食品中霉菌和酵母的快速檢測測試片法

1食品中霉菌和酵母的快速檢測測試片法1范圍本文件規(guī)定了霉菌和酵母(moldsandyeasts)的快速檢測-測試片法。本文件適用于食品及加工環(huán)境涂抹樣品中霉菌和酵母的快速計數(shù)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB4789.15食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數(shù)GB19489實驗室生物安全通用要求3設備和材料3.1電子天平:感量0.1g。3.2拍擊式均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋。3.3渦旋混合器。3.4培養(yǎng)箱:28℃±1℃。3.5高壓蒸汽滅菌器。3.6無菌錐形瓶:容量500mL。3.7pH計或精密pH試紙:精密度0.1。3.8無菌吸管:1mL(0.01mL刻度)、10mL(0.1mL刻度)。3.9無菌微量移液器及槍頭:1mL。3.10無菌試管:18mm×180mm。3.11Smartcounter?全自動菌落計數(shù)器。3.12不銹鋼多聯(lián)過濾系統(tǒng)。3.13單片無菌微生物分析濾膜(無菌濾膜):47mm×0.45μm。3.14不銹鋼采樣板:10cm×10cm。4培養(yǎng)基和試劑4.1HandyPlate?快速霉菌酵母測試片。4.2無菌磷酸鹽緩沖液:見附錄A.1。4.3無菌生理鹽水:見附錄A.2。4.41mol/LNaOH溶液:見附錄A.3。4.51mol/LHCl溶液:見附錄A.4。24.6EHK?HK-PBS一次性采樣管。5檢驗程序霉菌酵母測試片法計數(shù)檢驗程序見圖1。yy稀釋液,均質(zhì)yy圖1霉菌酵母測試片法計數(shù)檢驗程序6操作步驟6.1樣品的稀釋6.1.1固體、半固體和液體樣品:取25g(mL)樣品,置于盛有225mL無菌稀釋液(蒸餾水或生理鹽水或磷酸鹽緩沖液)的無菌錐形瓶中,充分振搖,或用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min,制成1∶10的樣品勻液。含有較高活性酶(如面粉、香精香料)或較深顏色色素(如醬油、可樂等)的樣品,可加大稀釋液倍數(shù)(如1∶20)。6.1.2取1mL1∶10樣品勻液注入含有9mL無菌稀釋液的試管中,另換一支1mL無菌吸管反復吹吸,或在渦漩混合器上混勻,此液為1∶100樣品勻液。6.1.3按6.1.2操作制備10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次,換用1支1mL無菌吸管。6.1.4含菌量少的液體樣品(如飲料):取適量(25mL或其他規(guī)定的體積)經(jīng)直徑47mm、孔徑0.45μm無菌濾膜抽濾,再用15mL無菌稀釋液沖洗抽濾。6.1.5加工環(huán)境涂抹樣品:取1支HK-PBS一次性采樣管,取出拭子在食品加工接觸部位沿不銹鋼采樣板擦拭采樣表面(100cm2)從兩個方向(從左到右,然后從上到下)覆蓋整個區(qū)域。將拭子放回含緩3沖液的采樣管中,渦旋混合以充分釋放微生物?；虬?.1.2、6.1.3制備10倍遞增系列稀釋樣品勻液。6.2接種培養(yǎng)6.2.1將測試片置于平坦表面處,揭開上膜。根據(jù)對樣品污染狀況的估計,選擇2個~3個適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),每個稀釋度分別吸取1mL樣品勻液加到快速霉菌酵母測試片中央,每個稀釋度2個平行。靜置至少1min以使培養(yǎng)基凝固。同時分別取1mL無菌稀釋液加入快速霉菌酵母測試片作空白對照,每個稀釋度2個平行。6.2.2含菌量少的液體樣品:使用吸管或移液器將1mL無菌稀釋液加到快速霉菌酶母測試片中央,蓋上上膜,充分擴散均勻后再掀開上膜,將濾膜格柵面朝下置于測試片凝膠上。蓋上上膜,用手輕撫使濾膜和凝膠及上膜緊密貼合,盡量避免產(chǎn)生氣泡。6.2.3加工環(huán)境涂抹樣品:打開一次性采樣管的保護蓋,倒置,將樣液按刻度擠出1mL至快速霉菌酵母測試片上,每組2個平行?；蛉∠♂屢?mL至快速霉菌酵母測試片上,每組2個平行。6.2.4將快速霉菌酵母測試片正面朝上,堆疊不超過20張,放入培養(yǎng)箱中,于28℃±1℃培養(yǎng)48h±2h。如有需要可適當延長培養(yǎng)時間。6.2.5實驗室應根據(jù)需要設置陽性對照、陰性對照,定期對檢驗過程進行質(zhì)量控制。