儀器分析第四章 高效液相色譜

第四章高效液相色譜1.概述2.HPLC儀器包括：高壓輸液裝置;進(jìn)樣系統(tǒng);別離系統(tǒng);檢測(cè)系統(tǒng);輔助系統(tǒng)3.流動(dòng)相和固定相簡(jiǎn)介4.高效液相色譜方法各論分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜和親和色譜1.液相色譜別離原理及分類和氣相色譜一樣，液相色譜別離系統(tǒng)也由兩相——固定相和流動(dòng)相組成。液相色譜的固定相可以是吸附劑、化學(xué)鍵合固定相〔或在惰性載體外表涂上一層液膜〕、離子交換樹脂或多孔性凝膠；流動(dòng)相是各種溶劑。被別離混合物由流動(dòng)相液體推動(dòng)進(jìn)入色譜柱。根據(jù)各組分在固定相及流動(dòng)相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進(jìn)行別離。色譜別離的實(shí)質(zhì)是樣品分子〔以下稱溶質(zhì)〕與溶劑〔即流動(dòng)相或洗脫液〕以及固定相分子間的作用，作用力的大小，決定色譜過程的保存行為。根據(jù)別離機(jī)制不同，液相色譜可分為：液固吸附色譜、液液分配色譜、化合鍵合色譜、離子交換色譜以及分子排阻色譜等類型。2.高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比較高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需時(shí)數(shù)小時(shí)。高效：填充物顆粒極細(xì)且規(guī)那么，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因而柱效很高。可以在數(shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的別離。高靈敏度：檢測(cè)器靈敏度極高：UV——10-9g,熒光檢測(cè)器——10-11g。3.HPLC與GC的比較液相色譜所用根本概念：保存值、塔板數(shù)、塔板高度、別離度、選擇性等與氣相色譜一致。液相色譜所用根本理論：塔板理論與速率方程也與氣相色譜根本一致。但由于在液相色譜中以液體代替氣相色譜中的氣體作為流動(dòng)相，而液體和氣體的性質(zhì)不相同；此外，液相色譜所用的儀器設(shè)備和操作條件也與氣相色譜不同，所以，液相色譜與氣相色譜有一定差異，主要有以下幾方面：a.分析對(duì)象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點(diǎn)的穩(wěn)定化合物，而這些物質(zhì)只點(diǎn)有機(jī)物總數(shù)的20%；HPLC可以分析高沸點(diǎn)化合物、非揮發(fā)性物質(zhì)、熱不穩(wěn)定化合物、離子型化合物及高聚物等，這類物質(zhì)占有機(jī)物總數(shù)的80%。b.流動(dòng)相的選擇：GC采用的流動(dòng)相中為有限的幾種“惰性〞氣體，只起運(yùn)載作用，對(duì)組分作用?。籋PLC采用的流動(dòng)相為液體或各種液體的混合，可供選擇的時(shí)機(jī)多。它除了起運(yùn)載作用外，還可與組分作用，并與固定相對(duì)組分的作用產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，即流動(dòng)相對(duì)別離的奉獻(xiàn)很大，可通過溶劑來控制和改進(jìn)別離。另外，液相色譜固定相類型多，如離子交換色譜和排阻色譜等，作為分析時(shí)選擇余地大；而氣相色譜并不可能的。4.應(yīng)用由于HPLC別離分析的高靈敏度、定量的準(zhǔn)確性、適于非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定組分的分析，因此，在工業(yè)、科學(xué)研究，尤其是在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等方面應(yīng)用極為廣泛。