DB34∕T 3208-2018 羊傳染性膿瘡病毒分離鑒定技術(shù)規(guī)程

DB34DB34/T3208—2018羊傳染性膿瘡病毒分離鑒定技術(shù)規(guī)程TechnicalRegulationforIsolationandIdentificationofGoatContagiousEcthymaVirus2018-10-20發(fā)布2018-11-20實(shí)施安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I心1NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技增殖表皮癌細(xì)胞（HeLa）、羊睪丸原代細(xì)胞（Lambtestiscells，LT）、DMEM培養(yǎng)基、M199液溫融解，反復(fù)三次。經(jīng)5000r/min離心10min，取上清，并加入青霉素和鏈霉素，終濃度為20002養(yǎng)液，用滅菌PBS清洗三次，接種1mL處理好的樣品，于5%C02培養(yǎng)箱，37℃下吸附2h,期間每隔30min輕輕搖晃一次。棄去樣品液，用滅菌PBS清洗三次，加入5mL細(xì)胞維持液(血清含量為2%),培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)5d。在培養(yǎng)過程中每日觀察細(xì)胞病變(CPE)產(chǎn)生情況，如出現(xiàn)CPE(特征同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照(見圖1)。A:病變的HeLa細(xì)胞；B:對(duì)照細(xì)胞圖1接種后第72小時(shí)病變的HeLa細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞10×將胰酶消化液徹底沖洗干凈，加入適量生長液(含10%血清的M199培養(yǎng)基),用玻璃珠振蕩法分散胞懸液，7mL/瓶(T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶),置37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。用滅菌PBS清洗三次，接種1mL處理好的樣品，于5%CO?培養(yǎng)箱，37℃下吸附1h,期間每隔15min為2%),培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4d。在培養(yǎng)過程中每日觀察CPE產(chǎn)生情況，如出現(xiàn)CPE,收集細(xì)胞培同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照(見圖2)。3A:病變的羊睪丸原代細(xì)胞；B:對(duì)照細(xì)胞B2Lgene上游引物：5’-CGGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTCCAT-3’B2Lgene下游引物：5’-CGGAATTCTTAATTTATTGGTTTGCAGAACTCC-3’利用DNA提取試劑盒提取待測樣品以及羊痘陽性病料DNA,以此作為PCR擴(kuò)增模板。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min;94℃45s,58℃45s,7性條帶(見圖3)。2M——DL2000Marker;1——待檢樣品；2——羊痘陽性病料；3——陰性對(duì)照。47.3