食品中6種母乳低聚糖的測定離子色譜法

1食品中6種母乳低聚糖的測定離子色譜法1范圍本文件規(guī)定了食品中6種母乳低聚糖的離子色譜測定方法。本文件適用于嬰兒配方食品、較大嬰兒配方食品、幼兒配方食品和特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中2'-巖藻糖基乳糖、3-巖藻糖基乳糖、乳糖-N-四糖、乳糖-N-新四糖、3'-唾液酸乳糖和6'-唾液酸乳糖含量的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗室用水規(guī)格和試驗方法3原理試樣用水稀釋,酶解去除低聚果糖,過濾后,用離子色譜-脈沖安培檢測法測定,外標(biāo)法定量。試樣標(biāo)簽中成分無低聚果糖時,試樣用水稀釋,無需酶解,過濾后,用離子色譜-脈沖安培檢測法測定,外標(biāo)法定量。4試劑與材料除非另有規(guī)定,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T6682規(guī)定的一級水。4.1試劑4.1.1氫氧化鈉溶液[50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))]:色譜純。4.1.2無水乙酸鈉(CH3COONa)。4.1.3氮?dú)?N2):純度≥99.9%。4.1.4果聚糖酶(fructanase):≥2000U/mL。4.2試劑配制4.2.1氫氧化鈉溶液(0.5mol/L):稱取50%氫氧化鈉溶液(見4.1.1)80g(精確至0.01g),用水稀釋至2L,混勻。通入氮?dú)獗Ｗo(hù),密封保存。室溫下可放置1個月。4.2.2乙酸鈉溶液(0.3mol/L):稱取無水乙酸鈉(見4.1.2)49.25g(精確至0.01g,用水溶解并稀釋至2L,混勻,過0.45μm膜。通入氮?dú)獗Ｗo(hù),密封保存。室溫下可放置1個月。4.2.3果聚糖酶溶液(2000U/mL):稱取適量果聚糖酶溶解于水中,混勻,配制成2000U/mL果聚糖酶溶液。該溶液于-18℃可放置3個月。24.3標(biāo)準(zhǔn)品4.3.12'-巖藻糖基乳糖(C18H32O15):純度≥90%,CAS:41263-94-9。4.3.23-巖藻糖基乳糖(C18H32O15):純度≥95%,CAS:41312-47-4。4.3.3乳糖-N-四糖(C26H45NO21)純度≥90%,CAS:14116-68-8。4.3.4乳糖-N-新四糖(C26H45NO21):純度≥95%,CAS:13007-32-4。4.3.53'-唾液酸乳糖鈉鹽(C23H38NO19Na):純度≥98%,CAS:35890-38-1。4.3.66'-唾液酸乳糖鈉鹽(C23H38NO19Na):純度≥98%,CAS:35890-39-2。4.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制4.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:按純度折算后分別準(zhǔn)確稱取適量(精確至0.1mg)標(biāo)準(zhǔn)品(見4.3),用水配制成濃度為2500mg/L的單標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液。標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于-80℃可放置8個月,于-18℃可放置3個月。4.4.2混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液:分別準(zhǔn)確吸取2'-巖藻糖基乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液5.00mL、3-巖藻糖基乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液5.00mL、乳糖-N-四糖標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液2.50mL、乳糖-N-新四糖標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液2.50mL、3'-唾液酸乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液2.50mL和6'-唾液酸乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液2.50mL于25mL容量瓶中,用水定容,混勻。混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液中目標(biāo)分析物的濃度分別為2'-巖藻糖基乳糖500mg/L、3-巖藻糖基乳糖500mg/L、乳糖-N-四糖250mg/L、乳糖-N-新四糖250mg/L、3'-唾液酸乳糖250mg/L和6'-唾液酸乳糖250mg/L。臨用前配制,室溫放置。4.4.3混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液:分別準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(見4.4.2)0.10mL、0.20mL、1.00mL、2.00mL、6.00mL、10.00mL于6個50mL容量瓶,用水定容,混勻,得到2'-巖藻糖基乳糖濃度為1mg/L、2mg/L、10mg/L、20mg/L、60mg/L、100mg/L,3-巖藻糖基乳糖濃度為1mg/L、2mg/L、10mg/L、20mg/L、60mg/L、100mg/L,乳糖-N-四糖濃度為0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、30mg/L、50mg/L,乳糖-N-新四糖濃度為0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、30mg/L、50mg/L,3'-唾液酸乳糖濃度為0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、30mg/L、50mg/L和6'-唾液酸乳糖濃度為0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、30mg/L、50mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)系列工作溶液于-18℃可放置3個月,于2℃~8℃可放置5d。