AbMole局部氫氣釋放重塑衰老微環(huán)境促進受傷骨骼修復的實驗研究

AbMole|局部氫氣釋放重塑衰老微環(huán)境促進受傷骨骼修復的實驗研究隨著人口老齡化的加劇，衰老相關疾病的治療成為了醫(yī)學界關注的焦點。骨骼衰老和損傷后的修復困難是老年人面臨的重要問題之一。來自中國科學院深圳先進技術研究院神經工程研究中心的ShengqiangChen,YuanmanYu,SongqingXie等多名研究人員發(fā)表了題為《LocalH2releaseremodelssenescencemicroenvironmentforimprovedrepairofinjuredbone》的研究成果，文章探討局部氫氣（H?）釋放對衰老骨骼微環(huán)境的重塑作用及其對受傷骨骼修復的影響。在該文章中，研究人員使用了購自AbMole的ruxolitinib（目錄號M1787）、quercetin（目錄號M3902）、dasatinib（M1701）。細胞分離與培養(yǎng)：從24個月大的衰老小鼠（相當于70歲的人）的骨骼中分離出骨髓間充質干細胞（BMSCs）、巨噬細胞和骨細胞，并進行鑒定和培養(yǎng)。持續(xù)H?供應的體外實驗：將分離出的細胞在60%氫氣培養(yǎng)箱中連續(xù)孵育7天，模擬體外持續(xù)H?供應微環(huán)境，檢測代表性衰老生物標志物（ROS、HO-1、p16、p21、Ki67、γ-H2A.X、TAFs、SA-β-gal、IL-6和IL-1β）的表達，評估H?對細胞衰老和炎癥的影響。圖1：可持續(xù)H的體外抗炎和抗衰老行為2治療衰老骨骼中的各種衰老細胞。持續(xù)H?釋放支架的構建與表征：合成聚羥基鏈烷酸酯（PHA）包裹的CaSi?納米顆粒（CSN），并將其負載到介孔生物活性玻璃（MBG）支架上（CSN@PHA-MBG），通過電噴霧法制備出具有高H?負載和持續(xù)H?釋放能力的支架。圖2：CSN和CSN@PHA-MBG支架的結構和氫釋放行為。體內實驗：建立老年小鼠（24個月大）臨界尺寸股骨塞缺損模型（直徑1.2mm的圓形缺損），評估CSN@PHA-MBG支架在體內的氫釋放行為、對局部炎癥的影響以及對衰老和免疫調節(jié)的作用?？寡装Y和抗衰老作用：與從年輕骨骼中采集的細胞相比，衰老骨骼中的細胞表現出明顯的衰老特征，包括細胞內ROS、p16、p21和SA-β-gal的過度表達，以及HO-1和Ki67的低表達。γ-H2A.X焦點與TAFs共定位。連續(xù)7天的H?處理顯著下調了所有這些衰老生物標志物的表達，進一步促進了HO-1活性和Ki67表達，表明H?具有強大的普遍抗衰作用。對SASP成分的影響：H?降低了所有研究類型細胞中IL-6和IL-1β的水平，特別是在第3天和第7天顯著下調了IL-6的表達，在BMSCs和巨噬細胞中顯著降低了IL-1β的表達。圖3：支架處理7天后衰老骨缺損部位的SASP成分分析。對巨噬細胞極化的作用：H?在7天的處理過程中將巨噬細胞從M1表型（CD86和iNOS）極化為M2表型（CD206、Arg1和Il-10），TNF-α水平與TGF-β1水平的比值顯著下降，表明H?誘導了巨噬細胞從促炎亞型向抗炎亞型的轉變。對BMSCs再生潛力的影響：H?