如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、烴、碳水化合物、藥品、多糖、高聚物、農(nóng)藥、抗生素、膽固醇、金屬有機(jī)物等分析，大多是通過HPLC來完成的。右圖是各種HPLC方法的應(yīng)用范圍及對(duì)象極性增加不溶于水溶于水非極性離子非離子極性吸附反向分配分配正向分配離子交換尺寸排阻凝膠滲透凝膠過濾分子量二、HPLC儀器HPLC儀器包括：高壓輸液裝置;進(jìn)樣系統(tǒng);別離系統(tǒng);檢測(cè)系統(tǒng);此外還配有梯度淋洗、自動(dòng)進(jìn)樣和數(shù)據(jù)處理裝置。其工作過程如以下圖。He儲(chǔ)液瓶分布器過濾2

m高壓泵入口檢查出口檢查脈流消除抽氣過濾器反壓調(diào)節(jié)壓力計(jì)注樣閥分離柱到檢測(cè)器HPLC儀器詳解1.高壓輸液系統(tǒng)1〕貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過濾器(Ni合金)，其孔很約2m，可防止顆粒物進(jìn)行泵內(nèi)。2〕脫氣：超聲波脫氣或真空加熱脫氣。溶劑通過脫氣器中的脫氣膜，相對(duì)分子量小的氣體透過膜從溶劑中除去。3〕高壓泵：高壓輸液泵是高效液相色譜儀中關(guān)鍵部件之一，其功能是將溶劑貯存器中的流動(dòng)相以高壓形式連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng)，使樣品在色譜柱中完成別離過程。對(duì)輸液泵的要求：密封性好、輸液流量穩(wěn)定無脈動(dòng)、可調(diào)范圍寬、耐腐蝕，流量精度和重復(fù)性為0.5%左右。輸液泵種類：恒壓型和恒流型。恒壓泵(類似于風(fēng)箱)可迅速獲得高壓，適于柱的勻漿填充。但因泵腔體積大，在往復(fù)推動(dòng)時(shí)，會(huì)引起脈動(dòng)，且輸出流量隨色譜系統(tǒng)阻力〔主要是柱填充物〕變化而變化，現(xiàn)已較少使用。恒流型溶劑流量恒定，與柱填充情況無關(guān)，使用較多。有機(jī)械注射式和機(jī)械往復(fù)式兩種。應(yīng)用最多的是機(jī)械往復(fù)式恒流泵(見以以下圖。每分鐘往復(fù)25~100次，因此脈動(dòng)小。對(duì)流量變化敏感的檢測(cè)器也會(huì)有噪聲干擾，此時(shí)可連接一脈動(dòng)阻尼器)。馬達(dá)往復(fù)式拉動(dòng)密封溶劑球閥脈動(dòng)阻尼器到色譜柱機(jī)械往復(fù)柱塞泵示意圖4〕梯度洗脫：梯度洗脫就是在別離過程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，從而使流動(dòng)相的強(qiáng)度、極性、pH值或離子強(qiáng)度相應(yīng)地變化，到達(dá)提高別離效果，縮短分析時(shí)間的目的。梯度洗脫裝置分為兩類：一類是外梯度裝置〔又稱低壓梯度〕，流動(dòng)相在常溫常壓下混合，用高壓泵壓至柱系統(tǒng)，僅需一臺(tái)泵即可。另一類是內(nèi)梯度裝置〔又稱高壓梯度〕，將兩種溶劑分別用泵增壓后，按電器部件設(shè)置的程序，注入梯度混合室混合，再輸至柱系統(tǒng)。如果只有一個(gè)泵，可采用低壓混合設(shè)計(jì)〔將兩種或以上的溶劑按一定比例混合，再由高壓泵輸出〕；如果有兩個(gè)或以上泵，調(diào)節(jié)各自的流量，在高壓下混合。梯度洗脫的實(shí)質(zhì)是通過不斷地變化流動(dòng)相的強(qiáng)度，來調(diào)整混合樣品中各組分的k值，使所有譜帶都以最正確平均k值通過色譜柱。它在液相色譜中所起的作用相當(dāng)于氣相色譜中的程序升溫，所不同的是，在梯度洗脫中溶質(zhì)k值的變化是通過溶質(zhì)的極性、pH值和離子強(qiáng)度來實(shí)現(xiàn)的，而不是借改變溫度〔溫度程序〕來到達(dá)。2.進(jìn)樣系統(tǒng)與GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所產(chǎn)生的峰形展寬相對(duì)要小些。