Claudin 18.2伴隨診斷試劑開(kāi)發(fā)及案例分享

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18.2伴隨診斷關(guān)鍵試劑開(kāi)發(fā)及案例分享

北京義翹神州科技股份有限公司義翹神州義翹神州伴隨診斷助力K藥打了翻身仗2016年6月，默沙東宣布，Keytruda一線單藥治療PD-L1陽(yáng)性表達(dá)（PD-L1≥50%）晚期NSCLC的keynote-024關(guān)鍵III期研究因?yàn)檫_(dá)到主要終端（PFS和OS）而提前終止。2016年8月5日，BMS宣布Opdivo一線單藥治療PD-L1陽(yáng)性表達(dá)（PD-L1＞5%）晚期NSCLC的CheckMate-026關(guān)鍵III期研究未能達(dá)到PFS的主要終點(diǎn)。VSCONTENT免疫組化伴隨診斷試劑概述1義翹神州診斷抗體開(kāi)發(fā)策略2Claudin

18.2的判讀標(biāo)準(zhǔn)3Claudin

18.2的染色評(píng)價(jià)4免疫組化伴隨診斷試劑概述01義翹神州伴隨診斷（CompanionDiagnostics）義翹神州2014年，F(xiàn)DA發(fā)布伴隨診斷指南，正式提出伴隨診斷的定義，明確了伴隨診斷產(chǎn)品是能夠?yàn)橄鄳?yīng)的治療性產(chǎn)品安全有效的應(yīng)用提供關(guān)鍵性信息的體外診斷產(chǎn)品。2016年FDA發(fā)布伴隨診斷產(chǎn)品如何與治療性產(chǎn)品共同開(kāi)發(fā)的指南草案.在該草案中指出作為伴隨診斷試劑，最好在藥物臨床試驗(yàn)開(kāi)展前，試劑的分析性能基本已確定并能夠滿足藥物的要求。在藥物臨床試驗(yàn)中伴隨診斷試劑為入組人群提供關(guān)鍵性信息，最終藥物和試劑同時(shí)獲得上市批準(zhǔn)。2020年FDA正式發(fā)布了對(duì)于同類治療性產(chǎn)品的伴隨診斷試劑說(shuō)明書(shū)更新的指南，對(duì)同時(shí)伴隨同一類治療性產(chǎn)品的伴隨診斷試劑說(shuō)明書(shū)的更新進(jìn)行了規(guī)范。上市申報(bào)途徑premarketapproval，PMAPremarketNotification510(k)2個(gè)HumanitarianDeviceExemption，HDE

2個(gè)123《以臨床價(jià)值為導(dǎo)向的抗腫瘤藥物臨床研發(fā)指導(dǎo)原則》《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》《基于同類治療藥品的腫瘤伴隨診斷試劑說(shuō)明書(shū)更新與技術(shù)審查指導(dǎo)原則(征求意見(jiàn)稿)》義翹神州伴隨診斷的發(fā)展截至目前，F(xiàn)DA獲得批準(zhǔn)的免疫組化伴隨診斷分子有3個(gè)：HER-2、Ki-67、PD-L1。1998年批準(zhǔn)的HER-2伴隨診斷，用于明確哪些患者屬于HER-2異常擴(kuò)增，以便對(duì)癥使用赫賽??；Ki-67與HR、HER-2聯(lián)用定義高危早期乳腺癌患者，以便其使用阿貝西利聯(lián)合內(nèi)分泌療法；PD-L1免疫組化（IHC）檢測(cè)已被批準(zhǔn)作為免疫治療的伴隨或補(bǔ)充診斷，作為免疫治療的療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物，是目前公認(rèn)臨床證據(jù)最為充足且最容易實(shí)現(xiàn)臨床檢測(cè)的標(biāo)志物。廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤中，以識(shí)別或輔助預(yù)測(cè)可能從免疫治療中獲益的患者。/medical-devices/in-vitro-diagnostics/list-cleared-or-approved-companion-diagnostic-devices-in-vitro-and-imaging-tools義翹神州檢測(cè)抗體一致性-藍(lán)印計(jì)劃5個(gè)藥品，5種方法2017年，國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)（InternationalAssociationfortheStudyofLungCancer,IASLC）牽頭發(fā)起藍(lán)印計(jì)劃（TheBlueprintProject,BP）義翹神州claudin18.2做為藥物靶點(diǎn)的潛能被發(fā)掘2008年，被科學(xué)家Sahin發(fā)現(xiàn)CLDN18.2是一種高度選擇性的分子，并且只在癌細(xì)胞中廣泛表達(dá)，它就成為一種理想的靶點(diǎn)2016年ASCO年會(huì)上由Ganymed公司第一次公布了IMAB362的臨床數(shù)據(jù)。

