【近代探析測試技術論文：紅外光譜的應用探究4900字】

-13-近代分析測試技術論文：紅外光譜的應用研究摘要微生物檢測常規(guī)方法通常耗時、對樣品有破壞性，并且需要熟練的人員進行操作，無法進行大規(guī)模的無損篩查檢測、實時和現(xiàn)場分析。本項目以黃曲霉、乳酸菌、酵母菌為例，利用熒光光譜技術和紅外光譜技術采集數(shù)據(jù)，對光譜進行比較分析，為拓展光譜在微生物檢測中的快速研究提供理論支撐。三者的紅外光譜展現(xiàn)的官能團的特征峰不相同，黃曲霉在1540cm-1處出現(xiàn)苯環(huán)的變形，表現(xiàn)為其特征峰；酵母菌在2846cm-1處的波動由于C-H的伸縮振動產生；但是乳酸菌在2846cm-1處并未發(fā)生明顯波動，并且乳酸菌的透過率數(shù)值相對于酵母菌透過率的數(shù)值更??；混合菌粉展現(xiàn)出的紅外光譜與單一的菌種相似。三者的熒光光譜展現(xiàn)的不同激發(fā)光產生熒光強度不相同，黃曲霉在波長300nm左右熒光強度較強，酵母和乳酸菌的在500-600nm左右熒光強度較為明顯；混合之后的菌粉展現(xiàn)出與單菌相似的熒光光譜圖，黃曲霉毒素的成分或者所含基團濃度含量有所降低。說明酵母菌和乳酸菌的混合可能延緩或者抑制了黃曲霉的生長。關鍵詞：熒光光譜技術；紅外光譜技術；微生物目錄TOC\o"1-3"\h\u203251引言 1306762材料與方法 294102.1實驗材料 262662.1.1菌株 2179782.1.2培養(yǎng)基 2309682.1.3試劑與儀器 2268032.2方法 235372.2.1樣品制作 2237982.2.2紅外光譜信息采集 386332.2.3熒光光譜信息采集 3132603結果與討論 3142534結論 911311參考文獻 111引言光譜檢測技術是一種方便、實時、無損的檢測技術。熒光光譜是一種分析技術，其理論和方法在化學和生物化學學科中都得到了廣泛的應用，例如研究小分子、合成聚合物、蛋白質和其他生物分子的結構、功能和反應性等。然而，它最近才成為食品科學領域的流行工具。在過去的二十年里，熒光光譜在食品分析中的應用顯著增加，并已被證明是表征各種食品的化學成分、檢測危害和鑒定分析的有用工具。熒光是熒光分子或子結構（稱為熒光團）吸收紫外(UV)或可見(Vis)光后發(fā)射的光[13]。熒光團以特定波長的光的形式吸收能量，并以發(fā)射更長波長的光的形式釋放能量。典型的熒光過程涉及三個步驟，即激發(fā)、振動弛豫/內轉換和發(fā)射。入射光對敏感分子的激發(fā)發(fā)生在飛秒內，在此期間光被分子吸收并轉移到電子激發(fā)態(tài)。振動弛豫/內部轉換是指分子在沒有任何輻射的情況下從高電子激發(fā)態(tài)躍遷到低電子激發(fā)態(tài)的過程。最后的過程包括發(fā)射更長波長的光并將分子返回到基態(tài)。許多化合物在被紫外輻射激發(fā)時會在可見光譜區(qū)域發(fā)出熒光。Marsh[14]及其同事首先報道了在被黃曲霉感染的棉鈴中觀察到亮綠黃色熒光，隨后將棉籽中的黃曲霉毒素與纖維中的亮綠黃色熒光相關聯(lián)。據(jù)報道，熒光是由活植物中的過氧化物酶與曲酸反應產生的，曲酸是由曲霉菌類型形成的。黃曲霉毒素在紫外光照射下會發(fā)生熒光現(xiàn)象，特別是AFB和AFG這兩個主要基團分別可以發(fā)出亮藍色（425-480nm）和藍-綠色（480-500nm）光譜范圍內的熒光。