即，HPLC的展寬多因一些柱外因素引起。這些因素包括：進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測(cè)器的死體積。進(jìn)樣裝置包括兩種。1〕隔膜注射進(jìn)樣：使用微量注射器進(jìn)樣。裝置簡(jiǎn)單、死體積小。但進(jìn)樣量小且重現(xiàn)性差。2〕高壓進(jìn)樣閥：目前最常用的為六通閥。由于進(jìn)樣量可由樣品管控制，因此進(jìn)樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好，如圖。裝入樣品出口進(jìn)樣采樣環(huán)泵入溶劑進(jìn)色譜柱3.色譜柱1〕對(duì)色譜柱的要求：內(nèi)壁光滑的優(yōu)質(zhì)不銹鋼柱，柱接頭的死體積盡可能小。柱長多為15~30cm，內(nèi)徑為4~5mm(尺寸排阻色譜柱常大于5mm，制備色譜柱內(nèi)徑更大)；2〕柱的填充：主要采用勻漿法。根據(jù)使用勻漿試劑的性質(zhì)不同可分為：平衡密度法：即使溶劑密度和填充顆粒密度相近，此時(shí)顆粒沉降速度趨于0。常用的勻漿試劑有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；非平衡密度法：當(dāng)采用粘度較大的試劑，如CC4，CH3OH,丙酮，二氧雜環(huán)已烷、THF等。填充方法：填充時(shí)，按上述方法制作勻漿液，用流動(dòng)相充滿色譜柱及其延長管中，然后將勻漿液倒入勻漿填充器，在較高壓力下迅速將其注入色譜柱內(nèi)。要求填充速度快(防凝聚、沉降或結(jié)塊)、且無空氣進(jìn)入(影響填充均勻性)。4.檢測(cè)器檢測(cè)器是液相色譜儀的關(guān)鍵部件之一。對(duì)檢測(cè)器的要求是：靈敏度高，重復(fù)性好、線性范圍寬、死體積小以及對(duì)溫度和流量的變化不敏感等。液相色譜檢測(cè)器包括紫外吸收、熒光發(fā)射、示差折光和安培檢測(cè)器等。1〕紫外檢測(cè)器其檢測(cè)原理和UV-Vis方法一樣。只是，此時(shí)所采用的吸收池為微量吸收池，通常其光程為2-10mm,體積約為1~10L。HPLC分析中，約有80%的物質(zhì)可以在254nm或280nm處產(chǎn)生紫外吸收。因此該類檢測(cè)器應(yīng)用很廣。在選擇測(cè)量波長時(shí)注意：溶劑必須能讓所選擇的光透過，即所選波長不能小于溶劑的最低使用波長。石英窗接色譜柱UV光電倍增管廢液波長可的松氟美松皮質(zhì)酮快速掃描—光電二極管陣列〔PDA〕檢測(cè)所獲得的三維色譜-光譜圖2）熒光檢測(cè)器許多有機(jī)物具熒光活性，尤其是芳香族化合物具有很強(qiáng)的活性。熒光檢測(cè)器是一種選擇性很強(qiáng)的檢測(cè)器，其靈敏度比UV檢測(cè)器高2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。3）示差折光檢測(cè)器原理：利用兩束相同角度的光照射溶劑相和樣品+溶劑相，利用二者對(duì)光的折射率不同，其中一束（通常是通過樣品+溶劑相）光因?yàn)榘l(fā)生偏轉(zhuǎn)造成兩束光的強(qiáng)度差發(fā)生變化，將此差示信號(hào)放大并記錄，該信號(hào)代表樣品的濃度。為通用型檢測(cè)器，靈敏度為10-7g/mL。但對(duì)溫度變化敏感，且不適于梯度淋洗。光源調(diào)零光學(xué)零參比樣品平面鏡透鏡光電轉(zhuǎn)換記錄儀放大器遮光板4〕安培檢測(cè)器由恒電位儀和一薄層反響池〔體積為1~5L〕組成。如圖。該檢測(cè)器是利用待測(cè)物流入反響池時(shí)在工作電極外表發(fā)生氧化或復(fù)原反響，兩電極間就有電流通過，此電流大小與待測(cè)物濃度成正比。采用安培檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相必須含有電解質(zhì)，且呈化學(xué)隋性。它最適于與反相色譜匹配。但此檢測(cè)器只能檢測(cè)具有電活性的物質(zhì)。