病毒及其疫苗的生產(chǎn)制備技術(shù)

25章病毒及其疫苗的生產(chǎn)制備技術(shù)第一節(jié)病毒的生產(chǎn)制備病毒需在活的敏感細(xì)胞中才能增殖，在細(xì)胞培育技術(shù)不成熟之前，人們?yōu)闋?zhēng)辯病毒廣泛的應(yīng)用，為病毒的生殖、鑒定供給了來(lái)自不同動(dòng)物〔包括人、不同組織的細(xì)胞來(lái)源，對(duì)病毒來(lái)說(shuō)只要有敏感的細(xì)胞，就可以進(jìn)展大規(guī)模生產(chǎn)。一、病毒生產(chǎn)的目的和用途1、為了制備大量的病毒抗原，以制備病毒的亞單位疫苗或外表抗原疫苗，或用病毒抗原制備免疫血清〔抗體。2、為了制備病毒的減毒活疫苗或滅活的死疫苗，以用于預(yù)防接種。3、為了生產(chǎn)基因改造后或重組有其它多肽因子的病毒，以用于基因治療或殺腫瘤治療及基因疫苗的預(yù)防接種。4、為了制備干擾素的病毒誘生劑ND、仙臺(tái)病毒等，用于干擾素的生產(chǎn)。5、生物戰(zhàn)用的病毒生物戰(zhàn)劑。常選用毒力強(qiáng)、抵抗力強(qiáng)、對(duì)不同國(guó)家人群最敏感的病毒，又能通過(guò)氣溶膠或昆蟲和污染的水土進(jìn)展傳播的病毒。這是戰(zhàn)斗狂們正在開展的爭(zhēng)辯，應(yīng)警覺(jué)。二、病毒生產(chǎn)制備的方法1、動(dòng)物接種，如狂犬病毒、腦炎蟲媒病毒承受鼠、兔腦內(nèi)接種后收取腦組織制成懸液。2、雞胚、鴨胚接種：如流感病毒、副流感病毒NDV-、仙臺(tái)病毒等，目前尚無(wú)敏感9～103772凝效價(jià)。Q7日齡鴨胚進(jìn)展卵黃囊接種收獲卵黃囊，馬腦炎病毒常承受10日齡雞胚體接種，收獲全胚體液等。3、細(xì)胞培育法〔18〕心收獲上清。以上病毒大量生產(chǎn)后可制作病〔死疫苗或減毒活疫苗劑或提取病毒外表抗原成分，但反對(duì)用作生物戰(zhàn)劑，危害人類安康和生命。其次節(jié)病的生產(chǎn)制備預(yù)防的疫苗有滅活疫苗〔KilledVaccine〕,又稱死疫苗，減毒活疫苗〔LiveVaccine〕,一、病的種類〔二倍體細(xì)胞與地鼠腎細(xì)胞可用于生產(chǎn)狂犬病病毒固定毒滅活疫苗病毒核酸而不影響其抗原性。腺炎疫苗、風(fēng)疹疫苗、黃熱病疫苗以及一些聯(lián)合疫苗〔如麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹聯(lián)合疫苗。(三)亞單位疫苗：用化學(xué)試劑裂解病毒，提取包膜或衣殼上的亞單位，除去其核酸，以苗。HBsAg的乙型肝炎疫苗或承受基因工程法制備HBsAg成的減毒活疫苗稱基因缺失的減毒活疫苗，如狂犬病毒的胸苷激酶〔TK〕缺失株〔第一代〕和gp3區(qū)缺失株〔其次代，單純皰疹病毒的22基因缺失株，目前有待進(jìn)一步爭(zhēng)辯。CHO細(xì)胞中抗原HBsAg的基因在酵母和CHOHBsAgHA、HBVI型和IIHSV、EBV，狂犬病毒等抗原基因，經(jīng)基因重組后而制成的牛痘苗病毒，經(jīng)一次劃痕接種可使機(jī)體同時(shí)能獲得對(duì)多種病毒的免疫力，大大削減了接種次數(shù)。此外腺病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒的活疫苗也可作為載體與輪狀病毒的抗原基因重組后的活疫苗，經(jīng)口服后可同時(shí)獲得兩種病毒的免疫力，有待于進(jìn)一步爭(zhēng)辯、開發(fā)。上述病有的是承受細(xì)胞培育技術(shù)和細(xì)胞工程來(lái)進(jìn)展生產(chǎn)制備的程制備病種類和敏感細(xì)胞以及生產(chǎn)方式規(guī)于下表?！踩绫?5-。25-1承受細(xì)胞培育法生產(chǎn)的常用病疫 苗 制備疫苗

培育方法名 稱 活/死(疫苗株) 的細(xì)胞脊髓灰 滅活〔Salk株〕 猴腎細(xì)胞〔原代/2-3代〕轉(zhuǎn)瓶培育質(zhì)炎疫苗腮腺炎疫 苗

