生物技術(shù)制藥全冊配套完整課件3

生物技術(shù)制藥全冊配套完整課件3生物技術(shù)制藥科技創(chuàng)造經(jīng)濟農(nóng)業(yè)時代生技時代資訊時代全球化與經(jīng)濟附加價值時間與主要技術(shù)年代176919472000工業(yè)時代BC6000資料來源：TheComingBiotechAge,RichardW.Oliver

生物制藥已經(jīng)成為朝陽產(chǎn)業(yè)中的“朝陽”，突出表現(xiàn)在：1.國際上生物技術(shù)領(lǐng)域已取得的研究成果中60%以上是醫(yī)藥領(lǐng)域的；2.各國對生物技術(shù)的投資80%以上集中在醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域；3.生物技術(shù)研究開發(fā)的60-80%的力量主要集中在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域；4.總銷售額超過10億美元的生物技術(shù)產(chǎn)品主要為醫(yī)藥生物制品；5.美國1300多家生物技術(shù)公司的60%以上，歐洲800多家生物技術(shù)公司中近80%集中在醫(yī)藥領(lǐng)域；6.生物制藥市場資本總額達3500億美元，主要生物技術(shù)藥品有紅細胞生成素、胰島素、干擾素等，年銷售額均在10億美元左右。7.美國FDA正式批準上市的已有117種生物技術(shù)藥物用于治療各種疑難病和常見病，僅2001年上半年就批準了27種；8.處于臨床研究階段的有1000多種；9.近20年來，生物技術(shù)制藥占國際藥物和生物制品的份額逐年遞增，到2002年已達到13%。463424131165通訊職場生活旅遊2001-2010各大產(chǎn)業(yè)之預(yù)估成長率Source:WallStreetJournal,May2002Source:,Investorsfuelbiotech’sfuture,01-18-2005全球資金持續(xù)投入生技醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)2005年美國股票首次公開發(fā)行上市公司(IPO)募款金額與家數(shù)比較ToFeb16,2005Nasdaq生技股指數(shù)起起伏伏2000年後整體表現(xiàn)優(yōu)於Nasdaq&Dow平均指數(shù)13全球生技藥品市場及成長率14生技藥品市場分配份額15不同研發(fā)階段之生技藥品第一節(jié)生物制藥的概念和內(nèi)容

生物制藥是指利用生物體或生物過程生產(chǎn)藥物的技術(shù)。生物制藥技術(shù)是一門講述生物藥物，尤其是生物工程相關(guān)藥物的研制原理、生產(chǎn)工藝及分離純化技術(shù)的應(yīng)用學(xué)科。應(yīng)用：治療和預(yù)防疾??；作為研究工具

LouisPasteur

法國人，開創(chuàng)了藥物微生物技術(shù)的新時代

AlexanderFleming蘇格蘭人，發(fā)現(xiàn)青霉素及其治療傳染性疾病的功效，1945年獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎SelmanAbrahamwaksman美國人，對土壤微生物產(chǎn)生抗生素物質(zhì)進行了系統(tǒng)和開創(chuàng)性工作，發(fā)現(xiàn)了抑制肺結(jié)核的鏈霉菌素，1952年獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎基因工程技術(shù)、原生質(zhì)體融合技術(shù)、突變生物合成技術(shù)、微生物轉(zhuǎn)化一生物技術(shù)藥物的分類一應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造的基因重組制劑二基因核酸藥物三天然生物藥物四合成與部分合成的生物藥物（具體例子后面會講到）（1）天然藥物：未經(jīng)加工或僅簡單加工的藥物：植物藥、動物藥、礦物藥（2）合成藥物：以化學(xué)合成方法制得的藥物（3）生物技術(shù)藥物：通過細胞工程、基因工程、酶工程和發(fā)酵工程等新技術(shù)生產(chǎn)的藥物：酶制劑、生長激素、疫苗等。二生物技術(shù)藥物的特性1分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜2具有種屬特異性3針對性強，療效高4穩(wěn)定性差5基因穩(wěn)定性6免疫原性7體內(nèi)的半衰期短8受體效應(yīng)9多效性和網(wǎng)絡(luò)性效應(yīng)10檢驗的特異性一生物技術(shù)制藥的特征生物技術(shù)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)是產(chǎn)業(yè)化、商品化的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)之一。高技術(shù)，高投入，高風(fēng)險，高收益，長周期‘四高一長’的特點基因工程藥物的高回報堿性成纖維細胞生長因子231元/ug紅細胞生1072元/ug白細胞介素-2410元/ug巨細胞粒細胞集落刺激因子1960元/ug胰島素10.2元/mgRockfeller大學(xué)將人肥胖基因出售0.2億美元（1995年3月）Amgen公司將FKBP神經(jīng)免疫因子配體轉(zhuǎn)讓達3.29億美元（1997年）Millennium公司以4.65億美元向Bayer公司轉(zhuǎn)讓225種基因的開發(fā)權(quán)（1998年9月）二生物技術(shù)在制藥中的應(yīng)用基因工程技術(shù)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)細胞工程技術(shù)，干細胞培養(yǎng)及定向分化酶工程技術(shù)，細胞及酶的固定化技術(shù)發(fā)酵工程技術(shù)，生物反應(yīng)器,胚胎克隆技術(shù)生物大分子修飾,生物物理、生物信息及其他相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)

三生物技術(shù)制藥現(xiàn)狀和前景20世紀80年代以來僅美、日開發(fā)的生物新藥200多種。如：干擾素、白細胞介素、粒細胞集落刺激因子、紅細胞生成素、纖溶酶原激活劑、胰島素、生長激素、乙肝疫苗等。新試劑新技術(shù)不斷出現(xiàn)細胞移植用于:骨髓移植治療白血病、免疫缺陷、再障性貧血等?；蛑委熡?致死性遺傳疾病、癌癥、愛滋病、心臟病等。生物試劑開發(fā)單克隆抗體用于診斷和治療，熒光抗體法、DNA探針、PCR等檢測技術(shù)的建立。2000年是基因組之年，美國就近100家生物科技公司上市上市生物科技公司的總收入比1999年增加了19%，達249億美元，同時研發(fā)經(jīng)費也增至95億美元生物科技公司的市值增加38%，即從99年的3110億增至2000年的4290億美元傳統(tǒng)醫(yī)藥公司都投入巨資以多種不同形式（內(nèi)部研發(fā)、投資、收購、轉(zhuǎn)讓技術(shù)或合同研究等）進入生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)表1世界生物技術(shù)專利分布

（1996年）地區(qū)或國家生物技術(shù)專利

/%藥物專利

/%人DNA序列專利

/%美國(USA)595140歐洲(Europe)193324日本(Japan)171233其它(Other)543總計(Total)100100100

目前FDA已經(jīng)批準了117個生物技術(shù)藥物和疫苗，其中

75%為最近6年批準有350生物技術(shù)藥物和疫苗針對超過200種疾病正在進行臨床試驗有幾百種診斷試劑應(yīng)用于疾病診斷、血液檢定等美國目前有1273家生物技術(shù)公司，其中300家是上市公司