注:如果目標(biāo)分析物的標(biāo)準(zhǔn)品中含有其他目標(biāo)分析物,則該目標(biāo)分析物的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液和標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液應(yīng)單獨(dú)配制。4.5材料4.5.1濾膜:0.45μm。4.5.2燒杯:10mL、500mL和2L。4.5.3離心管:50mL。4.5.4容量瓶:10mL、25mL、50mL和2L。4.5.5注射型過濾器:尼龍,0.2μm。5儀器和設(shè)備5.1離子色譜:配有三元及以上梯度泵、脈沖安培檢測器。5.2分析天平:感量0.01g、0.001g和0.1mg。5.3恒溫水浴鍋:40℃±2℃。5.4磁力攪拌器。35.5渦旋混合器。5.6氮吹儀。5.7超純水儀。6分析步驟6.1試樣制備6.1.1標(biāo)簽中標(biāo)注添加低聚果糖或未知成分的試樣6.1.1.1固態(tài)試樣:準(zhǔn)確稱取試樣25g(m1,精確至0.01g),加水200g(m2,精確至0.01g),磁力攪拌15min。準(zhǔn)確稱取上述液體1g(m3,精確至0.001g)于25mL(V)容量瓶中,加入果聚糖酶溶液15μL(每1g固態(tài)復(fù)溶試樣至少需要果聚糖酶30U),用水定容,混勻并轉(zhuǎn)移至50mL離心管中,加蓋,置于恒溫水浴鍋中40℃酶解30min,酶解后取出并靜置至室溫,注射型過濾器過濾后進(jìn)樣分析。6.1.1.2液態(tài)試樣:準(zhǔn)確稱取試樣1g(m3,精確至0.001g)于25mL(V)容量瓶中,加入果聚糖酶溶液15μL(每1g液態(tài)試樣至少需要果聚糖酶30U),用水定容,混勻并轉(zhuǎn)移至50mL離心管中,加蓋,置于恒溫水浴鍋中40℃酶解30min,酶解后取出并靜置至室溫,注射型過濾器過濾后進(jìn)樣分析。6.1.2標(biāo)簽中標(biāo)注無低聚果糖的試樣6.1.2.1固態(tài)試樣:準(zhǔn)確稱取試樣25g(m1,精確至0.01g),加水200g(m2,精確至0.01g),磁力攪拌15min。準(zhǔn)確稱取上述液體1g(m3,精確至0.001g)于25mL(V)容量瓶中,用水定容,混勻,注射型過濾器過濾后進(jìn)樣分析。6.1.2.2液態(tài)試樣:準(zhǔn)確稱取試樣1g(m3,精確至0.001g)于25mL(V)容量瓶中,用水定容,混勻,注射型過濾器過濾后進(jìn)樣分析。6.2儀器參考條件6.2.1離子色譜參考條件6.2.1.1色譜柱:CarboPacTMPA1預(yù)柱或等效柱(4mm×50mm,粒徑10.0μm)、CarboPacTMPA1分離柱或等效柱(4mm×250mm,粒徑10.0μm)。6.2.1.2柱溫:20℃。6.2.1.3流速:1mL/min。6.2.1.4進(jìn)樣量:5μL。6.2.1.5流動相:A相為水,B相為0.5mol/L氫氧化鈉溶液,C相為0.3mol/L乙酸鈉溶液。離子色譜梯度洗脫條件見表1。表1離子色譜梯度洗脫條件時間/min流動相A/%流動相B/%流動相C/%曲線類型0.0082180線性15.0082180線性25.00721810線性35.00721810線性39.00501832線性49.00501832線性49.0102080線性4表1離子色譜梯度洗脫條件(續(xù))時間/min流動相A/%流動相B/%流動相C/%曲線類型53.0002080線性53.0182180線性60.0082180線性6.2.2脈沖安培檢測器參考條件6.2.2.1參比電極:氯化鉀飽和的銀/氯化銀。6.2.2.2工作電極:金電極。6.2.2.3輔助電極:鈦。6.2.2.4波形:碳水化合物檢測四電位波形。6.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液從低到高依次注入離子色譜儀中,測定相應(yīng)的峰面積。以混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液的峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。6種母乳低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的離子色譜圖示例見圖A.1。6.4試樣溶液的測定將試樣溶液注入離子色譜儀中,根據(jù)保留時間定性(保留時間偏差±2.5%),記錄目標(biāo)分析物的峰面積,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到試樣溶液中目標(biāo)分析物的質(zhì)量濃度。7分析結(jié)果的表述按公式(1)計算試樣中6種母乳低聚糖的含量:×f×C×10-1…………………式中:Xi—試樣中目標(biāo)分析物的含量,單位為毫克每百克(mg/100g);c—由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣溶液中目標(biāo)分析物的濃度,單位為毫克每升(mg/L);V—定容體積,單位為毫升(mL);m3—試樣質(zhì)量,單位為克(g);f—稀釋因子,固態(tài)試樣,液態(tài)試樣f=1;C—轉(zhuǎn)換系數(shù),計算2'-巖藻糖基乳糖、3-巖藻糖基乳糖、乳糖-N-四糖和乳糖-N-新四糖的含量時,C=1;計算3'-唾液酸乳糖和6'-唾液酸乳糖的含量時,3'-唾液酸乳糖鈉鹽和6'-唾液酸乳糖鈉鹽應(yīng)轉(zhuǎn)換成3'-唾液酸乳糖和6'-唾液酸乳糖=0.9665。10-1—換算系數(shù)。計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。注:唾液酸乳糖的相對分子質(zhì)量為633.55,唾液酸乳糖鈉鹽的相對分子質(zhì)量為655.53。58精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不應(yīng)超過算術(shù)平均值的10%。9檢出限及定量限9.1對于固態(tài)試樣,本方法對2'-巖藻糖基乳糖和3-巖藻糖基乳糖的檢出限為9mg/100g,定量限為36mg/100g,對乳糖-N-四糖、乳糖-N-新四糖、3'-唾液酸乳糖和6'-唾液酸乳糖的檢出限為4.5mg/100g,定量限為18mg/100g。9.2對于液態(tài)試樣,本方法對2'-