處理顯著阻止了BMSCs衰老的進展，減少了SA-β-gal陽性細胞的數量，降低了衰老相關基因（p16、p21和p53）的表達，同時抑制了衰老細胞對破骨細胞生成的影響，保存了BMSCs的成骨分化潛力，表現為成骨相關基因（Runx2、Osterix、Alp、Opn、Col.I和Ocn）的表達增強和礦化程度的提高。圖4：CSN@PHA-MBG支架對受傷衰老骨骼中BMSC募集和衰老的影響。CSN的合成與表征：通過微波輔助化學剝離法合成了CSN，其尺寸約為500nm，化學剝離未改變CaSi?的化學組成和晶體結構，CSN在pH=7.4的PBS中能水解釋放大量H?，但會在一天內完全降解。CSN@PHA-MBG支架的制備與表征：通過將PHA包裹的CSN沉積在MBG底物的多孔表面上，制備出CSN@PHA-MBG支架。該支架具有持續(xù)的H?釋放特性，釋放時間長達7天，且具有高細胞相容性。CSN@PHA-MBG支架能顯著降低BMSCs中SA-β-gal的表達，其最低有效CSN含量（或氫劑量）約為70μg/g。局部持續(xù)氫釋放對衰老骨骼微環(huán)境和巨噬細胞極化的影響：CSN@PHA-MBG支架在體內的氫釋放時間長達9天，比在PBS中更長。在植入后的第3天和第7天，植入部位出現了強烈的綠色熒光（F4/80標記的巨噬細胞），表明存在炎癥現象。與對照組和PHA-MBG載體組相比，CSN@PHA-MBG支架具有強大的抗炎作用，表現為iNOS表達降低（M1巨噬細胞表型的生物標志物）、ARG1水平升高（M2巨噬細胞表型的生物標志物）和纖維化減少。p16陽性細胞的比例隨著時間的推移而增加，顯示出衰老的旁觀者效應，但CSN@PHA-MBG顯著且穩(wěn)定地減輕了衰老/損傷疊加衰老的進展。巨噬細胞中p16陽性表型較高，H?持續(xù)釋放至7天在防止巨噬細胞衰老和介導免疫反應中發(fā)揮了重要作用。CSN@PHA-MBG更顯著且穩(wěn)定地降低了M1表型和M2表型巨噬細胞數量的比例，在第7天誘導了高比例的M2表型巨噬細胞浸潤（約40%），表明微環(huán)境從促炎向抗炎的有效轉變，有利于衰老骨骼微環(huán)境的重塑和損傷修復。氫釋放支架對衰老骨骼缺損部位促再生微環(huán)境的影響：與對照組和PHA-MBG組相比，CSN@PHA-MBG組中富集的BMSCs比例更高，p16表達顯著降低，衰老BMSCs的比例最低。同時，CSN@PHA-MBG支架顯著增加了骨祖細胞和H型內皮細胞的數量，促進了血管網絡的形成，為BMSCs的招募和抗衰提供了有利的生態(tài)位，支持血管生成和骨生成，促進衰老骨骼缺損的再生。氫釋放支架對受傷衰老骨骼修復結果的影響：通過對新形成組織的骨形成率、組織形態(tài)、衰老細胞負擔和抗破骨細胞生成潛力的綜合分析，發(fā)現CSN@PHA-MBG支架顯著增強了骨沉積速率，組織學檢查顯示出更快的骨形成和更多的新骨生成。在治療結束時（第28天），CSN@PHA-MBG組的骨體積/總體積比（BV/TV）更高，骨小梁數量（Tb.N）更多，骨小梁厚度（Tb.Th）更大，且衰老細胞（p16?）明顯減少，抗破骨細胞生成作用明顯，Vpp3表達陽性的細胞減少。這些結果表明，CSN@PHA-MBG支架通過有效的微環(huán)境重塑，在抑制破骨細胞生成方面發(fā)揮了主要作用，從而改善了衰老骨骼缺損的修復結果。本文揭示了局部H?釋放通過衰老巨噬細胞的復極化和分泌組變化改變微環(huán)境，從促炎轉變?yōu)榭寡?，減輕衰老/損傷疊加衰老的進展，促進內