1999年至2000年生物技術(shù)市場資產(chǎn)總值增長156%，從1379億美元增加至3535億美元

1993年至2000年生物技術(shù)工業(yè)收入成倍增長，從80億美元增加至223億美元美國生物制藥現(xiàn)狀

美國生物制藥產(chǎn)品種類及數(shù)量（PHRAM）疾病種類產(chǎn)品數(shù)量疾病種類產(chǎn)品數(shù)量感染性疾病39心臟病26神經(jīng)系統(tǒng)疾病28呼吸系統(tǒng)疾病22艾滋病及相關(guān)疾病19自主免疫系統(tǒng)疾病19皮膚病19移植13消化系統(tǒng)疾病11遺傳疾病11血液疾病9糖尿病及并發(fā)癥7不育癥5眼病3生長發(fā)育不良癥3骨質(zhì)疏松2妊娠預(yù)防2腫瘤疾病175

主治病癥生物新藥數(shù)量癌癥400來種阿爾茨海默癥26種心臟病、心肌梗塞、AIDS和精神病100多種糖尿病25種關(guān)節(jié)炎19種帕金毒氏病16種骨質(zhì)疏松癥14種兒童治療使用200多種當前正在研制的1000多種新藥分布美國已進入臨床研究階段的革新性生物技術(shù)藥物

種類作用AntiVEGF(抗內(nèi)皮細胞生長因子)

治療結(jié)腸直腸癌和非小細胞肺癌(Ⅲ期臨床)Dendriticcellvaccine(樹突細胞疫苗)

治療前列腺癌(Ⅲ期臨床)Dendriticcellvaccine(樹突細胞疫苗)

治療乳腺癌(Ｉ期臨床)ONYX015(腫瘤抑制治療基因)

治療頭頸癌(II期臨床)AntiIgEhumanizedmonoclonalantibody治療哮喘(Ⅲ期臨床結(jié)束)(人源化抗IgE單克隆抗體)PRO542(PRO542抗體)

預(yù)防HIVPegasya(PEG修飾IFN)

治療丙型肝炎(Ⅲ期臨床)Recombinathumanparathyroidhormone治療骨質(zhì)疏松癥(Ⅲ期臨床)(重組人甲狀旁腺激素)Somatokine(免疫系統(tǒng)激發(fā)劑)

治療嚴重?zé)齻?Ⅲ期臨床結(jié)束)ConXn(松弛素蛋白)

治療硬皮病(ＩＩ/Ⅲ期臨床)ABX-ILB(ABX-ILB抗體)

治療牛皮癬(ＩＩ期臨床)生物藥品名稱適應(yīng)性年銷售額(億美元)抗CD3MAb移植排斥0.80DNase囊性纖維變性1.11EPO貧血16.50因子Ⅷ血友病2.50G-CSF嗜中性白細胞減少癥9.36葡萄糖腦苷酯酶Gaucher氏病2.15GM-CSF骨髓移植0.41GPⅡb/ⅢaMAb血管造形術(shù)中血凝塊1.30B型肝炎疫苗B型肝炎10.00人生長激素生長不良，腎功能不全4.50人胰島素糖尿糖7.00人白細胞介素-2腎癌0.40α-干擾素癌癥，肝炎7.00β-干擾素多發(fā)性硬化2.55γ-干擾素肉芽腫病0.04tPA心力衰竭/栓塞/中風(fēng)3.00總計

68.6216種生物技術(shù)藥物銷售情況

FDA批準的生物制品時期批準的數(shù)目臨床試驗期審評期總時間1982-19891432.724.053.21990-19941546.521.367.81995-19992658.614.773.3*時間單位為月3、我國的醫(yī)藥生物技術(shù)

已上市的基因工程藥物和疫苗

1992年乙型肝炎疫苗

1995年白細胞介素-21996年α1b-干擾素α2a-干擾素

α2b-干擾素

1997年粒細胞集落因子紅細胞生成素

我國已批準生產(chǎn)的生物技術(shù)藥物和疫苗名稱作用rhuIFNα1b(外用)病毒性角膜炎rhuIFNα1b乙肝、丙肝rhuIFNα2a乙肝、丙肝、皰疹等rhuIFNα2a(酵母)乙肝、丙肝rhuIFNα2b乙肝、丙肝白血病等rhuIFNα2a(栓劑)婦科病rhuIFNα2b(凝膠劑)皰疹等rhuIFNγ類風(fēng)濕rhuEGF(外用)燒傷、創(chuàng)傷EGF衍生物燒傷、創(chuàng)傷rhuIL2癌癥輔助治療rhuIL2125Ser癌癥輔助治療上海華晨rhuG－CSF刺激產(chǎn)生白細胞rhuGM－CSF刺激產(chǎn)生白細胞、骨髓移植rhuEPO產(chǎn)生紅細胞rhuGH矮小病bFGF(外用)創(chuàng)傷、燒傷RSK溶血栓(心梗)抗IL28單抗乳膏劑銀屑病人胰島素糖尿病乙肝疫苗預(yù)防乙肝痢疾疫苗預(yù)防痢疾5、醫(yī)藥生物技術(shù)發(fā)展展望21世紀是醫(yī)藥生物技術(shù)快速發(fā)展的時期,生物制藥、化學(xué)藥物、中藥形成三足鼎立,有效的為人類健康服務(wù)。1.利用新發(fā)現(xiàn)的人類基因開發(fā)新型藥物2.新型疫苗的研制：滋病疫苗和基因型癌疫苗等。3.基因工程活性肽的生產(chǎn)及基因藥物:淋巴因子、生長因子、激素和酶4.其它醫(yī)藥業(yè)將得到不斷改造和發(fā)展,早期診斷技術(shù)，轉(zhuǎn)基因藥材重組蛋白質(zhì)藥物的鑒定方法電泳方法：SDS－PAGE、等電聚焦、免疫電泳免疫學(xué)分析方法：放射性免疫方法、放射性免疫擴散法、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫印跡受體結(jié)合方法HPLC肽圖分析EdmanN-末端序列分析法圓二色譜法核磁共振法醫(yī)藥業(yè)的現(xiàn)實問題和研究進展挑戰(zhàn)與應(yīng)對20強的股東回報(98年前5年）0102030405060輝瑞Pfizer利來EliLilly先靈寶雅Schering-Plough墨克Merck&Co.施貴寶BMS強生J&JAHP史克SB諾華NovartisAbbottZenecaGWHMRTakeda羅氏Roche拜爾BayerRhonePoulencAstraPharmaciaUpjohn*行業(yè)平均22%20強平均29%股東回報率%TSR醫(yī)藥行業(yè)曾經(jīng)是一個很舒適的地方至今為止醫(yī)藥行業(yè)的新藥研發(fā)模式還算成功研發(fā)500個驗證的目標一個待篩選庫有1-2百萬個化合物專利對研發(fā)的鼓勵作用主要病癥的治療覆蓋分階段新藥發(fā)展，財務(wù)與人力風(fēng)險控制大量臨床試驗營銷創(chuàng)新藥價格高多國家或全球推出大量推銷與對病人的直接宣傳(DTC)周期管理以取得最大回報購買專利來保證治療藥經(jīng)營特權(quán)的延續(xù)這一成功服務(wù)醫(yī)藥業(yè)務(wù)人員50年的運作模式正在失去效益。醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展回顧90年代是醫(yī)藥行業(yè)的黃金年代，1993年到2000年中期:FT醫(yī)藥指數(shù): +350%2001-2002年FT指數(shù)跌 -50%投資團體對醫(yī)藥行業(yè)產(chǎn)生懷疑能量失衡研發(fā)生產(chǎn)力的降低專利到期治療藥競爭加劇30354045505560658586878889909192939495969798990510152025303540每年的研發(fā)（