接參比電極和對(duì)電極接色譜柱Teflon塑料塊1cm工作電極(Pt,Au,碳糊)5〕電導(dǎo)檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器主要用于離子色譜的檢測(cè)。其原理是基于待測(cè)物在一些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)〔電阻的倒數(shù)〕變化來測(cè)量電離物質(zhì)的含量。電導(dǎo)檢測(cè)器的主要部件是電導(dǎo)池。其響應(yīng)受溫度影響較大，因此需要將電導(dǎo)池置于恒溫箱中。另外，當(dāng)pH>7時(shí)，該檢測(cè)器不夠靈敏。其它檢測(cè)器還包括：MS、IR、Evaporativelightscatteringdetector(光散射)、極譜等。三、HPLC流動(dòng)相和固定相簡(jiǎn)介〔一〕流動(dòng)相與GC流動(dòng)相不同，HPLC流動(dòng)相為溶劑，它既有運(yùn)載作用，又和固定相一樣，參予對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)，因此溶劑的選擇對(duì)別離十分重要。理想的溶劑應(yīng)有以下特性：1〕對(duì)待測(cè)物具一定極性和選擇性；2〕使用UV檢測(cè)器時(shí)，溶劑截止波長要小于測(cè)量波長〔所謂溶劑的紫外截止波長指當(dāng)小于截止波長的輻射通過溶劑時(shí)，溶劑對(duì)此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，此時(shí)溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測(cè)量〕；使用折光率檢測(cè)器，溶劑的折光率要與待測(cè)物的折光率有較大差異，以到達(dá)最高靈敏度。3〕高純度。由于高效液相色譜靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生雜峰〔偽峰〕，同時(shí)可使截止波長增加。4〕化學(xué)穩(wěn)定性好；5〕適宜的粘度〔粘度適中〕。假設(shè)使用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不利于別離。常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度過低的溶劑也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它們?nèi)菀自谏V柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響別離。四、高效液相色譜方法各論按別離原理可將HPLC分為分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜和親和色譜等?，F(xiàn)在作分別介紹?！惨弧撤峙渖V〔液液色譜〕1.原理根據(jù)各待測(cè)物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而具不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，這種分配平衡需進(jìn)行屢次，造成各待測(cè)物的遷移速率不同，從而實(shí)現(xiàn)別離的過程。2.流動(dòng)相HPLC分析中，為防止固定相的流失，流動(dòng)相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者說二者的極性相差越大越好。因此，根據(jù)流動(dòng)相與固定相極性的差異程度，可將液液色譜分為正相分配色譜〔流動(dòng)相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于極性組分別離〕和反相分配色譜〔流動(dòng)相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性組分別離〕。3.