THBIQA 0003.5-2024 食品中常見高組胺魚源性成分檢測方法 第5部分：竹筴魚實時熒光PCR法

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T/HBIQAT/HBIQA0003.5—2024食品中常見高組胺魚源性成分檢測方法5PCRDetectionofcommonHistamine-richfishderivedingredientinfoodPart5:TrachurusjaponicusReal-timePCRmethod2024-08-15發(fā)布 2024-10-15實施河北省檢驗檢疫學會發(fā)布T/HBIQA0003.5—2024T/HBIQA0003.5—2024前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。T/HBIQA0003-2024《食品中常見高組胺魚源性成分檢測方法實時熒光PCR法系列標準》分為7個部分：1PCR2PCR3PCR4PCR5PCR6PCR法第7部分：藍點馬鮫實時熒光PCR法T/HBIQA0003.5-20245本文件起草單位：石家莊海關技術中心、河北三獅生物科技有限公司。T/HBIQA0003.5—2024T/HBIQA0003.5—2024PAGEPAGE2食品中常見高組胺魚源性成分檢測方法第5部分：竹筴魚實時熒光PCR法范圍本部分規(guī)定了食品中竹筴魚源性成分的實時熒光PCR檢測方法。本部分適用于食品中竹筴魚源性成分的定性檢測。本部分所規(guī)定方法的最低檢出限（LOD）為0.1%（質量分數）。（）GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T27403實驗室質量控制規(guī)范食品分子生物學檢測術語和定義下列術語和定義適用于本標準。竹筴魚Sardinapilchardus屬于鱸形目（Perciformes），鲹科（Carangidae）,竹筴魚屬。實時熒光PCR real-time在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監(jiān)控整個PCR擴增過程。Ct值 cyclethresholdvalue每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環(huán)數?？s略語下列縮略語適用于本文件。PCR（Polymerasechainreaction）DNA（deoxyribonuleicacid）NADH-6NADH6基因dNTP（deoxyribonucleosidetriphosphate）CTAB（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三羥甲基（tris（hydroxymethyl）aminomethane）EDTA（ethylenediaminetetraaceticacid）FAM（carboxyfluorescein）BHQ11原理實時熒光法是在提取樣品NADH-6光定性分析。試劑和材料GB/T6682。表1引物和探針序列名稱序列（5′-3′）目的基因內參照F:TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA真核生物18SrRNA基因R:AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTP:FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-BHQ1竹筴魚F：CCCTCCATGCCCCACAANADH-6基因R：TGCTGCACTTGGGTTGGTAGTP：FAM-ACGCCACACCCCATTCCCGC-BHQ1CTAB裂解液：20g/LCTAB，0.1mol/LTris-HCI（pH8.0），1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA（pH8.0）。CTAB沉淀液：5g/LCTAB，40mmol/LNaCl。蛋白酶K（20mg/mL），-2075%熒光預混液（2×）。TE（Tris-Cl、EDTA）：10mmol/LTris-HClpH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。儀器和設備儀。12000g。7.5 （0.1μL～2.5μL,1μL～10μL,10μL～100μL,20μL～200μL,100μL～1000μL）。pH0.1。0.01g。均質器。檢驗步驟樣品前處理魚罐頭、魚腸、魚丸等食品取肉糜300mg，置于三氯甲烷:甲醇:水混合溶液(1:2:0.8)中室溫孵育過夜，去除油脂的肌肉組織可用于核酸提??；魚肉、魚排、魚糜等魚肉制品取300mg，用生理鹽水清洗后，放入研缽中，在研缽中倒入液氮，將樣品在液氮中研磨成粉末或用冷凍研磨儀研磨成粉末。DNA50mg2mL1.5mL10μLK，min12000r/min5400μL:12000r/min5，吸取上清液至另一新離心管中，加入0.8倍體積異丙醇，混勻后室溫下靜置1h12000r/min1050μLDNA-20℃DNADNA。DNA取適量DNA溶液原液，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別測定260nm和280nm處的吸光值A260和A280。DNA的濃度按照公式（1）計算：c=A260×N×50 （1）公式（1）中：c ——DNA（μg/μL）；A260——260nm處的吸光值；N ——當A260/A280比值在1.7～2.0之間時，適宜于實時熒光PCR擴增。實時熒光檢測實時熒光反應體系實時熒光PCR反應參數見表2。每個樣品各做兩個平行管，可先將反應試劑及引物預混成混合液。表2 實時熒光PCR反應體系試劑名稱終濃度反應體系/μL熒光PCR預混液（2×）1×12.5F(10μmol/L)400nmol/L1R(10μmol/L)400nmol/L1P(10μmol/L)400nmol/L1DNA模板(50-100ng/μL)—2.0補水至—25擴增條件混勻離心后置于實時熒光PCR儀上進行擴增，擴增條件為：95℃預變性30s；95℃15s，60℃35s（收集熒光信號），40個循環(huán)。不同儀器可根據儀器要求將實時熒光PCR反應條件作適當調整。試驗對照檢驗過程中分別設陽性對照、陰性對照和空白對照。以竹筴魚提取的DNA為陽性對照，以已知不含有竹筴魚的樣品提取的DNA為陰性對照，以滅菌水為空白對照。樣品、陽性對照、陰性對照、空白對照各設置兩個平行。質量控制以下條件有一條不滿足時，實驗視為無效：Ct>40.0。Ct>40.0。Ct值<30.0。Ct值＜30.0。結果判定在符合第9章的情況下，被檢樣品進行檢測時：Ct值≤35.0A；Ct值≥40.035.0＜Ct值＜40.0Ct值仍為＜40.0，且出現典型擴增曲線，Ct值≥40.0結果表述防污染措施檢測過程中防止交