R&D）費用($billion)每年開發(fā)的新化合物實體（NCE）

4570研發(fā)效率在下降

在過去10年，研發(fā)成本飆升，但每年上市新藥數(shù)目下降在今后幾年只有14種潛在重磅炸彈藥CrestorExantasubstanceppitavastatin(US,EU)pregabalincethromycin預(yù)期每年銷售達$10億美元的暢銷藥 2003 2004 2005 2006Adalimubab(D2E7)Source:Datamonitor,TheNextGenerationofBlockbusters,2002oralinsulinIressaPKC-betainhibitorZetiaArcoxiaCOX-198avasimibe跨國藥企對重磅炸彈藥品種更為依重少數(shù)藥品的價值貢獻越來越舉足輕重，幾乎超過了80%。市場上只有不到4%的藥品的年均銷售額在5億美元以上?？梢哉f，一個暢銷新藥的成功幾乎能完全提升一個企業(yè)。治療藥競爭加劇Source:ScripMagazine(Sept97),PwCCelebrex/Vioxx1998012345678910Invirase1995Recombinate1992Diflucan1990Prozac1988Mevacor1987AZT1987Seldane1985Capoten1980Tagamet1977Inderal1968YearsofexclusivityRelenza/Tamiflu.199910years2months!6years到2005年，前一百位的處方藥中有53%將專利到期，它們在1998年的銷售收入達到530億美元——幾乎都是暢銷藥。專利到期對公司價值的影響是巨大的，曾有藥企的某專利到期藥品在兩個月內(nèi)失去了80%的市場份額。無專利專利保護2000年2005年P(guān)ercentageofU.S.RxMarketFacingNewGenericCompetition2000年以來，將有大量專利藥品面臨到期……重磅炸彈藥緩慢推出與專利到期對研發(fā)的巨大壓力……兩者都將焦點對準了研發(fā)，但研發(fā)產(chǎn)出效益始終低迷，無法彌補專利到期的損失。30354045505560658586878889909192939495969798990510152025303540年度研發(fā)支出新藥上市NCEs$Billion2550450070研發(fā)支出銷售收入20強的年均研發(fā)新藥不到一個，卻要為一個新藥的研發(fā)花費7億美元，而單品銷售收入為近2億美元——如果持續(xù)這一水平，意味著投資回報很快會降到零點?？鐕幤蠊蓶|回報滑波……尤其是2000年之后，劇烈下滑幾乎波及所有跨國藥企，特別是制藥巨頭們-20-100102030405060PharmaciaPfizerLillySchering-PNovartisRocheBMSJ&JMerckWyethSan-SynAbbottBayerGSKScheringAGTakedaAmgenAventisAZSankyo截止到2002年6月的TSR截止到98年3月的TSR全球醫(yī)藥企業(yè)20強98年和02年投資回報比較

新產(chǎn)品上市

縮短時間

購買專利藥品協(xié)同開發(fā)/聯(lián)盟

全球同時推出提高收入–現(xiàn)有產(chǎn)品市場更深的滲透/DTC

產(chǎn)品周期管理/OTC

產(chǎn)品線延伸協(xié)同推銷加價

降低成本

提高運營有效性

資產(chǎn)使用許多醫(yī)藥公司使出渾身解數(shù)來化解危機合并也不是長久之計-通過對行業(yè)的193個合并了解到，89%公司在第三季度面臨銷售滑坡Source:*MatthiasM.Bekier,AnnaJ.Bogardus,andTimOldham,"WhyMergersFail,ConductedSouthernMethodistUniversity傳統(tǒng)藥物發(fā)現(xiàn)模式受到威脅差異傳統(tǒng)的化合物庫的限制(1-2百萬)規(guī)模即使是產(chǎn)業(yè)化的篩選流程也是耗費時間的

用現(xiàn)在的篩選系統(tǒng)（uHTS）對500,000靶點進行篩選需要10,000

年。

質(zhì)量“不能成為藥物”的靶點長時間的優(yōu)化周期

有些化合物有副作用有些化合物進入I期臨床試驗沒有再進行下去

效率低下傳統(tǒng)挑戰(zhàn)基于文獻的靶點確認

基于文獻的靶點識別

<1000

基于化學(xué)物的篩選

<2百萬化合物花費時間確認和獲得先導(dǎo)化合物

選擇確定作為開發(fā)對象的目標化合物工業(yè)化探討（大量制備）臨床試驗用樣品上市銷售（GSP)現(xiàn)代創(chuàng)新藥物研究開發(fā)的大致過程合成情報

提取、結(jié)構(gòu)測定

活性篩選藥理生化特殊毒性毒性藥效藥理一般藥理藥物動態(tài)吸收排泄代謝作用機理急性毒性亞急性毒性慢性毒性致畸致癌

致癮生殖毒性

理化學(xué)性質(zhì)、制定質(zhì)量標準穩(wěn)定性配伍變化試驗方法試驗規(guī)格工業(yè)制備方法探討合成提取精制發(fā)酵制劑化探討III期：毒性、藥效（多數(shù)病人，多點觀察）

II期：毒性、藥效（少數(shù)病人）

I期：毒性（健康人群）申請臨床試驗(GCP）申請生產(chǎn)許可(GMP)創(chuàng)新藥物源頭研究階段(GLP)

雜志公開發(fā)表接受公眾檢驗申請專利在眾多生物活性中力求找出最本質(zhì)的作用

天然藥物或中藥在臨床治療上可能作用于多個靶點，因而具有多種療效，即表現(xiàn)出多方面的活性。研究者應(yīng)當力求找出其中最本質(zhì)的作用，選擇建立反映臨床治療作用特點、且效果與之平行的活性測試體系，才有可能追蹤分離出目的活性成分或甚至有效成分。

中藥或天然藥物名稱

生理活性活性篩選體系

目標活性物質(zhì)

烏頭

(Aconitumspp.)強心、利尿興奮、鎮(zhèn)痛Yagi-Hartung法（離體蛙心）

去甲基烏藥堿（Higenamine)

烏頭堿類大黃（Rheumcoreanum及R.palmatum的雜交種）健胃、緩瀉

致瀉活性(小鼠)番瀉苷(sennoside)

茵陳蒿

(Artemisiacapillaris)利膽、抗炎膽汁分泌促進作用茵陳色原酮

(capillarisin)等

貝(日本產(chǎn))(Babyloniajaponica)口渴、視力減退、瞳孔散大、言語障礙、便秘atropine定量法（小鼠散瞳率試驗)

surugatoxin軟紫草

(Arnebiaeuchroma)止血、抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌前列腺素PGE2生合成抑制活性arteriolearnibinone

arnebifuranone

shikonins類

以疾病為導(dǎo)向的發(fā)現(xiàn)藥物方法將加快發(fā)現(xiàn)靶點的速度差異

生物分子庫是巨大的

潛在的靶點超過100億不同的分子*規(guī)模針對靶點識別（ID）疾病導(dǎo)向的方法

生物學(xué)篩選是動態(tài)的

通過分子活性尋找靶點

質(zhì)量設(shè)計相應(yīng)的分子識別正確的靶點

生物制劑一般有較少的毒性

臨床為導(dǎo)向識別靶點有可能加快發(fā)現(xiàn)新藥因此，臨床治療失敗將會大大減少

500,000潛在靶點疾病模型篩選靶點

未來基于生物學(xué)的篩選快速的臨床前檢測

100億分子

在臨床上可以快速識別靶點和治療效果

優(yōu)勢以疾病為導(dǎo)向的生物學(xué)方法使靶點識別更加快速

–針對未來的方法

嚴密地以確認的疾病模型和基因組為導(dǎo)向的方法是發(fā)現(xiàn)新的和疾病相關(guān)靶點

使用生物分子來確認可以戲劇性地減少發(fā)現(xiàn)靶點的周期

生物學(xué)分子被日益用來在臨床PoC上使用。生物學(xué)分子用于靶點識別的臨床周期–PoC<2年*Source:*HGSandCAT,CelltechandAbbottSource:HumanGenomeSciences,PressRelease,May2002TRAIL-R2mAbCancerTherapy