數(shù)據(jù)顯示claudin18.2陽(yáng)性率超過(guò)40%的腫瘤病人能夠從IMAB362治療中獲益Claudin18.2診斷抗體開(kāi)發(fā)策略02義翹神州義翹神州claudin18的功能緊密連接是正常上皮細(xì)胞與細(xì)胞粘附的重要功能組成部分，通過(guò)機(jī)械的方式連接細(xì)胞，形成上皮屏障，組織細(xì)胞間的大分子運(yùn)輸，維持上皮極性。構(gòu)成緊密連接的蛋白有多種，其中claudin蛋白和occladudin蛋白是最關(guān)鍵的蛋白。ItaruHashimotoandTakashiOshima,ClaudinsandGastricCancer:AnOverview.義翹神州抗體開(kāi)發(fā)流程通常一個(gè)抗體的誕生主要包括四個(gè)環(huán)節(jié)：免疫，抗體篩選，抗體純化和抗體驗(yàn)證免疫免疫原選擇免疫原制備宿主生物系統(tǒng)免疫方案篩選高通量篩選方法抗體純化蛋白A抗原親和純度內(nèi)毒素應(yīng)用鑒定WB,IHC,FCM等特異性識(shí)別多種天然樣本劑量，途徑，佐劑，周期等義翹神州免疫原的選擇抗原類型適用情況優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)蛋白天然蛋白構(gòu)象/線性表位結(jié)構(gòu)正確，抗體易識(shí)別天然樣本表達(dá)量低，不易獲得足夠的免疫原，純化困難重組蛋白構(gòu)象/線性表位產(chǎn)量高，表達(dá)純化技術(shù)成熟跟天然蛋白結(jié)構(gòu)有差異多肽線性表位容易合成，純度高修飾特異性抗體種屬特異性/交叉抗體低免疫原性，不具有天然結(jié)構(gòu)DNA構(gòu)象/線性表位無(wú)需純化蛋白蛋白體內(nèi)表達(dá)，更近天然結(jié)構(gòu)低免疫原性細(xì)胞構(gòu)象/線性表位結(jié)構(gòu)正確，抗體已識(shí)別天然樣本細(xì)胞表面蛋白種類復(fù)雜，靶蛋白免疫劑量偏低，影響免疫效果；難度大義翹神州免疫原分析和設(shè)計(jì)ELISAFCMIPWBIHCIF天然蛋白構(gòu)象表位變性或半變性蛋白線性表位ModelstructureofclaudinproteinPrabhsimranjotSingh,SudhamshiToomandYiwuHuang.Anti-claudin18.2antibodyasnewtargetedtherapyfor