傅里葉紅外光譜法是通過測量干涉圖和對干涉圖進行傅里葉變化的方法來測定紅外光譜。具有高質量的特性，例如快速掃描、額外的靈敏度、價格低廉，已成功用于表征真菌樣品的化學成分。真菌等生物樣品的鑒定和表征不需要更多的時間，只需要少量的真菌樣品，大約15毫克粉末狀樣品。FTIR光譜顯示通過每個樣品的“分子指紋”在基因水平上鑒定和表征曲霉屬的高精度結果。紅外輻射落在樣品上，其中一些被吸收，一些被吸收，吸收的輻射能量與真菌化學成分（如脂肪酸、蛋白質、多糖）中的分子鍵振動和官能團相互作用、碳水化合物、核酸和芳香族化合物，然后顯示特定的波數(shù)，形成每個曲霉樣品的特征光譜[15]。傅里葉變換紅外光譜已成為識別和量化食品中特定成分和摻雜物的強大分析工具。它已廣泛用于食品研究。該技術與原子力顯微鏡和氨基酸分析、差示掃描量熱法、小角X射線散射和原子力顯微鏡等其他技術相結合[16]，已被用于研究食品材料的化學成分、結構和物理性質。傅里葉變換紅外光譜已成功用于檢測花生和玉米中的黃曲霉毒素，具有更好的預測能力和模型性能?；谝陨涎芯?，本項目主要利用三維熒光光譜技術和傅里葉紅外光譜技術對霉菌、酵母菌、細菌等微生物快速檢測進行比較研究，為微生物測定提供新的思路。2材料與方法2.1實驗材料2.1.1菌株工業(yè)菌種中心購買的黃曲霉；實驗室保存乳酸菌，酵母菌。2.1.2培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基，MRS培養(yǎng)基。2.1.3試劑與儀器主要試劑：溴化鉀，無水乙醇，去離子水。儀器：精密天平，壓片機，傅里葉紅外光譜儀，搖床，熒光光譜儀，培養(yǎng)箱，超凈工作臺，滅菌鍋，真空泵抽濾機，冷凍干燥機。2.2方法2.2.1樣品制作挑取黃曲霉單菌落于滅菌的含100mLPDB培養(yǎng)液的錐形瓶中，于28℃，160r/min，振蕩培養(yǎng)24h。將酵母菌液體培養(yǎng)基（5mL菌液接入100mLPDB），在28℃環(huán)境下，用恒溫水浴搖床160r/min振蕩培養(yǎng)24h。將乳酸菌液體培養(yǎng)基乳酸菌（5mL菌液接入100mLMRS液體培養(yǎng)基）在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。將上述菌液分別置于真空泵抽濾機抽濾，用去離子水沖洗三次，轉至塑料平板內，覆上一層保鮮膜（膜上均勻打孔），然后放入冷凍干燥機進行干燥處理，得到菌粉。2.2.2紅外光譜信息采集取菌粉1mg、溴化鉀100mg于瑪瑙研缽充分研磨混合，再用壓片機進行壓片。采集每份樣品的紅外光譜。所有樣品光譜采集紀錄三次并保存光譜數(shù)據(jù)，繪制紅外圖譜。光譜范圍是500-4000cm-1。2.2.3熒光光譜信息采集取紅外光譜信息采集所用的壓片，置于小燒杯中，加去離子水10ml，用玻璃棒攪拌至充分溶解，移入石英比色皿中進行熒光光譜信息采集。所有樣品光譜采集紀錄三次并保存光譜數(shù)據(jù)，繪制熒光圖譜。同步熒光光譜參數(shù)設置：激發(fā)波長（Ex）為200~600nm，增量為1nm，通過同時掃描激發(fā)單色儀和發(fā)射單色儀，在10~180nm范圍內以10nm恒定的間隔波長（△λ），掃描速度為1200nm/min。3結果與討論黃曲霉的紅外光譜圖如圖1所示。