未來的發(fā)展過程

不斷重復(fù)的過程–以及較高的再利用在分子水平對疾病的理解這一點幾乎沒有爭論。

在小型的劑量調(diào)整性試驗中,安慰劑要最小

–隨后上市前的短期試驗里要有關(guān)于病人的確切的效果真正的的結(jié)果是要靠要收集終生試驗的資料、價格和風(fēng)險動態(tài)的產(chǎn)品資料要包含新資料終生試驗&市場調(diào)研

上市6-24月產(chǎn)品生命劑量調(diào)整性試驗建立臨床模型持續(xù)不斷的市場應(yīng)用

在藥廠、規(guī)則制定者和付費者之間需要巨大的整合

高預(yù)測性

–模擬是核心。

–要科學(xué)性和商業(yè)化發(fā)展一個完整的系統(tǒng)包括：診斷、服務(wù)和設(shè)備等

在產(chǎn)品的生命周期里繼續(xù)向規(guī)則制定者進行咨詢

以疾病為導(dǎo)向的方法提供快速的藥物發(fā)展模式和代價現(xiàn)在的模式未來的模式靶點從靶點的識別到上市的時間

12-14年~3-5年上市前的費用

~$800百萬<$200百萬進入人體使用的成功率

5-10%50%or更多對疾病的重新定義…過去肺病COPD慢性阻塞性肺疾病哮喘器官現(xiàn)在COPD慢性阻塞性肺疾病哮喘

支氣管炎癥狀加重吸煙損害

氣管炎癥ARDS遺傳過敏阻塞癥狀疾病變化免疫調(diào)節(jié)肺氣腫病理BHRLungDisease未來IgE路徑轉(zhuǎn)錄激活因子IL5路徑嗜酸性粒細胞趨化因子嗜中性粒細胞激活

-1-抗胰蛋白酶蛋白酶等等

生物分子遺傳易感性/環(huán)境神經(jīng)肽上皮調(diào)節(jié)上皮分化將引導(dǎo)未來的治療方法現(xiàn)在LungDiseaseCOPD慢性阻塞性肺疾病

哮喘

器官目前COPD慢性阻塞性肺疾病

哮喘

支氣管炎癥狀加重吸煙損害

氣管炎癥ARDS遺傳性過敏阻塞癥狀疾病變化免疫調(diào)節(jié)肺氣腫病理學(xué)BHRLungDisease未來IgE路徑轉(zhuǎn)錄激活因子IL5路徑嗜酸性粒細胞趨化因子嗜中性利細胞激活

-1-抗胰蛋白酶蛋白酶等等生物分子遺傳易感性/環(huán)境神經(jīng)肽上皮調(diào)節(jié)上皮分化類固醇b阻斷劑吸入性內(nèi)皮質(zhì)激素吸入性內(nèi)皮質(zhì)激素b阻斷劑表面活性劑蛋白酶抑止劑嗜中性粒細胞胰肽酶抑止劑抗IgE抗體CCR5抑制劑IL5抗體Stat-6反義活力半衰期延長了12倍重組人干擾素α2b、重組人β干擾素和人白蛋白融合共表達達到國際水平2003年抗非典期間，江南大學(xué)與麗珠集團蘇州新寶制藥廠合作攻關(guān)，通過發(fā)酵工程和生物制藥工程研制成功了重組人α-2b干擾素口鼻腔噴霧劑，解決了干擾素常溫保存穩(wěn)定性問題。在疫區(qū)特殊人群捐贈使用，效果顯著?，F(xiàn)已被國家SDA作為新藥受理（省內(nèi)唯一被受理的干擾素劑型），并選派參加在巴黎舉辦的科技成果展。重組人α-2b干擾素口鼻腔噴霧劑發(fā)展趨勢（1）利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)開發(fā)新產(chǎn)品（2）采用新的高效表達系統(tǒng)，利用動物細胞，特別是整體動物大量表達基因工程醫(yī)藥產(chǎn)品

（3）將基因組研究成果轉(zhuǎn)化為生物技術(shù)新藥（4）開發(fā)新劑型的生物技術(shù)藥物傳統(tǒng)醫(yī)藥的現(xiàn)代認識TsinghuaUniversityXiangXuePharmaceuticalsInstituteofPharmaceuticalInnovationBradfordRoyalBotanicGardens,KewBrunelInstituteForBioengineeringCambridgeUniversitydeptsandinstitutesImperialCollegeLondonMedicalToxicologyUnit(NHS)LondonSchoolofPharmacyCCCMR展望

人類基因組測序工作的完成，會使我們對人的健康與疾病起因有更深入的認識。盡管第一張人類基因組測序工作草圖尚未弄清所有人類基因的功能，但是，一旦這些基因產(chǎn)物（即活性蛋白質(zhì)）被表達出來，將會有幾千種甚至更多具有特殊療效的蛋白藥物的誕生。因此，基因工程藥物具有很大的增長空間和發(fā)展前景。第三節(jié)新型生物藥物研制的方法新型生物藥物是指利用生物體或生物過程產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)新穎的藥物。結(jié)構(gòu)新穎是指與以前藥物有著不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，是—種新的化學(xué)實體(Newchemicalentity，簡稱NCE)。這類新型生物藥物國家認定為一類新藥。國際上所說的新藥開發(fā)就是指開發(fā)NCE藥物。新藥評價程序生物技術(shù)來源藥物的新藥評價，原則是相同于一般藥物的新藥評價，可分為臨床前評價和臨床評價及生產(chǎn)兩方面的工作。但由于生物技術(shù)藥物的特點，又不完全相同于一般新藥的評價和審批。新藥研發(fā)過程1、制定研究計劃，設(shè)計實驗方案并實施之，獲得NCE2、臨床前研究，獲得IND（investigationalnewdrug）西藥臨床前22項（新藥證書，25項）中藥臨床前19項（新藥證書，22項）新藥研發(fā)過程3、臨床試驗（或臨床驗證），獲得NDA（newdrugapproval）

PhaseI:20－30例健康受試者

PhaseII:不少于100例典型患者

PhaseIII:不少于300例患者4、上市后研究，臨床藥理一類試生產(chǎn)期，PhaseIV:>2000例

新藥研發(fā)是一項系統(tǒng)工程，涉及多個學(xué)科

分子生物學(xué)分子藥理學(xué)生物信息學(xué)藥物化學(xué)計算機科學(xué)