活〔Sabin〕活〔ME〕Edomonste、

Vero幼地鼠、狗腎豚鼠腎細(xì)胞原代雞胚纖維母

微載體培育轉(zhuǎn)瓶培育羅氏瓶培育L16、滬191、細(xì)胞，人二倍體 羅氏瓶培育麻疹活疫苗 Moraten、Schwar2株

人羊膜、狗腎、羊腎豚鼠腎細(xì)胞

轉(zhuǎn)瓶培育單純瘡疹病巨細(xì)胞病

死〔72〕活〔Towne〕

兔腎、豚鼠腎豚鼠胚成纖維細(xì)胞WI-38

羅氏瓶培育轉(zhuǎn)瓶培育轉(zhuǎn)瓶培育狂犬病死〔AV01/AV02〕人二倍體細(xì)胞〔CUS〕

微載體培育流行性乙型腦炎疫苗森林腦炎病

滅活〔5-3〕滅活

人二倍體細(xì)胞雞胚纖維母細(xì)胞幼地鼠腎細(xì)胞

多層滋養(yǎng)增殖器轉(zhuǎn)瓶培育三、用細(xì)胞培育制備病的優(yōu)點(diǎn)：病的制備開頭多用動(dòng)物臟器、禽類胚胎〔第一代疫苗。然而因來(lái)源困難，很不經(jīng)濟(jì)，制作麻煩，數(shù)量受限，更危急的是這些組織中間可能含有潛在致癌病毒和慢性病毒，后改用原代細(xì)胞來(lái)制作疫苗〔其次代疫苗，如麻疹疫苗、乙腦疫苗等，隨著細(xì)胞培育的進(jìn)展70這比用原代細(xì)胞制備疫苗更優(yōu)越。如：在細(xì)胞傳代期間可進(jìn)展比較全面的檢查，特別是對(duì)潛在病毒和致癌性的檢查，確保安全。可使?jié)u漸適應(yīng)于無(wú)血清〔或無(wú)蛋白〕培基中生產(chǎn)生殖，以排解過(guò)敏因素。可選擇對(duì)病毒敏感的細(xì)胞克隆。以利病毒在細(xì)胞中大量增殖，有助于疫苗產(chǎn)量的提高。易于大量生產(chǎn)和進(jìn)展連續(xù)自動(dòng)化工業(yè)生產(chǎn)，以滿足量的需求。WI-38、MRC-5、IMR-90KMB-17、2BS、SL-7等均已用于疫苗生產(chǎn)，如麻疹活疫苗、乙型腦炎疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、腮腺炎疫苗等，從有一些病的制備還需用原代細(xì)胞，近年來(lái)有人主見(jiàn)用腫瘤細(xì)胞制備人用滅活疫苗。四、提高疫苗的效力常承受的方法：細(xì)胞的藥物處理：用某些藥物處理細(xì)胞后可以刺激病毒生殖〔如下表，其方法為：在細(xì)胞形成單層后，用一些化學(xué)藥物來(lái)處理，然后洗去，再接種病毒，就可使病毒提前成熟，產(chǎn)量高，現(xiàn)列表如下：處理細(xì)胞的藥物5-碘-2-脫氧尿核甙維生素ATween-80

刺激的病毒風(fēng)疹、腺病毒、巨細(xì)胞病SV-40脊髓灰質(zhì)炎病毒、濾泡性口腔炎病毒膽固醇或卵磷質(zhì)DEAE-dextran胰 酶二甲亞砜放線菌素D

脊髓灰質(zhì)炎病毒脊髓灰質(zhì)炎病毒、風(fēng)疹痘類病毒，付流感病毒痘類病毒、呼吸道腸道病毒，流感病毒、鼻病毒脊髓灰質(zhì)炎病毒、流感、皰疹病毒麻疹、脊髓灰質(zhì)炎病毒、付流感病毒在維持液中補(bǔ)充某些物質(zhì)也有利于某些病毒的復(fù)制、列表如下：增加的藥物Tween-80