在3500-3000cm-1和2000-1000cm-1的光譜區(qū)域，波峰和波谷的變化非常明顯。這些差異可能歸因于樣品的生化成分和紅外光譜的相互作用。該界面生成不同分子和官能團的特征光譜。3400-3300cm-1區(qū)域觀察到的進一步彎曲可能歸因于OH基團的存在。2923cm-1歸屬于亞甲基（-CH2-)組。1024cm-1用于對稱拉伸雙鍵C單鍵O單鍵C或苯基的對稱彎曲。1232cm-1處吸收為C-O-C不對稱伸縮振動。1649cm-1峰歸屬于順式雙鍵拉伸（=C-H）。1399cm-1處表現(xiàn)出特征吸收帶與環(huán)氧樹脂環(huán)相鄰。2,3-二氫呋喃環(huán)拉伸與1079cm-1處的峰相關C-O四氫呋喃與1149cm-1處的峰相關。3004-2969cm-1對于CH2、芳族雙鍵CH、CH、C單鍵C和苯基[17]。值得注意的是，在1540cm-1處出現(xiàn)苯環(huán)的變形，可表現(xiàn)為黃曲霉的特征峰。圖1黃曲霉紅外光譜酵母菌的紅外光譜圖如圖2所示。在3500-1000cm-1的光譜區(qū)域，峰和谷的變化非常明顯，該區(qū)域的特點是各種脂肪酸鏈、磷脂的振動和一些氨基側鏈的振動。CH的典型帶的存在：1649cm-1，C-O酰胺I的軸向變形；1339cm-1，CH3的對稱角變形。在1719cm-1處觀察到與芳環(huán)共軛的羰基，在1506cm-1處觀察到芳烴中的C-C信號。1272cm-1處的譜帶是由于涉及芳族基團碳的不對稱伸展。在1040cm-1處有一個微妙的帶，這是SO3-群對稱振動的特征。544cm-1處的信號對應于芳烴的伸展[18]。有趣的是，在2846cm-1處的波動由于C-H的伸縮振動產生。圖2酵母菌紅外光譜乳酸菌的紅外光譜圖如圖3所示。雖然與酵母菌的紅外光譜相似，可能是因為兩者結構相似，但是也有細微的官能團發(fā)生一定的偏移。乳酸菌收集的4000-500cm-1范圍內的典型紅外光譜數(shù)據(jù)。在1649cm-1處觀察到一個主峰，反射水（O-H）和酰胺I帶（80%C=O拉伸、10%CN拉伸和10%N-H彎曲）。在1079cm-1處觀察到次要峰（C-O拉伸、酯類C-O-C、乳糖碳水化合物C-O拉伸和-NH2變形）、1110cm-1（核糖C-O拉伸、胺NH2搖擺/扭曲）、1065cm-1（核酸和磷脂PO2對稱拉伸/C-O拉伸）和1040cm-1（乳糖、碳水化合物C-O拉伸）[19]。與酵母菌的紅外光譜的不同之處在于在2846cm-1處并未發(fā)生明顯波動，并且乳酸菌的透過率數(shù)值相對于酵母菌透過率的數(shù)值更小。圖3乳酸菌紅外光譜黃曲霉和酵母菌的混合菌粉以及黃曲霉和乳酸菌的混合菌粉的紅外光譜如圖4-5所示，黃曲霉和酵母菌的混合菌粉與酵母菌的紅外光譜相似，可能原因是黃曲霉和酵母菌的混合之后，酵母菌在其中的官能團起主要作用。同樣的，黃曲霉和乳酸菌的混合菌粉的紅外光譜與乳酸菌的紅外光譜也是相似的，官能團結構表現(xiàn)為乳酸菌展現(xiàn)出如上述相似的結構。但是，混合后的紅外光譜圖出現(xiàn)些許跳動的瑕疵，可能是由于黃曲霉的加入出現(xiàn)這種現(xiàn)象。圖4黃曲霉和酵母菌的混合菌粉的混合菌粉紅外光譜圖5黃曲霉和乳酸菌的混合菌粉的混合菌粉紅外光譜進一步對黃曲霉、酵母菌和乳酸菌進行熒光分析。圖6-10顯示了單一菌及混合物的同步熒光光譜圖。