藥物分析化學(xué)藥理學(xué)毒理學(xué)藥劑學(xué)制藥工藝學(xué)新藥研發(fā)特點

投資高周期長風(fēng)險高利潤高競爭激烈Moleculardrugdesign藥物分子設(shè)計由多學(xué)科相互穿插，交替進行藥物設(shè)計學(xué)分子生物學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)基因組生物信息學(xué)數(shù)學(xué)統(tǒng)計學(xué)藥物化學(xué)有機藥物化學(xué)計算機科學(xué)計算化學(xué)分子藥理學(xué)一般藥理學(xué)先導(dǎo)化合物

Leadcompound

又稱原型物（Prototype），簡稱先導(dǎo)物（Lead），是通過各種途徑或方法得到的具有某種生物活性的化學(xué)結(jié)構(gòu)。天然生物活性物質(zhì)作為先導(dǎo)物

天然生物活性物質(zhì)來源廣泛植物動物微生物海洋生物礦物天然生物活性物質(zhì)作為先導(dǎo)物青蒿素青蒿素Artemisinin黃花蒿Artemisiaannula蒿甲醚Artemether生物利用度較低復(fù)發(fā)率高天然生物活性物質(zhì)作為先導(dǎo)物喜樹堿羥基喜樹堿Hydroxycamptothecin喜樹Camptothecaacuminata拓撲替康Topotecan水溶性較差，毒性大天然生物活性物質(zhì)作為先導(dǎo)物紫杉醇紫杉醇Taxol紅豆杉Taxus紫杉特爾Taxotere天然生物活性物質(zhì)作為先導(dǎo)物局麻藥可卡因Cocaine南美洲古柯ErythroxylumcocaLam普魯卡因Procaine天然生物活性物質(zhì)作為先導(dǎo)物抗生素類天然抗生素微生物培養(yǎng)液半合成抗生素天然生物活性物質(zhì)作為先導(dǎo)物他汀類降脂藥美伐他汀Mevastatin洛伐他汀Lovastatin辛伐他汀Simvastatin普伐他汀Pravastatin桔青霉菌等Penicilliumcitrinum氟伐他汀Fluvastatin天然生物活性物質(zhì)作為先導(dǎo)物動物毒素蛇毒Bungarotoxin，N2受體拮抗劑肌松藥蛇毒Batroxobin，溶血栓酶抗栓藥魚毒Tetrodotoxin，鈉通道阻斷劑心血管藥物蜂毒Apamin，鈣通道阻斷劑和鉀通道開放劑心血管藥物以生物化學(xué)為基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)物-1

以生物大分子或復(fù)合物為靶點酶：酶抑制劑受體：激動劑、拮抗劑離子通道：阻斷劑、開放劑核酸：反義藥物從內(nèi)源性活性物質(zhì)；酶反應(yīng)過程（底物、過渡態(tài)、產(chǎn)物）；與受體作用過程（配體、激動劑、拮抗劑）；生化級聯(lián)反應(yīng)過程等出發(fā)基于生物大分子結(jié)構(gòu)或作用機理

Structure-basedormechanism-baseddrugdesign從內(nèi)源性活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)物

5－羥色胺受體激動劑腦內(nèi)5-HT水平降低會引起偏頭痛變換結(jié)構(gòu)以提高對5-HT1受體選擇性激動活性5-HT1激動劑舒馬普坦（Sumatriptan）用于治療偏頭痛COX抑制劑吲哚美辛類非甾體抗炎藥

COX抑制劑吲哚美辛類非甾體抗炎藥從酶作用發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)物

ACE抑制劑ACE的功能將AngiotensinI從羧基端水解掉二肽，活化成AngiotensinII將Bradykinin從羧基端水解掉二肽失活天然ACE底物及一些肽類天然ACE抑制劑每克分子ACE含有一克原子Zn++HypotheticalactivesiteofcarboxypeptidaseAHypotheticalbindingofinhibitorstoACEACE抑制劑ACE的功能羧肽酶A的作用模式肽類抑制劑的結(jié)合模式羧烷基脯氨酸卡托普利依那普利等由受體結(jié)構(gòu)特點設(shè)計活性化合物作用于同一受體的藥物活性構(gòu)象分析

伸展型構(gòu)象平面伸展型構(gòu)象以受體的天然配體為起點

IIb/IIIa糖蛋白受體拮抗劑血栓形成的關(guān)鍵步驟是纖維蛋白原與血小板IIb/IIIa受體結(jié)合。被IIb/IIIa受體識別和相互作用的主要區(qū)段是纖維蛋白原的三肽片斷Arg-Gly-Asp（RGD）。蛇毒或水蛭素中含有RGD的線形或環(huán)狀肽，是阻斷IIb/IIIa受體活化從而抑制血小板聚集的藥效團。含有或模擬RGD結(jié)構(gòu)的肽或擬肽可作為纖維蛋白原的拮抗劑，是創(chuàng)制抗血栓藥物的一個新途徑。IIb/IIIa糖蛋白受體拮抗劑RGDSibrofibanLamifibanH2受體拮抗劑類抗?jié)兯?/p>

選定靶點－組胺H2受體確立研發(fā)目標－抑制胃酸分泌藥物建立動物篩選模型－麻醉兔灌胃從H2受體天然激動劑－組胺入手，以其為先導(dǎo)結(jié)構(gòu)，保留咪唑環(huán)，改變側(cè)鏈，開始優(yōu)化H2受體拮抗劑類抗?jié)兯嶩2受體拮抗劑類抗?jié)兯嶩2受體拮抗劑類抗?jié)兯幓谏锎蠓肿咏Y(jié)構(gòu)

和作用機理設(shè)計先導(dǎo)物合理藥物設(shè)計

Rationaldrugdesign合理藥物設(shè)計即以藥物作用靶點的三維結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)功能為基礎(chǔ)進行藥物設(shè)計的方法Structure-baseddrugdesignMechanism-baseddrugdesignStructure-baseddrugdesign了解生物大分子（受體）的三維結(jié)構(gòu)，特別是與配體分子形成的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，是前提大分子與小分子的結(jié)合模式是基礎(chǔ)多種方法并用數(shù)據(jù)庫搜尋分子碎片連接從頭構(gòu)建InteractionsbetweenenzymeandsubstratepeptideComplexofHIVproteaseanditsinhibitorPeptidomimeticHIVproteaseinhibitorsP1P1’H-bonddonor/acceptor8.5-12.0?3.5-6.5?3.5-6.5?HIVproteaseinhibitorsHIVproteaseinhibitors

InteractionsbetweenenzymeandinhibitorsHIVproteaseinhibitorsCHH4.1-6.1?4.4-6.4?1.8-3.8?HIVproteaseinhibitorsIC50=0.32mol/LMechanism-baseddrugdesignGABA轉(zhuǎn)氨酶抑制劑－氨己烯酸蛋白酶的過渡態(tài)類似物抑制劑GABAaminotransferaseinhibitor-VigabatrinGABAaminotransferaseinhibitor-VigabatrinGABAaminotransferaseinhibitor-VigabatrinGABAaminotransferaseinhibitor-VigabatrinGABAaminotransferaseinhibitor-VigabatrinGABAaminotransferaseinhibitor-Vigabatrin腎素的過渡態(tài)類似物抑制劑基于臨床副作用觀察產(chǎn)生的先導(dǎo)物