advancedgastriccancer.2017親水性，表面可及性和柔性義翹神州宿主生物系統(tǒng)鼠兔費(fèi)用低高類別轉(zhuǎn)換亞型類別轉(zhuǎn)換只有一個(gè)型生產(chǎn)周期短長(zhǎng)多樣性和親和力差強(qiáng)多肽片段等免疫原更難更容易交叉反應(yīng)強(qiáng)無(wú)哺乳動(dòng)物：鼠、綿羊、兔子、山羊雞硬骨魚(yú)駱駝型IgGIgAIgDIgEIgMIgYIgT,IgZHcAbs亞型IgGIgG1IgG2a-cIgG3IgG4IgA1IgA2IgDIgEIgMIgMNone重鏈γ1γ2γ3γ4α1α2δεμντζ輕鏈λκλκλκλκκκλκαλκα義翹神州動(dòng)物免疫方案免疫劑量選擇免疫途徑與部位大鼠50ug-200ug/次皮下皮內(nèi)靜脈脾內(nèi)肌肉小鼠10ug-50ug/次足墊背部腹部耳緣淋巴結(jié)周圍兔子100ug-500ug/次SinoBiologicalInc.篩選方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)雜交瘤技術(shù)操作流程成熟研發(fā)成本低，認(rèn)可度高所制備單克隆抗體特異性好性價(jià)比高，不依賴于設(shè)備制備周期長(zhǎng)基因重排出現(xiàn)非功能輕鏈藥物研發(fā)抗體需要進(jìn)行人源化噬菌體展示基因型與表現(xiàn)型建立聯(lián)系，將重組蛋白篩選與基因篩選合二為一展示抗體來(lái)源于多種B細(xì)胞類型可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募安煌瑧?yīng)用，靈活，特異的設(shè)計(jì)篩選方案長(zhǎng)時(shí)間保存VL/VH天然配對(duì)展示效率存在偏好性。由于是原核表達(dá)，翻譯后修飾等受到限制定性檢測(cè)，需要全抗驗(yàn)證功能活性單細(xì)胞VL/VH天然配對(duì)分選抗原特異性B細(xì)胞特異性好，親和力高，基因多樣性豐富新鮮的樣本組織，如PBMC抗原特異性細(xì)胞比例低，對(duì)抗原要求高操作環(huán)境嚴(yán)格抗體篩選平臺(tái)根據(jù)FDA數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)，全球批準(zhǔn)上市的91個(gè)單抗藥品中，超過(guò)95%的品種為來(lái)自雜交瘤平臺(tái)雜交瘤平臺(tái)仍然占比最高單抗名稱亞型上市日期AdalimumabIgG12002年BelimumabIgG12011年Ranibizumab/2006年RaxibacumabIgG12012年NecitumumabIgG12015年噬菌體做為第二代平臺(tái)發(fā)展速度很快單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)提速抗體研發(fā)義翹神州篩選方案應(yīng)用類型盲篩成功率介入篩選成功率結(jié)果分類成功率IHC24%51.7%I類染色優(yōu)秀83%Ⅱ類染色尚可75%Ⅲ類有染色，同時(shí)有背景43%FACS33%67.1%I類90%Ⅱ類84%Ⅲ類53%Target免疫原融合細(xì)胞數(shù)ELISAIHCClaudin18.1&2sinoA99162640252陽(yáng)性樣本陰性樣本義翹神州篩選方案tissueRNAcDNASCFVphagemidTransformationinfectionlibraryR179-胃癌Target免疫原庫(kù)容表達(dá)抗體IHCClaudin18.1&2sinoA99165*10^8146Claudin18.2的用法和判讀標(biāo)準(zhǔn)02義翹神州Claudin18.2的用法切片3-5μm58?60°C烤片1小時(shí)脫蠟-水化pH9.0EDTA抗原修復(fù)15min