圖6-8為黃曲霉、酵母菌和乳酸菌的同步熒光光譜對于Δλ和Ex均表現(xiàn)出從20到180nm和從200到600nm的強度區(qū)域。同步熒光信號由熒光物質產生。在這個時期，這些熒光物質與色素、生育酚、共軛二烯、水解產物、葉綠素和脫鎂葉綠素有關。黃曲霉在波長300nm左右熒光強度較強，可能是黃曲霉毒素發(fā)出的熒光。酵母菌和乳酸菌的在500-600nm左右熒光強度較為明顯，可能是蛋白熒光。對黃曲霉和酵母菌的混合菌粉以及黃曲霉和乳酸菌的混合菌粉的熒光光譜進行分析（圖7-8），發(fā)現(xiàn)通過酵母菌和乳酸菌的混合，500-600nm左右的特征峰依舊存在，而300nm左右黃曲霉的特征峰顏色鮮艷程度變弱了，表明黃曲霉毒素的成分或者基團濃度含量降低了，可能酵母菌和乳酸菌的混合生長可能延緩或者抑制了黃曲霉的生長。結果表明，該方法對菌種的檢測是可行的。圖6黃曲霉熒光光譜圖7酵母菌熒光光譜圖8乳酸菌熒光光譜圖9黃曲霉和酵母菌的混合菌粉的混合菌粉熒光光譜圖10黃曲霉和乳酸菌的混合菌粉的混合菌粉熒光光譜4結論項目利用三維同步熒光和紅外熒光光譜對黃曲霉、酵母菌及乳酸菌進行了快速檢測，表明：（1）黃曲霉、酵母菌及乳酸菌三者的紅外光譜展現(xiàn)的官能團的特征峰不相同。黃曲霉在1540cm-1處出現(xiàn)苯環(huán)的變形，表現(xiàn)為其特征峰。乳酸菌與酵母菌的紅外光譜相似，可能是因為兩者有官能團相似，但是也有細微的官能團發(fā)生一定的偏移，酵母菌在2846cm-1處的波動由于C-H的伸縮振動產生；但是乳酸菌在2846cm-1處并未發(fā)生明顯波動，并且乳酸菌的透過率數(shù)值相對于酵母菌透過率的數(shù)值更小。然而，黃曲霉和酵母菌的混合菌粉展現(xiàn)出的紅外光譜與單一的酵母菌相似；曲霉和乳酸菌的混合菌粉的紅外光譜與乳酸菌的紅外光譜也是相似的，可能原因是黃曲霉在混合菌粉中特征官能團變弱，未展現(xiàn)于紅外光譜中。（2）黃曲霉、酵母菌及乳酸菌三者的熒光光譜展現(xiàn)的不同激發(fā)光產生熒光強度不相同。黃曲霉在波長300nm左右熒光強度較強，酵母和乳酸菌的在500-600nm左右熒光強度較為明顯?；旌现蟮木壅宫F(xiàn)出與單菌相似的熒光光譜圖，在混合后的光譜圖中可以發(fā)現(xiàn)500-600nm左右的特征峰顏色鮮艷，而300nm左右的特征峰顏色鮮艷程度變弱了。而300nm左右的特征峰表現(xiàn)為黃曲霉的特征峰，所以結果表明黃曲霉毒素的成分或者所含基團濃度含量降低了。說明酵母菌和乳酸菌的混合可能延緩或者抑制了黃曲霉的生長?？傮w結果表明，熒光光譜技術聯(lián)合紅外光譜技術有助于及時快速檢測微生物變化。參考文獻[1]王放．食品營養(yǎng)保健原理與技術：中國輕工業(yè)出版社，1996[2]許國龍.正確認識霉菌及其毒素的危害[J].今日畜牧獸醫(yī),2021,37(08):79.[3]王曉佳.飼料中常見霉菌毒素的種類及危害[J].糧油與飼料科技,2021(03):33-38.[4]金昌福,張強,鄭先哲.貯藏稻谷霉菌菌落總數(shù)近紅外光譜預測模型[J].農機化研究,2016,38(10):160-164.[5]劉桐,劉爽,司南,苑帥,任大勇,陳萍.霉菌和酵母菌檢測技術的研究進展[J].農產品加工,2018(12):73-75..[6] 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