作用與作用的分離異丙嗪的鎮(zhèn)靜作用Promethazine異丙嗪（抗過敏藥）Chlorpromazine氯丙嗪（安定）Thiazinamium噻丙胺（支氣管擴張）磺胺家族的發(fā)展單氨氧化酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)格魯米特的芳構(gòu)酶抑制作用基于生物轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)物磺胺的發(fā)現(xiàn)基于生物轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)物抗瘧藥環(huán)氯胍保泰松的代謝活化藥物合成的中間體作為先導(dǎo)物藥物合成的中間體作為先導(dǎo)物組合化學(xué)

Combinatorialchemistry同時制備含眾多分子的化合物庫以代數(shù)級數(shù)增加構(gòu)建塊的數(shù)目，庫容量則以幾何級數(shù)增加與高通量篩選（high-throughputscreening,HTS）技術(shù)結(jié)合，可極大地加快先導(dǎo)物發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化的速度反義核苷酸

Antisenseoligonucleotides能夠與DNA或信使RNA發(fā)生特異性結(jié)合，分別阻斷核酸的轉(zhuǎn)錄或翻譯功能，阻止與病理過程相關(guān)的核酸或蛋白質(zhì)的生物合成。這種可與DNA或信使RNA結(jié)合的互補鏈稱作反義寡核苷酸。PeptideNucleicAcids(PNA)篩選發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)物隨機與非隨機篩選Random/nonrandomscreening高通量篩選

High-throughputscreening(HTS)虛擬篩選

VirtualscreeningVirtualscreening用計算機篩選的方法稱為虛擬篩選，或稱insilico篩選，成為insilico-invitro-invivo模式。用一系列“基于知識的濾片”對虛擬庫“篩選”，以“濃縮”出能夠滿足預(yù)定標準的化合物。這些濾片包括類藥性(druglike)，藥代動力學(xué)性質(zhì)，毒性，知識產(chǎn)權(quán)問題以及與受體的互補性或與配體的相似性等，是通過數(shù)據(jù)庫搜尋和計算化學(xué)實現(xiàn)的。Virtualscreening抗體導(dǎo)向酶催化前藥

Antibody-DirectedEnzymeProdrugTherapy,ADEPTTarget表面抗原單克隆抗體＋酶前藥原藥ADEPT的酶系羧肽酶G2（CPG2）羧肽酶A堿性磷酸酶糖苷酶青霉素酰胺酶

-內(nèi)酰胺酶MMCI前藥＋W14F(ab)2-CPG2MMCI作為CPG2的底物優(yōu)于氮芥；原藥的細胞毒作用也更強。體外絨毛膜癌細胞系試驗，前藥加酶活性強于前藥活性100倍。體內(nèi)試驗可完全或明顯抑制腫瘤生長。ADEPT－

-Lactamase癌細胞單抗-內(nèi)酰胺酶第二章基因工程與藥物蛋白生產(chǎn)

GeneticEngineeringinMedicineandIndustrySometherapeuticproductsforusedinhumansGenentech公司1976年，27歲的風(fēng)險投資人RobertSwanson與UniversityofCalifornia的教授HerbBoyer共飲了幾杯啤酒，討論了基因工程技術(shù)的商業(yè)前景。討論結(jié)束時，他們決定建立一個公司，并取名為Genentech（GeneticEngineeringTechnology）。第一個基因工程公司在學(xué)術(shù)界和商業(yè)界的滿腹懷疑中誕生了！Genentech的驕人業(yè)績1976Genentech創(chuàng)立1977首次在微生物里生產(chǎn)了人蛋白生長激素抑制素1978克隆了人胰島素基因1979克隆了人生長激素素基因1980公司上市，募集$35million1982第一個基因重組藥（人胰島素）上市（轉(zhuǎn)讓給Lilly公司）1984第一個VIII因子，轉(zhuǎn)讓給CutterBiological1985第一個自己生產(chǎn)的產(chǎn)品（人生長激素）1987生產(chǎn)組織纖溶酶原激活劑（tPA）1990生產(chǎn)interferon

1

1990與瑞士Roche醫(yī)藥公司合并（$2.1billion）美國已批準上市的基因工程藥物（1997.7）中文名稱商品名稱英文名縮寫開發(fā)公司胰島素Humulin

Novolin

HumalogInsulinlispoinsulinLillyNovoNordiskLilly人生長激素ProtropinHumatropeNutropinAQrhuGHGenentechLillyGenentech干擾素IntronAReferonAAvonixBetaseronActimmuneAlferon-NrhuIFNa2brhuIFNa2arhuIFN

rhuIFN

1brhuIFN

1brhuIFNa3ScheringRocheBiogen

ChironGenentechInterferonScience白細胞介素2ProleukinrhuIL2Chiron粒細胞集落刺激因子NeupogenrhuG-CSFAmgen粒細胞巨噬細胞集落刺激因子LeukinerhuGM-GSFImmunex紅細胞生成素EpogenProcritrhuEPO

AmgenOrtho組織溶纖原激活劑ActivaserhuTPAGenentech生長激素SerostinsomatotropinSerono促生長素NutropinSaizenGenotropinNorditropinBio-TropinsomatopinGenentechSerono

Pharma/UpjohnNovoNordiskBiotechGeneral抗血友病因子VIIIKogenate

RecombinateFactorVIIIBayerBaxter葡萄腦苷脂酶CerezymeglucocerebrosidaseGenzyml脫氧核糖核酸酶PulmozymedomaseGenentech乙型肝炎疫苗RecombivaxHBEngerixBComraxHepatitisBvaccineMerckSmithKlineMerck甲型肝炎疫苗HavrixHepatitisBvaccineSmithKline體內(nèi)用單克隆抗體Reopro

OrthoOKT-3Onco

ScintCR/OVOnco

ScintOC103Onco

ScintCR103ProstascintMAB,bloodclotsMAB,KidneysupMAB,diaginjectCentocor

OrthoBiotechCytogen

Cytogen

Cytogen

Cytogen鼠單克隆抗體PanorexMurineMABGlaxoWelcome1中國已經(jīng)批準上市的基因工程藥物（1998.5）藥品名縮寫開發(fā)生產(chǎn)公司批準時間適應(yīng)癥rhuINFa1b(外用）rhuINFa1brhuINFa2a長春生研所上海生研所深圳興科長春生研所長生藥業(yè)三生藥業(yè)1989試1996正1996正1996正1997正1997正病毒性角膜炎HBV,HCVHBV,HCV尖銳濕疣，皰疹等HBV,HCVHBV,HCVrhuIFNa2b新大洲藥業(yè)里亞哈爾華立達安科華新1997正1996正1997正1997試1997試HBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVrhuINF

上海生研所克隆麗珠生物工程1994試1995試1995試類風(fēng)濕類風(fēng)濕類風(fēng)濕rhuIL2長春生研所長春藥業(yè)四環(huán)制藥華新三生藥業(yè)深圳興科中華合通金絲利康利制藥1997正1997正1997正1997正1997正1997正1995試1995試1995試癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療rhuG-CSF九源1997試化療生白血病rhuGM-CSF特寶1997試化療生白血病rSK醫(yī)大實業(yè)1996試心梗溶栓rhuEPO華欣永銘維沃1997試1997試再生障礙性貧血再生障礙性貧血bFGF（外用）珠海東大1996試創(chuàng)傷，燒傷一、基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生1、生產(chǎn)基因工程藥品