固定相原那么上，用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有幾種，按極性由高到低為：,’-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEM)、三甲撐二醇(TMG)、十八烷(C18)、角鯊?fù)?SQ)。根據(jù)涂漬方法的不同，可將固定相分為機(jī)械涂漬型和化學(xué)鍵合型，后者應(yīng)用更為廣泛。1〕機(jī)械涂漬固定相：將固定液通過機(jī)械混合的方法涂漬到外表多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型載體(5-10%涂布量)上形成的液液色譜固定相。該種固定相最大的缺乏是固定液易流失、別離穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差，不適合梯度淋洗。為減少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，該柱涂有與分析柱相同但有更高含量的固定液，使流動(dòng)相進(jìn)入分析柱之前，預(yù)先被固定液飽和。2〕化學(xué)鍵合固定相將固定液機(jī)械地涂漬在擔(dān)體上組成固定相。盡管選用與固定液不互溶的溶劑作流動(dòng)相，但在色譜過程中固定液仍會(huì)有微量溶解。以及流動(dòng)相經(jīng)過色譜柱的機(jī)械沖擊，固定相會(huì)不斷流失，即使將流動(dòng)相預(yù)先用固定相液體飽和或在色譜柱前加一個(gè)前置柱，使流動(dòng)相先通過前置柱，再進(jìn)入色譜柱，但仍難以完全防止固定液的流失。70年代初開展了一種新型的固定相—化學(xué)鍵合固定相。這種固定相是通過化學(xué)反響把各種不同的有機(jī)基團(tuán)鍵合到硅膠〔載體〕外表的游離羥基上，代替機(jī)械涂漬的液體固定相。這不僅防止了液體固定相流失的困擾，還大大改善了固定相的功能，提高了別離的選擇性，化學(xué)鍵合色譜適用于別離幾乎所有類型的化合物。根據(jù)鍵合相與流動(dòng)相之間相對(duì)極性的強(qiáng)弱，可將鍵合相色譜分為極性鍵合相色譜和非極性鍵合相色譜。在極性鍵合相色譜中，由于流動(dòng)相的極性比固定相極性要小，所以極性鍵合相色譜屬于正相色譜。弱極性鍵合相既可作為正相色譜，也可作為反相色譜。但通常所說的反相色譜系指非極性鍵合色譜。反相色譜在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛。2）化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相是通過化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合在載體表面所形成的柱填充劑，具有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點(diǎn)。這種固定相分離機(jī)理既不是簡(jiǎn)單的吸附，也不是單一的液液分配，而是二者兼而有之?；瘜W(xué)鍵合的表面覆蓋度決定哪種機(jī)理起主要作用。對(duì)多數(shù)鍵合相來說，以分配機(jī)理為主。通常，化學(xué)鍵合相的載體主要是硅膠（表面有硅醇基）：Si-O-R：對(duì)熱不穩(wěn)定、遇水、乙醇等強(qiáng)極性會(huì)水解，使酯鏈斷裂，因此只適于以不含水或醇的流動(dòng)相。Si-R(或Si-N)：不水解，熱穩(wěn)定性比硅酸脂好。但所用的格式反應(yīng)不方便。使用水溶液作流動(dòng)相時(shí)，其pH應(yīng)在4-8之間。Si-O-Si-R：不水解，熱穩(wěn)定性好，在pH2-8范圍內(nèi)對(duì)水穩(wěn)定。4.正相和反相鍵合色譜法

正相鍵合色譜中，隨流動(dòng)相極性增加，組分分配比k增加。

