DB12∕T 839-2018 茄子種子純度SSR分子標(biāo)記鑒定方法

津津天茄子種子純度SSR分子標(biāo)記鑒定方法天津市市場(chǎng)和質(zhì)量監(jiān)督管理委員會(huì)發(fā)布發(fā)布實(shí)施本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.12009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市農(nóng)村工作委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所、天津市蔬菜研究中心、黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：蘭青闊、王利英、趙新、王成、蘭璞、喬軍、劉婧、陳銳、關(guān)海濤、張耀中、焦賀敏。DB12/T839—2018茄子種子純度SSR分茄子種子純度SSR分子標(biāo)記鑒定方法下列文件對(duì)于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了茄子種子純度SSR分子標(biāo)記鑒定方法的原理、儀器設(shè)備及試劑、方法步驟、純度計(jì)算。本標(biāo)準(zhǔn)適用于茄子單交種的純度鑒定。DB12/T839—2018由幾個(gè)核苷酸（1?6個(gè)）為重復(fù)單位聚集而成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)至幾百個(gè)bp(般為100?200)的串聯(lián)重復(fù)序列，又稱微衛(wèi)星序列或短串聯(lián)重復(fù)序列，其高度多態(tài)性主要來(lái)源于串聯(lián)數(shù)目的不同。下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。種子在SSR分子標(biāo)記帶型方面典型一致的程度，用具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)占鑒定樣品種子粒數(shù)的百分率表示，以反映某品種特征特性的一致性程度。一種在體外通過(guò)酶促反應(yīng)擴(kuò)増?zhí)禺怐NA片段的技術(shù)。以蛋白質(zhì)、核酸分子的多態(tài)性為基礎(chǔ)，鑒定生物在遺傳上的差異。SSR分布于茄子整個(gè)基因組，每個(gè)位點(diǎn)上重復(fù)單位的數(shù)目不同造成了品種間的多態(tài)性，利用PCR技術(shù)將多態(tài)的SSR擴(kuò)増出來(lái)，通過(guò)電泳檢測(cè)擴(kuò)増產(chǎn)物，利用電泳圖譜進(jìn)行茄子種子純度鑒定。微量加樣器；磁力攪拌器；臺(tái)式離心機(jī)；紫外-可見(jiàn)成像系統(tǒng)；膠片觀察燈；水平搖床；高壓滅菌鍋； 水或符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水等。除特殊說(shuō)明外，所用試劑均為分析純?cè)噭?。檢測(cè)樣品的分樣和保存，應(yīng)符合GB/T3543.2的規(guī)定，從中隨機(jī)取100粒以上種子，取其父母本材料在玻璃培養(yǎng)皿底部墊上一層厚度約3mm的棉花或?yàn)V紙，用水浸濕后均勻地撒上檢測(cè)樣品，再于表面覆蓋一層紗布，置于光照培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)條件為16h35°C光照培養(yǎng)，8h28°C暗培養(yǎng)，待種子長(zhǎng)出子葉后備用。取單株幼苗子葉，放入1.5mL離心管中，在液氮中研碎，放入1.5mL離心管中。將DNA提取液預(yù)熱到65°C，每管放入400混合樣品，將離心管置于65°C金屬浴或水浴鍋相關(guān)溶液配制方法見(jiàn)附錄ADB12/T839—2018補(bǔ)性好的引物作為純度鑒定的SSR分子標(biāo)記?；靹?。按照附錄C規(guī)定的方法，進(jìn)行4.5%變性聚丙烯酰胺凝膠制作及電泳檢測(cè)擴(kuò)増產(chǎn)物。DB12/T839—2018檢測(cè)樣品種子粒數(shù)X°以篩選出來(lái)的SSR分子標(biāo)記為引物擴(kuò)増送檢樣品的DNA，通過(guò)帶型統(tǒng)計(jì)，用具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)占檢測(cè)樣品種子粒數(shù)的百分率表示純度，計(jì)算公式如下：具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)1mL剝離桂焼，49mL二氣甲焼。20pL親和桂焼，201mL剝離桂焼，49mL二氣甲焼。20pL親和桂焼，20^L冰醋酸，加無(wú)水乙醇至2mL?，F(xiàn)用現(xiàn)配。0.1g過(guò)硫酸銨溶于1mL超純水中?，F(xiàn)用現(xiàn)配。丙烯酰胺190g，甲叉雙丙烯酰胺10g，定容至500mL。尿素450g，10X電泳緩沖液100mL，40%丙烯酰胺膠112.5mL，定容至1000mL。汽滅菌后使用。按照引物合成單的說(shuō)明先配制100^mol/L的儲(chǔ)存液，取適量?jī)?chǔ)存液稀釋40倍，配制濃度為2.5mmol/L的使用液。附錄ADB12/T839—201820002000mL蒸饋水中加入40g氫氧化鈉和10mL甲酸。DB12/T839—20184g硝酸銀，定容至2000mL200mL冰醋酸，定容至2000mLDB12/T839—201815對(duì)核心引物見(jiàn)表B.1。待膠凝固后，拔出梳子，將電泳槽組裝好，待膠凝固后，拔出梳子，將電泳槽組裝好，用洗耳球吹洗加樣槽，清除氣泡和雜質(zhì)。每個(gè)加樣孔加入5^L變性后的PCR產(chǎn)物。80W恒功率電泳至上部的指示帶（二甲苯青）到達(dá)膠板的中部。電泳結(jié)束后，小心分開(kāi)兩塊玻璃板，凝膠緊貼在長(zhǎng)板上。將長(zhǎng)板置于固定液中輕輕晃動(dòng)3min;雙蒸水快速漂洗1次，不超過(guò)10s;