（1）傳統(tǒng)的某些藥品（如動物激素）生產(chǎn)：控制某種物質(zhì)合成基因轉(zhuǎn)基因“工程菌”基因工程藥品基因表達產(chǎn)物基因工程發(fā)酵分離提取從動物組織中提取，生產(chǎn)量小，價格昂貴。（3）基因工程生產(chǎn)的藥品重組人生長激素重組人白細胞介素重組人干擾素重組人胰島素發(fā)酵罐（2）基因工程方法生產(chǎn)藥品的方法：151二、基因工程菌大腸桿菌表達系統(tǒng)一：大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢二大腸桿菌表達載體的基本組成三常用的大腸桿菌表達載體四真核基因在大腸桿菌中的表達五大腸桿菌表達真核基因存在的問題六基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制七.人胰島素的生產(chǎn)方法一：大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢全基因組測序,共有4405個開放型閱讀框架基因克隆表達系統(tǒng)成熟繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物大腸桿菌表達外源基因的劣勢缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素(endotoxin)periplasmheterogous二大腸桿菌表達載體的基本組成一個良好的大腸桿菌表達載體：有抗菌素抗性基因決定載體拷貝數(shù)的復(fù)制起點(ori)供外源基因插入的多克隆位點。參與控制轉(zhuǎn)錄與翻譯的必不可少的原件外源基因在原核寄主細胞中表達,它的編碼結(jié)構(gòu)必須是連續(xù)的,不間斷的,處于寄主啟動子有效控制下。1啟動子可使外源基因高水平表達的最佳啟動子必須具備以下幾個條件1)強啟動子，外源基因的蛋白質(zhì)的表達量占細胞總蛋白的10%-30%以上2)應(yīng)能呈現(xiàn)出一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平3)應(yīng)該是誘導(dǎo)型的,能通過簡單的方式,使用廉價的誘導(dǎo)物得以誘導(dǎo)。Accountforinducibleb:如果在啟動子的上游部位放置一個有效的轉(zhuǎn)錄終止子,那么由該啟動子驅(qū)動的克隆基因的轉(zhuǎn)錄便會被限制在最低本底水平。2終止子

a

:如果在克隆基因編碼區(qū)的3

末端之后，接上一個有效的轉(zhuǎn)錄終止子，便能夠阻止轉(zhuǎn)錄通讀過位于下游另一個啟動子

c:轉(zhuǎn)錄終止子還能增強mRNA分子的穩(wěn)定性,大大提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物水平。在構(gòu)建大腸桿菌表達載體時，通常是添加全部終止密碼子,阻止核糖體跳躍(skipping)現(xiàn)象。大腸桿菌格外偏愛使用終止密碼子UAA,當其后連上一個U而形成四聯(lián)核苷酸的情況下,轉(zhuǎn)譯終止效率便會得到進一步加強。3轉(zhuǎn)譯起始序列mRNA的5

末端之獨特的結(jié)構(gòu)特征,是決定mRNA轉(zhuǎn)譯起始效率的主要因素。在構(gòu)建外源基因的高效表達載體時,需認真選擇有效的轉(zhuǎn)錄起始序列。未鑒定出通用有效的轉(zhuǎn)譯起始序列的保守結(jié)構(gòu)initiationfactorconservedsequenceuniversial4、reportergene其編碼產(chǎn)物可被快速測定的功能單元。追蹤某些特定的DNA結(jié)構(gòu)(重組質(zhì)粒)是否已經(jīng)導(dǎo)入寄主細胞同任何一種目的啟動子連接,其表達活性可作為檢測啟動子功能的依據(jù)。usageβ－半乳糖苷酶基因lacZ、堿性磷酸酶基因、熒光素酶基因(luciferase)基因、半乳糖激酶基因(galK)氯霉素抗性(乙酰轉(zhuǎn)移酶)基因(cat)四環(huán)素抗性基因(tetr)alkalinephosphatase三常用的大腸桿菌表達載體啟動子廣泛使用的大多數(shù)質(zhì)粒表達載體啟動子λ噬菌體的PL啟動子大腸桿菌乳糖操縱子lac啟動子色氨酸操縱子trp啟動子pBR322質(zhì)粒的beta－內(nèi)酰胺酶啟動子LactoseOperon圖1-1在大腸桿菌中基因表達的3個重要信號啟動子核糖體結(jié)合位點基因終止子DNARNA轉(zhuǎn)錄核糖體結(jié)合mRNA位點圖1-2基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游序列的比較TTGACATATAATPu>Py-35區(qū)-30-70正調(diào)控區(qū)-20負調(diào)控區(qū)+1-10區(qū)GC區(qū)….CAAT區(qū)TATAAATPuAPy-40-110+1-20-30增強子CCGCCC或GGGCGG或GGCCAATCTTA原核真核圖1-3通過表達載體在大腸桿菌中被表達PRTTPRTPRmRNA蛋白質(zhì)表達載體外源基因?qū)⑼庠椿虿迦胂拗菩悦盖形稽c轉(zhuǎn)化大腸桿菌圖1-4雜交基因的構(gòu)建和融合蛋白的合成PRTPRT插入外源基因｝ATATTA正確融合N端C端不正確融合外源基因不被翻譯表達ATATTA

GGAGCTGGAGC融合蛋白親和層析法純化化學(xué)試劑除去大腸桿菌肽段圖1-5在大腸桿菌中表達外源基因長遇到的問題翻譯轉(zhuǎn)錄PRTT轉(zhuǎn)錄大腸桿菌不能切除內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄提前終止圖1-6真核細胞表達載體常用的4種啟動子P半乳糖轉(zhuǎn)錄GAL10P甲醇轉(zhuǎn)錄乙醇氧化酶基因（a）GAL啟動子（b）AOX啟動子（c）葡萄糖水解酶啟動子（d）纖維二糖水解酶啟動子P纖維素轉(zhuǎn)錄纖維素二糖水解酶基因P淀粉轉(zhuǎn)錄葡萄糖淀粉酶基因木糖不轉(zhuǎn)錄四真核基因在大腸桿菌中的表達三種表達部位各有不同的優(yōu)缺點//

而且對克隆基因表達產(chǎn)物的制備有很大關(guān)系。在細胞質(zhì)中表達在細胞周質(zhì)中表達以分泌到細胞外的形式表達。1外源基因在大腸桿菌中表達蛋白質(zhì)位置cytoplasmperiplasm1)細胞質(zhì)中表達expressedincytoplasm包含體是存在于細胞質(zhì)中的一種由不可溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)。在表達中應(yīng)盡可能限制包含體產(chǎn)生,并促進形成天然三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。多采用與分子伴侶共表達的方法,可能是增加外源蛋白的可溶性和折疊能力的一種有效途徑。insolublechaperon周質(zhì):指大腸桿菌一類G-菌中，位于內(nèi)膜和外膜之間的細胞結(jié)構(gòu)部分。在大腸桿菌中,已成功的使用了各種不同類型信號肽,將細胞質(zhì)中蛋白的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運至周質(zhì)。周質(zhì)中表達外源蛋白質(zhì)優(yōu)點:A:周質(zhì)中蛋白質(zhì)種類少,周質(zhì)中表達的外源蛋白質(zhì)能夠被有效的濃縮和純化。b:周質(zhì)氧化環(huán)境有利于蛋白質(zhì)按正確的方式折疊c:在周質(zhì)中蛋白質(zhì)降解不廣泛。來自原核、真核的外源基因都成功的在大腸桿菌細胞周質(zhì)中實現(xiàn)了有效表達。2)周質(zhì)中表達expressedin

periplasm3)分泌表達使在大腸桿菌中表達的外源蛋白質(zhì)分泌到胞外培養(yǎng)基中進行分離純化,這種研究思路稱為外源蛋白質(zhì)的分泌表達。目的蛋白穩(wěn)定性高:目的蛋白易于分離目的蛋白末端完整將外源基因與大腸桿菌信號肽編碼序列重組在一起進行分泌表達,其N端的甲硫氨酸殘基可在信號肽剪切過程中被有效除去這些真核基因在大腸桿菌中表達時,蛋白質(zhì)甲硫氨酸殘基往往不能被切除。分泌表達優(yōu)點