乙型腦炎

刺激的病毒谷氨酰胺精氨酸脯氨酸、賴氨酸

麻疹、脊髓灰質(zhì)炎病毒、仙臺(tái)病毒痘類病毒、皰疹病毒乙型腦炎毒種的選擇：經(jīng)過(guò)空斑選擇產(chǎn)量高的大空斑毒株，精制毒種可提高病毒產(chǎn)量。病毒液的濃縮：經(jīng)濃縮后，病毒濃度增高，從而效價(jià)也隨之上升。五、影響疫苗質(zhì)量的因素：毒種：毒種的優(yōu)劣不僅影響疫苗的產(chǎn)量，而且也影響疫苗的質(zhì)量，毒種不純會(huì)產(chǎn)免疫效價(jià)高而長(zhǎng)久，抗原譜廣的，易增殖，便于生產(chǎn)，可在傳代細(xì)胞上傳代的毒種。培育病毒的細(xì)胞：細(xì)胞假設(shè)有潛在的致癌性病毒或慢病毒，以及有支原體污染均不能用作疫苗生產(chǎn)。對(duì)此因素應(yīng)嚴(yán)格檢查。此外假設(shè)細(xì)胞本身發(fā)生轉(zhuǎn)化后，不宜于制備活疫苗，只能制備一些滅活疫苗或亞單位疫苗。培育液：培育細(xì)胞的養(yǎng)分液中多少含有肯定量的血清蛋白，在疫苗使用中常會(huì)出甲醛滅活劑的使用：甲醛能使病毒滅活，但仍保持其抗原性，因此普遍用來(lái)制備滅活病，但要把握含量。病毒被滅活的程度與滅活的溫度和甲醛的濃度等因素有親熱關(guān)系。一般用熱滅活的方法，承受在37℃滅活肯定時(shí)間。經(jīng)熱滅活疫苗，不但其免疫原性、免疫效力和穩(wěn)定性不受影響，而且滅活病毒的溫度提高以后，滅活時(shí)間相對(duì)可以縮短，滅活劑的用量也可以削減。中和甲醛。這對(duì)削減注射后苦痛及便于推廣預(yù)防接種有重要意義。六、生產(chǎn)病毒和制備病的常用方法(一)制備工藝流程〔1〕脊髓灰質(zhì)炎病毒活疫苗制備工藝猴腎細(xì)胞培養(yǎng)←接種病毒〔0%正常細(xì)胞比照〕收獲病毒，合并，加MgCl→2無(wú)菌試驗(yàn)→←猴病毒檢查〔獲腎細(xì)胞B〔兔腎細(xì)胞〕→←病毒效價(jià)滴定←合并，過(guò)濾加MgCl2←無(wú)菌試驗(yàn)分亞批→←柯薩奇病毒檢查〔乳鼠〕病毒滴定→←型特異性檢查B〔家兔〕→←T分裝病毒滴定→←猴體剩余致麻痹力試驗(yàn)〔安全試驗(yàn)〕病理切片結(jié)核桿菌檢查→分裝→←無(wú)菌試驗(yàn)病毒滴定→保存于-20℃待檢定合格后加工糖丸脊髓灰質(zhì)炎活疫菌工藝流程2、流行性乙型腦炎病毒死疫苗制備工藝地鼠腎剪碎，胰酶消化地鼠腎細(xì)胞懸液37℃,3天細(xì)胞培育液，pH7.0～pH7.2單層細(xì)胞洗滌細(xì)胞，去除牛血清10-4～10-5濃度病毒感染細(xì)胞32～342～3收獲病毒液〔收二次〕1:202322℃，8滅活病毒液合并，安全及效力試驗(yàn)原液參加亞硫酸氨鈉半成品分裝成品檢定(包括理化性質(zhì)，無(wú)菌試驗(yàn)、安全試驗(yàn)，防腐劑、試劑及剩余牛血清含量等〕合格成品(二)生產(chǎn)方法：胞大量生產(chǎn)的方法和工藝均可用來(lái)生產(chǎn)病毒和病培育裝置，如轉(zhuǎn)瓶培育，因設(shè)備簡(jiǎn)潔，便于生產(chǎn)單位承受。而多層培育，微載體培育，目前生產(chǎn)病毒的技術(shù)。1、微載體懸浮培育細(xì)胞的病毒生產(chǎn)工藝作者選VSV病毒來(lái)接種經(jīng)微載體培育的敏感細(xì)胞，病毒的效價(jià)測(cè)定用A549細(xì)胞〔也可用Wish或Hep-2細(xì)胞或雞胚纖維母細(xì)胞測(cè)TCID，病毒的效價(jià)為6Log

/m L，50 50用雞胚細(xì)胞空斑法測(cè)定一般為107Pfu/mL。①VSV〔100mL10mL〕待BHK21、BHK13、CHO-K110-2VSV0.2ml，37℃120-30℃凍存，待測(cè)效價(jià)。②VSV微載體培育的BHK21BHK13、或CHO-K細(xì)胞，13～41×106細(xì)胞/mL30盡量吸去原培育基37℃10-2VSV50mL1mL37℃50r/min51〔202〕參加病毒維持液至原體積37℃連續(xù)20于-30℃凍融后2023r/min10收集上清，即為VSV增殖的病毒液，分裝凍存，待測(cè)效價(jià)VSV病毒不僅產(chǎn)量大，而且病毒效價(jià)平均高1LogTCID50

，尤以CHO-K1

效價(jià)最高，平均可達(dá)7.75logTCID50

比原先的毒種效價(jià)還要高1.75LogTCID，又起到了提高病毒效價(jià)的作用。50此方法也可應(yīng)用于生產(chǎn)病，只要疫苗株病毒的敏感細(xì)胞能在微載體上大量生產(chǎn)。此法生產(chǎn)的病毒可用甲醛滅活法制備死疫苗。2、轉(zhuǎn)瓶培育法，麻疹疫苗等。將細(xì)胞制備成懸液后，在溫室內(nèi)〔37℃〕8～12轉(zhuǎn)/小時(shí)緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)，以使細(xì)胞貼壁，當(dāng)參加病毒后，