DNA樣品制備方法 沉淀法

2T/SHAIAXXXX—XXXX甲基化分析中的DNA樣品制備方法沉淀法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了組織和培養(yǎng)的細(xì)胞等生物樣本中DNA甲基化分析的樣品制備方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于從組織和培養(yǎng)的細(xì)胞中提取DNA用于甲基化分析。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1DNA甲基化（DNAmethylation）是基因表達(dá)調(diào)控的一種重要機(jī)制，是在不改變DNA序列的前提下對(duì)基因組DNA進(jìn)行甲基化修飾。4原理DNA甲基化檢測(cè)可以采用的方法比較多，PCR法是比較是比較簡(jiǎn)單易行的方法之一。原理是利用亞硫酸氫鹽處理DNA，將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶在轉(zhuǎn)化過(guò)程中保持不變。轉(zhuǎn)化后，DNA的甲基化情況可以通過(guò)PCR擴(kuò)增或DNA測(cè)序來(lái)判定。在PCR法檢測(cè)中DNA的純化最常用的的方法是沉淀法。除上述比較經(jīng)典的沉淀法以還有有物理的方法：如玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法?；瘜W(xué)方式如異硫氰酸胍法、堿裂解法。生物方式如酶法，根據(jù)核酸分離純化方式的不同有硅質(zhì)材料、陰離子交換樹(shù)脂等。沉淀法是在去污劑的作用下將細(xì)胞裂解，然后在細(xì)胞裂解也中加入SDS加速細(xì)胞破碎，再加入酒精將DNA沉淀，采用蛋白酶K和氯仿/異戊醇去除蛋白質(zhì)，得到純化的DNA。5儀器設(shè)備5.1高速臺(tái)式離心機(jī)，5.2高速冷凍離心機(jī)，5.3紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，5.4紫外及化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀。5.5超純水系統(tǒng)6試劑和材料6.2.純凈水ddH2O，電阻率>18Ω（分子生物學(xué)級(jí)）3T/SHAIAXXXX—XXXX）（），6.4.苯酚（分子生物學(xué)級(jí)6.5氯仿（分子生物學(xué)級(jí)）。7樣品7.1樣品來(lái)源：甲基化檢測(cè)的樣品可以來(lái)源于血液、冷凍組織樣本或石蠟組織塊。用于甲基化分析的樣品應(yīng)采用冷凍和其他適當(dāng)?shù)姆椒ū４媪己靡苑罉悠方到狻?.2樣品處理：采用細(xì)胞裂解液或其他適當(dāng)?shù)脑噭┨崛〖?xì)胞和組織中的DNA，進(jìn)一步將DNA與蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)等分離并采用苯酚-氯仿或其他適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ绯恋矸ǖ燃兓疍NA，純化后的DNA經(jīng)95%或100%酒精再次沖洗沉淀，獲得的DNA沉淀采用純凈水再次溶解備用。8DNA樣品制備試劑配制9DNA樣品分析DNA純度檢測(cè)一半采用分光光度法在波長(zhǎng)260nm對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)可以通過(guò)測(cè)定DNA樣品在260/280（A260/A280）的紫外吸收值估算DNA的純度，其比值在1.8為純度較好，其比值高于2.0預(yù)示著樣品中有RNA沒(méi)有除盡。同時(shí)也可以采用凝膠電泳的方法檢測(cè)DNA的純度，并檢測(cè)樣品中是否有RNA存在。4T/SHAIAXXXX—XXXXXXXXXXXXX核酸提取方法主要包括以下幾種：1、沉淀法。通過(guò)采用細(xì)胞裂解液破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)來(lái)釋放核酸，采用化學(xué)試劑將細(xì)胞中的DNA提取出的方法。2、化學(xué)試劑法。利用核酸和雜質(zhì)在水和有機(jī)溶劑中的溶解度差異進(jìn)行分離提純。該方法使用異硫氰酸胍和乙醇/異丙醇來(lái)沉淀水相中的核酸。3、柱純化法。利用二氧化硅材料吸附原理，在高鹽濃度下，通過(guò)帶正電荷的二氧化硅柱膜和帶負(fù)電荷的核酸之間的親和力，使核酸被富集于二氧化硅基質(zhì)，其他雜質(zhì)被清除。4、磁珠法。利用磁珠與核酸的特異性結(jié)合，通過(guò)磁場(chǎng)作用進(jìn)行分離。此外，還有吸附材料結(jié)合法，如硅質(zhì)材料、陰離子交換樹(shù)脂和磁珠，這些方法利用核酸與吸附材料之間的特異性結(jié)合進(jìn)行分離。每種方法都有其特定的應(yīng)用和優(yōu)勢(shì)，選擇哪種方法取決于實(shí)驗(yàn)的具體需求和條件。沉淀法提取DNA：從組織或培養(yǎng)的細(xì)胞中分離DNA1.將組織切成小塊，培養(yǎng)的細(xì)胞直接進(jìn)行下一步。），最終濃度20ug/ml，在37℃下孵育1小時(shí)。3.加入蛋白酶K至最終濃度100ug/ml，充分混合，在50℃下孵育3小時(shí)或過(guò)夜。4.在室溫下冷卻溶液，加入等體積的苯酚（pH8.0），通過(guò)緩慢地將管端翻轉(zhuǎn)10分鐘或?qū)⒐芊胖迷跐L筒設(shè)備上混勻1小時(shí)，將兩相輕輕混合。5.將試管在10000g下離心15分鐘。6.將水相（上層）轉(zhuǎn)移到新試管中。7.在室溫下加入0.2倍體積的10mol乙酸銨（NH4Ac）和2倍體積的100%乙醇，輕輕混合。如果使用NaAc（pH5.2），則添加0.1