5.化學(xué)鍵合固定相的優(yōu)點(diǎn)〔1〕適用于別離幾乎所有類型的化合物。一方面通過控制化學(xué)鍵合反響，可以把不同的有機(jī)基團(tuán)鍵合到硅膠外表上，從而大大提高了別離的選擇性；另一方面可以通過改變流動(dòng)相的組成和種類來有效地別離非極性、極性和離子型化合物?！?〕由于鍵合到載體上的基團(tuán)不易被剪切而流失，這不僅解決了由于固定液流失所帶來的困擾，還特別適合于梯度洗脫，為復(fù)雜體系的別離創(chuàng)造了條件?！?〕鍵合固定相對(duì)不太強(qiáng)的酸及各種極性的溶劑都有很好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性?！?〕固定相柱效高，使用壽命長，分析重現(xiàn)性好。正相色譜低極性流動(dòng)相反相色譜高極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間待測(cè)物極性：A>B>C正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系時(shí)間，min固定相：C1固定相：C8固定相：C18硅膠-烷基鍵合相中烷基鏈長對(duì)反相色譜分離的影響1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯可見：反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長，分離效果越好?！捕澄缴V〔液固色譜〕1.原理液固色譜的固定相是固體吸附劑。吸附劑是一些多孔的固體顆粒物質(zhì)，位于其外表的原子、離子或分子的性質(zhì)是多少不同于在內(nèi)部的原子、離子或分子的性質(zhì)的。表層的鍵因缺乏覆蓋層結(jié)構(gòu)而受到擾動(dòng)。因此，表層一般處于較高的能級(jí)，存在一些分散的具有外表活性的吸附中心。因此，液固色譜法是根據(jù)各組分在固定相上的吸附能力的差異進(jìn)行別離，故也稱為液固吸附色譜。吸附劑吸附試樣的能力，主要取決于吸附劑的比外表積和理化性質(zhì)，試樣的組成和結(jié)構(gòu)以及洗脫液的性質(zhì)等。組分與吸附劑的性質(zhì)相似時(shí)，易被吸附，呈現(xiàn)高的保存值；當(dāng)組分分子結(jié)構(gòu)與吸附劑外表活性中心的剛性幾何結(jié)構(gòu)相適應(yīng)時(shí)，易于吸附。從而使吸附色譜成為別離幾何異構(gòu)體的有效手段；不同的官能團(tuán)具有不同的吸附能，因此，吸附色譜可按族別離化合物。吸附色譜對(duì)同系物沒有選擇性〔即對(duì)分子量的選擇性小〕，不能用該法別離分子量不同的化合物。2.固定相典型的離子交換樹脂是由苯乙烯和二乙烯苯交聯(lián)共聚而成。其中，二乙烯苯起到交聯(lián)和加牢整個(gè)結(jié)構(gòu)的作用，其含量決定了樹脂交聯(lián)度的大小。交聯(lián)度一般控制在4~16%范圍內(nèi)，高度交聯(lián)的樹脂較硬而且脆，但選擇性較好。在基體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上引入各種不同酸堿基團(tuán)作為可交換的離子基團(tuán)。按離子交換劑類型分四種：按固定相制作方法可分為〔一般主要這三種形式〕：多孔型離子交換樹脂(包括微孔型和大孔型)〔大孔徑網(wǎng)絡(luò)型樹脂〕；外表多孔型(包括薄膜型〕離子交換樹脂〔玻璃珠等硬芯子外表涂一層樹脂薄層構(gòu)成的外表層離子交換樹脂〕；離子交換鍵合型〔純離子交換樹脂〕。1）多孔型：聚苯乙烯+二乙烯苯交聯(lián)，分微孔型和大孔型。交換基團(tuán)多——交換容量大，穩(wěn)定。但易溶脹，傳質(zhì)慢、柱效低、分析速度慢。2）表面多孔型：薄膜型=惰性核+樹脂薄層(1-2

