泳單峰比較。5.DNA指紋數(shù)據(jù)庫的建立利用60對核心InDel引物對276份高粱屬種質(zhì)進行遺傳多樣性檢測，建立高粱屬品種保護InDel指紋數(shù)據(jù)庫。6組參考樣品BTx623、Rio、Tx430、紅纓子、甜高粱江蘇地方種、蘇丹草2098/蘇牧3號的InDel位點多態(tài)性大?。╞p）如表1所示。60對核心InDel引物MAF值范圍為2.8-49.3%，平均MAF值為29.21%。僅WS04標記MAF值＜5%，其他均高于5%。60對引物僅在WS11位點出現(xiàn)部分缺失，缺失率低，可用性好。表1高粱屬60對核心Indel標記遺傳多態(tài)性。引物名稱染色體位置參照品種InDel位點多態(tài)性（bp）MAF(%)BTx623RioTx430紅纓子甜高粱地方種a蘇丹草/b蘇牧3號1WS011115012312311501150a115043.11WS021241428428428428a42826.11WS031778778529529529a77827.51WS041816816816816816b3282.81WS05147711534771153477a115335.92WS061301301259301301a30110.11WS072351296296296296a29625.01WS082283496283496496a49633.31WS092132180180132180a13228.61WS102243243243590590a24339.51WS112277501277501/a27748.91WS122814814814515515a81423.91WS133278278355355355a35519.21WS143689418689418689ac418/68946.31WS153257529529257529a25732.61WS163195195567195195a19510.92WS1731141114111414261141a114140.02WS183959959644959959a95949.32WS194161161161209161a20944.91WS204158107158107107a15827.51WS214302302302219219a30240.21WS224539310310310310a53930.81WS234187187187435435a43529.31WS244263486486486486a48629.72WS255406190190190190a19015.91WS265123123150123123a12326.11WS275264362362264362a26443.52WS285193193193193193a87918.51WS295531531531170170a17014.51WS305211247211247247a21142.01WS316500149500500500a14919.21WS326491658658658658a65825.71WS336257257257502502a25743.81WS346597362362362362a36210.91WS356128168128128128a12823.61WS366498153153153153a15312.01WS377156156885885885a15637.31WS387298298485298298a2988.71WS3971005156156156156a15610.51WS407300300300300300a3486.91WS417396396396335335a33549.31WS427225225458225225a22521.01WS438184184184422422a18449.32WS448190190190190190a25638.81WS458373136136373373a37327.51WS468172172418418418a17244.61WS478416179179179416a41618.81WS488833833599599599a59919.91WS499353353353146146a35340.61WS509183123123123123a18316.31WS51943543543