冷卻10min洗滌3%過(guò)氧化氫內(nèi)源性生物素室溫封閉洗滌43-14A單克隆抗體室溫孵育30min洗滌HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗孵育封片顯色觀察DAB顯色5min義翹神州手動(dòng)染色流程Claudin18.2的判讀標(biāo)準(zhǔn)：43-14A免疫組化IRS評(píng)分義翹神州無(wú)（0分）弱（1分）中（2分）強(qiáng)（3分）0%（0分）00001–25%（1分）012326–50%（2分）024651–75%（3分）036976–100%（4分）04812染色強(qiáng)度染色百分比IRS>8分，Claudin18.2陽(yáng)性腫瘤組織IRS≤8分，Claudin18.2陰性腫瘤組織CLAUDETECT?18.2immunohistochemistryassay[Ganymed,Germany]，克隆號(hào)為43-14A義翹神州Claudin18.2的判讀標(biāo)準(zhǔn)-43-14ASahin,etal.FAST:arandomisedphaseIIstudyofzolbetuximab(IMAB362)plusEOXversusEOXaloneforfirst-linetreatmentofadvancedCLDN18.2-positivegastricandgastro-oesophagealadenocarcinoma?zlemTüreci,etal.Characterizationofzolbetuximabinpancreaticcancermodels義翹神州Claudin18.2的判讀標(biāo)準(zhǔn)：抗體EPR19202DottermuschMetal.Expressionofthepotentialtherapeutictargetclaudin-18.2isfrequentlydecreasedingastriccancer:resultsfromalargeCaudasiancohortstudyi)Negative：無(wú)表達(dá)ii)low-gradeexpression：低水平表達(dá) 5%-49%的腫瘤細(xì)胞表達(dá)iii)high-gradeexpression：高水平表達(dá)

大于49%腫瘤細(xì)胞表達(dá)義翹神州Claudin18.2的使用方法和判讀標(biāo)準(zhǔn)密度1+密度2+密度3+百分比＜40%弱陽(yáng)性弱陽(yáng)性弱陽(yáng)性百分比＜40%小于69%弱陽(yáng)性中度陽(yáng)性中度陽(yáng)性百分比≥70%弱陽(yáng)性強(qiáng)陽(yáng)強(qiáng)陽(yáng)ChangsongQi,etal.Claudin18.2-specificCARTcellsingastrointestinalcancers:phase1trialinterimresultsCR41:clone14F8,predilutedmousemonoclonalantibody,CARsgenmadein-house百分比計(jì)算方式=視野中所有的腫瘤細(xì)胞個(gè)數(shù)CLDN18.2染色細(xì)胞個(gè)數(shù)×100%Claudin18.2的染色評(píng)價(jià)03義翹神州分析特異性評(píng)價(jià)：通過(guò)腫瘤和正常組織驗(yàn)證抗體的反應(yīng)性分析靈敏度測(cè)試：陽(yáng)性檢出的能力可重復(fù)性：不同評(píng)分組別進(jìn)行intra-run和intra-day/run的測(cè)試實(shí)驗(yàn)室間再現(xiàn)性評(píng)價(jià)耐用性測(cè)試：針對(duì)不同厚度，不同修復(fù)時(shí)間，修復(fù)溫度，修復(fù)液pH耐受性腫瘤異質(zhì)性評(píng)價(jià)：不同時(shí)期的腫瘤，同一個(gè)體不同蠟塊，同一蠟塊不同切片穩(wěn)定性測(cè)試：試劑盒的穩(wěn)定性，切片穩(wěn)定性伴隨診斷試劑的實(shí)驗(yàn)室研究評(píng)價(jià)義翹神州組化結(jié)果評(píng)價(jià)——一致性43-14A義翹神州肺胃胃癌胃癌胃癌胃癌胰腺癌胃癌43-14A義翹神州Claudin18抗體正常組織的表達(dá)情況扁桃體膽囊肝睪丸肌肉甲狀腺結(jié)腸闌尾淋巴結(jié)腦皮膚脾氣管前列腺乳腺腎腎上腺食管胎盤(pán)小腸心胸腺胰腺支氣管直腸義翹神州義翹神州組化結(jié)果評(píng)價(jià)——多實(shí)驗(yàn)室反饋AdjacentTumorCLDN18.2IHCstain