m)多孔型=惰性核+硅膠微球+樹脂薄層?？朔硕嗫仔碗x子交換樹脂的不足，但交換容量低，柱子易超負(fù)荷。3）離子交換鍵合相：利用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面。載體可以是薄殼玻珠，也可以是多孔硅膠微粒。使用后者為載體，可得到性能穩(wěn)定、耐壓、高柱效的柱子。微孔型大孔型微孔微孔薄膜型表面多孔型離子交換層惰性核惰性核離子交換劑硅膠層涂覆3.流動(dòng)相離子交換色譜流動(dòng)相為鹽類緩沖溶液(有一定pH和離子強(qiáng)度)，通過改變pH、緩沖劑類型、離子強(qiáng)度、參加有機(jī)試劑和配位劑等條件來控制分配比k，改變交換劑的選擇性，進(jìn)而影響樣品待測(cè)物的別離。pH值：影響酸或堿的離解平衡，控制組別離子形式所占的分?jǐn)?shù)。當(dāng)組分以分子形式存在時(shí)，那么不被保存；離子分?jǐn)?shù)越高，保存值越大。常用的有檸檬酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽和氨水等。離子強(qiáng)度I：對(duì)保存值的影響比pH更大。組分保存值受流動(dòng)相中鹽類總濃度控制。增加外加陰或陽離子將增加它們對(duì)—R+或—R-的競(jìng)爭(zhēng)能力，使組分保存值減小。通過參加不同種類的鹽，可影響柱的選擇性，因?yàn)椴煌镔|(zhì)對(duì)交換劑的親和能力不同。有機(jī)溶劑：外加有機(jī)溶劑通常減小組分的保存值。其極性越小，保存值越小。常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、乙腈和二氧雜環(huán)已烷等。配離子L：當(dāng)大量L、組分X隨流動(dòng)相進(jìn)入柱后，發(fā)生配位劑交換：RM-L+XRM-X+L該法用于別離各種氨基酸或堿類。(四)離子色譜離子色譜(IC)是70年代開展的新方法。其別離原理與離子交換色譜原理一樣，只是流出的各種離子用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)。但由于流動(dòng)相都是強(qiáng)電解質(zhì)，其電導(dǎo)率比待測(cè)離子約高2個(gè)數(shù)量級(jí)，這種強(qiáng)背景電導(dǎo)會(huì)完全掩蓋待測(cè)離子信號(hào)。為解決此問題，1975年Small提出，在離子交換柱之后，再串結(jié)一根抑制柱。該柱裝填與別離柱電荷完全相反的離子交換樹脂。通過別離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變?yōu)榈捅尘半妼?dǎo)的流動(dòng)相，從而可用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)各種離子的含量。例如：分析陽離子時(shí)，以無機(jī)酸為流動(dòng)相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂，那么發(fā)生以下反響：R+—OH+HCl(流動(dòng)相)——R+—Cl-+H2OR+—OH+MCl(待測(cè)物)——R+—Cl+M+OH-可見，不僅大量酸轉(zhuǎn)化為低電導(dǎo)的水，而且待測(cè)離子轉(zhuǎn)化為具有更大淌度的堿。該法的缺乏之處在于：抑制柱要定期再生、譜峰在經(jīng)過抑制柱后會(huì)展寬，降低別離度。因此有人提出了使用電導(dǎo)率很低的溶液(如苯甲酸鹽稀溶液)作流動(dòng)相。(五)離子對(duì)色譜法〔IPC〕離子色譜對(duì)色譜主要用來別離強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿。原理：將與待測(cè)物離子A電荷相反的離子B〔稱為對(duì)離子或反離子〕參加到流動(dòng)相中，使待測(cè)離子與對(duì)離子形成離子對(duì)AB，該AB離子對(duì)的性質(zhì)與A離子或B離子的性質(zhì)不同，即間接改變了待測(cè)離子的保存特性。例如：固定相為非極性鍵合相，流動(dòng)相為水溶液，于流動(dòng)相中參加與待測(cè)離子A-有相反電荷的離子B+：由于離子對(duì)AB具有疏水性，因而被非極性固定相提取。其它待測(cè)離子A1，A2，A3……..因與B離子間的成對(duì)能力不同，而形成不同疏水性的離子對(duì)，使得各待測(cè)物在柱內(nèi)的保存值不同，從而到達(dá)別離的目的。(六)尺寸排阻色譜法尺寸排阻色譜又稱凝膠(滲透)色譜，主要用于大分子的分子別離。它是基于待測(cè)物分子的尺寸和形狀不同來實(shí)現(xiàn)別離的。1