3.2基因工程的基本操作程序第三步（第五課時(shí)）課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第三章基因工程13.2基因工程的基本操作程序第三步將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2基因表達(dá)載體的構(gòu)建3將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4目的基因的檢測(cè)與鑒定1目的基因的篩選與獲取基因工程培育抗蟲棉的思路：蘇云金桿菌提取Bt抗蟲蛋白基因?qū)朊藁?xì)胞抗蟲棉Bt基因表達(dá)2常用的受體細(xì)胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。方法植物細(xì)胞：動(dòng)物細(xì)胞：微生物細(xì)胞：花粉管通道法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射技術(shù)Ca2+處理法(感受態(tài)細(xì)胞法)由于受體細(xì)胞有植物、動(dòng)物、微生物之分，以及目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同，因此，基因表達(dá)載體的構(gòu)建也會(huì)有差別。2基因表達(dá)載體的構(gòu)建3將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4目的基因的檢測(cè)與鑒定1目的基因的篩選與獲取3將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——植物細(xì)胞:花粉管通道法1.花粉管通道法我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的一種方法。②可以在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。4①可以用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——植物細(xì)胞:花粉管通道法優(yōu)點(diǎn)①利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，將外源基因攜帶進(jìn)

入胚囊，此時(shí)的受精卵未形成細(xì)胞壁，且正在進(jìn)行活躍的DNA復(fù)制，容易將外源DNA片段整合到受體基因組中。②操作簡(jiǎn)單、技術(shù)成本低，免去了組織培養(yǎng)以及誘導(dǎo)再生植株

的全套人工培養(yǎng)過(guò)程。受體細(xì)胞：受精卵5將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——植物細(xì)胞:農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：a.能在自然條件下侵染_____________和___________，而對(duì)大多數(shù)____________沒有侵染能力。雙子葉植物裸子植物單子葉植物隨著轉(zhuǎn)化方法的突破，農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功。采用最多將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——植物細(xì)胞:農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法b.當(dāng)植物體受到損傷時(shí)，傷口處的細(xì)胞會(huì)分泌大量酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌移向這些細(xì)胞，農(nóng)桿菌能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA(可轉(zhuǎn)移的DNA)

轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并將其整合到該細(xì)胞的DNA上。①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——植物細(xì)胞:農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法②載體：農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒（T-DNA)·毒性區(qū)(vir區(qū))︰激活T-DNA的轉(zhuǎn)移·T-DNA區(qū):侵染植物時(shí)，從Ti質(zhì)粒上被切割，轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，帶有與腫瘤形成有關(guān)的基因。該區(qū)內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控序列與真核生物類似，因而可以不在農(nóng)桿菌中表達(dá)而在植物中表達(dá)。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——植物細(xì)胞:農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因插入__________________中，通過(guò)農(nóng)桿菌的________作用，就可以使目的基因__________________并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，使目的基因能夠維持穩(wěn)定和表達(dá)。③利用農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化的思路：Ti質(zhì)粒的T-DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化目的基因進(jìn)入____________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過(guò)程。受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。構(gòu)建表達(dá)載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒表現(xiàn)出新性狀的植株導(dǎo)入植物細(xì)胞植物細(xì)胞將目的基因插入染色體DNA中目的基因Ti質(zhì)粒T-DNA含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌過(guò)程Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞T-DNA攜帶目的基因插入植物細(xì)胞染色體DNA中表達(dá)新性狀植物組織培養(yǎng)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——植物細(xì)胞:農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——植物細(xì)胞:農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法⑤方法①將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生成植株；②可以將花序直接浸沒在含有農(nóng)桿菌的溶液一段時(shí)間，然后培植植株并獲得種子，再進(jìn)行篩選、鑒定等。受體細(xì)胞為_______體細(xì)胞受體細(xì)胞為_______受精卵11將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生成植株；將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法12可以將花序直接浸沒在含有農(nóng)桿菌的溶液一段時(shí)間，然后培植植株并獲得種子，再進(jìn)行篩選、鑒定等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法13該過(guò)程經(jīng)過(guò)____次拼接、____次導(dǎo)入？(1)第一次拼接______________________________________________________________________(2)第二次拼接______________________________________________________________________(3)第一次導(dǎo)入_____________________________________________________________________(4)第二次導(dǎo)入____________________________________________________________________將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上（非人工操作）兩兩將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞（非人工操作）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——植物細(xì)胞:農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法【P83拓展應(yīng)用】

提示：外源基因插入基因組中可能為單位點(diǎn)插人，或者同一染色體多位點(diǎn)插入，或者不同染色體多位點(diǎn)插入。大多數(shù)情況下，插入的位點(diǎn)難以做到定點(diǎn)插入;插入的拷貝數(shù)也是隨機(jī)的。因此，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的遺傳是很復(fù)雜的。

例如，科研人員在對(duì)轉(zhuǎn)GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因）的煙草進(jìn)行基因表達(dá)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)基因植株的染色體DNA中整合了多個(gè)拷貝的基因，從而導(dǎo)致GUS基因失活。除此之外，外源基因丟失、基因重排等也都可能影響外源基因的穩(wěn)定性。15將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——?jiǎng)游锛?xì)胞顯微注射法受精卵注射器固定吸管顯微注射儀將含有目的基因的表達(dá)裁體提純→顯微注射入動(dòng)物的受精卵→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物受體細(xì)胞：受精卵16將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——微生物細(xì)胞1.原核生物的作為受體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)①繁殖快②單細(xì)胞③遺傳物質(zhì)少2.導(dǎo)入方法：Ca2+處理法(感受態(tài)細(xì)胞法)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Ca2+混合表達(dá)載體緩沖液溶于吸收DNA，完成轉(zhuǎn)化使大腸桿菌處于一種易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)

用CaCl2處理大腸桿菌，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞。17將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞——微生物細(xì)胞胰腺提取篩選胰島素mRNA胰島素cDNA逆轉(zhuǎn)錄重組質(zhì)粒質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌mRNA胰島素原胰島素加工用原核生物生產(chǎn)胰島素示意圖注：原核生物作為受體細(xì)胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒有生物活性，需要在體外進(jìn)行再加工。18受體細(xì)胞植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法顯微注射技術(shù)Ca2+處理法受體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法為例：將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上↓轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中↓導(dǎo)入植物細(xì)胞↓整合到受體細(xì)胞的DNA上提純含目的基因的表達(dá)載體↓顯微注射↓受精卵發(fā)育↓具有新性狀的個(gè)體Ca2＋處理細(xì)胞↓感受態(tài)細(xì)胞↓基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合↓