宜選用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)FSCC(T)214001和黑曲霉(Aspergillusniger)FSCC(T)114025或等效標準菌株作為陽性對照菌株,大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)FSCC(T)149009或等效標準菌株作為陰性對照菌株。6.3菌落計數(shù)用肉眼或借助Smartcounter?全自動菌落計數(shù)器計數(shù)霉菌和酵母。霉菌為較大的藍綠色扁平菌落,邊緣不整齊。酵母為較小的藍綠色凸起菌落,邊緣規(guī)則整齊。7結(jié)果與報告7.1結(jié)果7.1.1選取菌落數(shù)為10CFU~150CFU的測試片進行計算,將同一稀釋度的2個測試片菌落數(shù)取平均值,再乘以相應的稀釋倍數(shù)。7.1.2若2個連續(xù)稀釋度的所有測試片菌落數(shù)均在10CFU~150CFU,按公式(1)計算:………式中:N—樣品菌落數(shù);∑C—兩個連續(xù)稀釋度的所有測試片菌落數(shù)之和;n1—低稀釋倍數(shù)測試片個數(shù);n2—高稀釋倍數(shù)測試片個數(shù);d—低稀釋度稀釋因子。示例:稀釋度1∶100(低稀釋度)1∶1000(高稀釋度)菌落數(shù)/CFU132/12616/184N====13272按7.2.2數(shù)字修約后,表示為1.3×104。7.1.2若所有稀釋度測試片上的菌落數(shù)均小于10CFU,則按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。7.1.3若所有稀釋度測試片上的菌落數(shù)均大于150CFU,則按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。7.1.4若所有稀釋度的測試片菌落數(shù)均不在10CFU~150CFU,其中一部分小于10CFU或大于150CFU,則以接近10CFU或150CFU的平均菌落數(shù)乘以相應稀釋倍數(shù)計算。7.1.5若所有稀釋度的測試片均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。7.1.6若所有稀釋度的測試片菌落數(shù)多不可計,則需重復實驗,選取更高稀釋度的樣品稀釋液計數(shù)。7.2報告7.2.1菌落數(shù)按“四舍五入”原則修約。菌落數(shù)在10CFU以內(nèi)時,采用一位有效數(shù)字報告;菌落數(shù)在10CFU~100CFU之間時,采用兩位有效數(shù)字報告。7.2.2菌落數(shù)大于或等于100CFU時,第三位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數(shù)字,后面用0代替位數(shù)來表示結(jié)果;也可用10的指數(shù)形式來表示,此時也按“四舍五入”原則修約后,采用前2位有效數(shù)字。7.2.3若空白對照上有菌落生長,則此次檢測結(jié)果無效。7.2.4稱重取樣以CFU/g為單位報告,體積取樣以CFU/mL為單位報告,環(huán)境樣品以CFU/100cm2為單位報告,報告或分別報告霉菌和/或酵母數(shù)。8廢棄物處置檢測過程中產(chǎn)生的廢棄物按照GB19489的相關(guān)要求進行處置,含微生物的廢棄物應121℃高壓蒸汽滅菌30min后再按相關(guān)規(guī)定處置。5(規(guī)范性)培養(yǎng)基和試劑A.1無菌磷酸鹽緩沖液A.1.1成分A.1.1.1磷酸二氫鉀A.1.1.2蒸餾水A.1.2制法34.0g500mLA.1.2.1貯存液:稱取34.0g磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中,用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2±0.1,用蒸餾水稀釋至1000mL后貯存于冰箱。A.1.2.2稀釋液:取貯存液1.25mL,用蒸餾水稀釋至1000mL,分裝于適宜容器中,121℃高壓蒸汽滅菌15min。A.2無菌生理鹽水A.2.1成分A.2.1.1氯化鈉A.2.1.2蒸餾水B.2.2制法8.5g1000mL稱取8.5g氯化鈉加入1000mL蒸餾水中,攪拌至完全溶解,分裝后,121℃高壓蒸汽滅菌15min,備用。A.31mol/LNaOH溶液A.3.1成分A.3.1.1NaOH40.0gA.3.1.2無菌蒸餾水1000mLA.3.2制法稱取40gNaOH溶于1000mL無菌蒸餾水中。A.4