:重組人胰島素原若分泌到細胞周質(zhì)中,其穩(wěn)定性大約是在細胞質(zhì)中的10倍許多真核生物成熟蛋白N端不含有甲硫氨酸殘基。intactexcise外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進行分泌型表達;外源基因分泌表達的表達率通常要比包涵體形式低很多分泌表達缺點相對其它生物細胞,大腸桿菌蛋白分泌機制不健全。目前產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌工程菌很少Perfectsound分泌型重組蛋白具有較高比例正確構(gòu)象，對蛋白酶不敏感蛋白質(zhì)的分泌機制原核細胞周質(zhì)中有多種分子伴侶,可阻止分泌蛋白隨機折疊分泌至細胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中重組蛋白很少形成分子間二硫鍵與包涵體相比randomSulferinnerouter重組大腸桿菌--目的蛋白完全分泌分泌型目的蛋白表達系統(tǒng)構(gòu)建有些G-能將細菌的抗菌蛋白（細菌素）分泌到培養(yǎng)基中,這一過程嚴格依賴于細菌素釋放蛋白

,它激活定位于內(nèi)膜上的磷酸酯酶,導(dǎo)致細菌內(nèi)外膜的通透性增大。將細菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個合適的質(zhì)粒上攜帶大腸桿菌信號肽編碼序列和目的基因的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細胞完全分泌型受體細胞轉(zhuǎn)化permeabilitybacteriocin二種類型由報告基因編碼序列和另一個基因啟動子及其它的調(diào)節(jié)序列構(gòu)成。用于研究啟動子功能及調(diào)控作用分子機理。由一種異源蛋白質(zhì)基因編碼序列同寄主細胞誘導(dǎo)型啟動子構(gòu)成。用于生產(chǎn)新型融和蛋白。2融和蛋白質(zhì)表達將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起,并作為一個開放型閱讀框架進行表達。這種雜合基因表達出的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。

2.1融和基因attention外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因下游,為融合蛋白提供終止密碼子。在某些情況下,并不需要完整的受體結(jié)構(gòu)基因2.2融和蛋白的表達策略融合蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建原則受體細胞的結(jié)構(gòu)基因能高效表達,且其表達產(chǎn)物可以通過親和層析進行特異性簡單純化兩個結(jié)構(gòu)基因拼接位點處的序列設(shè)計十分重要,它直接決定融合蛋白的裂解。兩個蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架在DNA水平上，人工設(shè)計引入的蛋白酶切割位點或化學(xué)試劑特異性斷裂位點,可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白Baseonconsistent使克隆外源基因有效轉(zhuǎn)譯有效轉(zhuǎn)譯：取決于核糖體的結(jié)合位點,

受到編碼區(qū)起點核苷酸序列影響?？墒沟鞍踪|(zhì)產(chǎn)物穩(wěn)定,免受寄主胞內(nèi)酶的降解作用,因此可以得到較高的產(chǎn)率?？赡軜?gòu)成一種信號肽指導(dǎo)大腸桿菌蛋白質(zhì)分配到細胞的正確位置。能夠使用親和層析技術(shù)分離純化融合蛋白。2.3表達融合蛋白質(zhì)的優(yōu)點ribosome3整合型異源蛋白的表達工程菌在沒有選擇壓力存在下,可以連續(xù)培養(yǎng)而不丟失目的基因表達盒,

這對以改良物種遺傳性狀為目的的基因工程特別有意義3.1整合形式表達目的蛋白的特點目的基因穩(wěn)定表達目的基因表達率低整合型的目的基因隨受體細胞染色體DNA一起復(fù)制,

在大多數(shù)情況下相當穩(wěn)定單拷貝整合的目的基因表達率受到限制,此時可通過強化表達元件加以補償replicate/stabilitySpecies/improvementintensify轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組同源序列依賴型的體內(nèi)重組3.2DNA體內(nèi)重組的基本原理生物細胞內(nèi)天然存在的一類無復(fù)制能力的DNA可移動因子,不同生物種群擁有結(jié)構(gòu)不同的轉(zhuǎn)位因子噬菌體G片段(G-Fragment)原核微生物插入順序(IS)真核微生物轉(zhuǎn)座子(Tn、Ty)高等植物可移動因子(Ac、Ds)高等動物跳躍基因(mobilegene)轉(zhuǎn)位因子transposon轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組轉(zhuǎn)位因子的結(jié)構(gòu)transposonpalindromerepressorinversionregion整合形式

同源整合同源序列依賴型的體內(nèi)重組同源整合一般地說,距離越遠、長度越長、同源性越高,重組的頻率也就越高,反之亦然。同源整合1基因結(jié)構(gòu)存在很大差異。大多數(shù)真核基因含有內(nèi)含子，細菌細胞中沒有除去內(nèi)含子機制；五大腸桿菌表達真核基因存在的問題2轉(zhuǎn)錄信號不同。真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA分子不具有結(jié)合細菌核糖體所必須的SD序列。細菌RNA聚合酶不能識別真核生物啟動子3mRNA的分子結(jié)構(gòu)有所差異。絕大多數(shù)真核mRNA分子的3

末端有poly(A)尾巴，在5

末端有一個帽結(jié)構(gòu)。影響mRNA在細菌中的穩(wěn)定性及與細菌核糖體相結(jié)合的能力，阻止正常的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯。4真核生物的蛋白質(zhì)有些是通過前體分子加工來的。在細菌中不存在這種修飾作用。5細菌的蛋白酶可以識別和降解真核生物的蛋白質(zhì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失六基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制1工程菌遺傳不穩(wěn)定性表現(xiàn)形式基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)性,具有下列兩種表現(xiàn)形式分配不穩(wěn)定性整個重組DNA分子從受體細胞中逃逸segregativeinstabilitydomainDeletionregionrearrange受體細胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解2工程菌遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生機制外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝能量、物質(zhì)的匱乏和外源基因表達產(chǎn)物的毒性誘導(dǎo)受體細胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，關(guān)閉合成途徑，啟動降解重組質(zhì)粒在受體細胞分裂時的不均勻分配是重組質(zhì)粒逃逸的基本原因受體細胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進重組分子的缺失重排Deletion以構(gòu)建穩(wěn)定性高質(zhì)粒:

將R1質(zhì)粒上的parB基因引入表達型載體中:其表達產(chǎn)物可以選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無質(zhì)粒細胞3改進載體、受體系