SARS病毒滅活疫苗臨床前研究技術(shù)要點

SARS病毒滅活疫苗臨床前研究技術(shù)要點隨著對非典型肺炎的病原學(xué)、流行病學(xué)、診斷和治療等學(xué)科進(jìn)行全面深入的研究，在各領(lǐng)域已取得重要進(jìn)展，尤其是確定了SARS病毒為其病原體，已成功分離到多株SARS病毒，并已驗證其能在Vero細(xì)胞和2BS等細(xì)胞系中培養(yǎng)增殖，這為研制疫苗提供了基礎(chǔ)和基本條件。但是由于SARS病毒的研究有待進(jìn)一步深入，疫苗的研制尚存在很多的不確定因素。為使SARS病毒滅活疫苗的臨床前研究工作科學(xué)規(guī)范，特制定SARS病毒滅活疫苗臨床前研究考慮要點。一、毒種

研究本疫苗所用的毒種須證明為SARS病毒，如該毒種分離自人體，須提供以下資料（一）病毒株名稱及來源

1．名稱

2．宿主情況：

（1）病人姓名、年齡、性別、民族、家庭住址；

（2）發(fā)病地點、發(fā)病日期；

（3）收住入院日期、臨床確診日期、實驗室確診日期；

（4）病人病程及病人轉(zhuǎn)歸：死亡、痊愈、是否有后遺癥；

（5）毒株分離原樣本：

咽試子、漱口液、痰液、血液、糞便或尸解標(biāo)本組織名稱；

（6）取樣日期；

（7）取樣時病人的病期；

（8）取樣地點；

（9）病人是否留有恢復(fù)期血清；

如有：采血日期（病期）和血清量；

鑒于人類咽試子、漱口液、痰液、糞便等樣品難免污染其他外原因子，因此建議盡可能采用病人血液分離的病毒株。（二）毒株分離過程

1．用細(xì)胞分離病毒，須提供所用細(xì)胞名稱、代次、來源和細(xì)胞無菌檢測、外原因子檢測等資料；鑒于VeroE6細(xì)胞的生物學(xué)特性，用VeroE6細(xì)胞分離的SARS病毒不能直接用于疫苗生產(chǎn)用毒種，須將VeroE6細(xì)胞的適應(yīng)株重新轉(zhuǎn)適應(yīng)到Vero細(xì)胞或二倍體細(xì)胞株的毒種方能用于生產(chǎn)，因此建議盡可能使用直接以Vero細(xì)胞或二倍體細(xì)胞株分離的毒種。

2．通過動物分離病毒，須提供所用動物名稱、動物品系、動物級別、動物年齡和制備毒種的動物臟器名稱等資料；如再適應(yīng)到細(xì)胞，則還須提供1．項所述的細(xì)胞資料。（三）病毒分離傳代特性

樣品處理方法、首次盲傳確證病毒陽性代次、病毒確證檢定方法、每代培養(yǎng)天數(shù)、病毒滴度、滴定方法、動物是否發(fā)病或死亡等資料。（四）毒種建立和保存

原始毒種代次、毒種病毒滴度、毒種添加的保護(hù)劑的名稱和濃度、毒種存儲條件。

毒種批的建立應(yīng)按《中國生物制品規(guī)程》疫苗毒種要求進(jìn)行，應(yīng)建立原始毒種、主毒種和工作毒種批三級毒種庫，主種子和工作種子批還須有毒種的限定代次的資料，以證明主種子和工作種子批在規(guī)定代次內(nèi)的生物學(xué)特性與原始毒種一致。（五）毒種的檢定

1．毒種的鑒別試驗：

應(yīng)提供檢定方法、檢定日期、檢定結(jié)果等資料，建議采用下述方法進(jìn)行鑒別試驗：

（1）可使用確診為SARS病人的恢復(fù)期高效價血清中和病毒。

（2）測定中和前后的病毒滴度。

（3）應(yīng)有病毒株的核酸全序列分析的資料，包括序列測定的方案、測定方法和測定結(jié)果，測定結(jié)果應(yīng)附核酸序列圖、推導(dǎo)的氨基酸序列圖、種系發(fā)生樹圖等以進(jìn)一步證明為SARS冠狀病毒。2．毒種的無菌試驗

應(yīng)根據(jù)《中國生物制品規(guī)程》疫苗生產(chǎn)用毒種的要求進(jìn)行無菌試驗檢查。3．毒種的外源因子檢查

應(yīng)用證明為SARS病毒感染的單人份病人血清中和本病毒。完全中和病毒后（如不能一次中和，可用另一病人血清再一次中和后）按下列方法進(jìn)行動物和細(xì)胞檢查。

（1）動物試驗法

小鼠

取15-20g小鼠至少10只，用經(jīng)中和后的病毒懸液，每只腦內(nèi)接種0．03ml，腹腔接種0．5ml。至少觀察21天。解剖所有在試驗24小時后死亡或有患病體征的小鼠，為了檢查病毒感染的證據(jù)，直接肉眼觀察其病理改變，并將有病變的相應(yīng)的組織懸液通過腦內(nèi)和腹腔接種另外至少5只小鼠并觀察21天。如果沒有小鼠表現(xiàn)出病毒感染現(xiàn)象，則病毒種子符合要求。在觀察期內(nèi)至少有80%最初接種的小鼠存活試驗才有效。

乳鼠

出生后24小時以內(nèi)的乳鼠，至少10只，用經(jīng)中和后的病毒懸液，腦內(nèi)接種0．01ml，腹腔接種至少0．1ml。每天觀察，至少14天。解剖所有在試驗24小時后死亡或有患病體征的小鼠，直接肉眼觀察其病理改變，并取有病變的相應(yīng)的組織和腦、脾制備成懸液腦內(nèi)和腹腔接種另外至少5只小鼠并每天觀察，觀察14天。如果沒有小鼠表現(xiàn)出有病毒感染現(xiàn)象，該病毒種子通過試驗。在觀察期內(nèi)至少有80%最初接種的小鼠存活試驗才有效。

（2）細(xì)胞培養(yǎng)法

·非血吸附病毒檢查

中和后的病毒懸液，還應(yīng)分別接種于人源、猴源和生產(chǎn)用的同種不同批的細(xì)胞。如果是利用人二倍體細(xì)胞生產(chǎn)的，還應(yīng)接種另外一株人二倍體細(xì)胞。每種細(xì)胞最少接種6瓶，每瓶病毒懸液接種量不少于培養(yǎng)液總量的25%。于36±1℃培養(yǎng)，觀察二周，或最后一次收獲病毒液時間檢查是否有CPE出現(xiàn)。未見CPE為陰性。

·血吸附病毒檢查

于第6-8天和第14天，每種細(xì)胞分別各取出2瓶進(jìn)行血吸附，一瓶放置2-8℃，一瓶放置20-25℃，30分鐘后顯微鏡下觀察，未見血球吸附現(xiàn)象為陰性。

特別注意：鑒于我國實驗室條件和所用細(xì)胞的不確定因素，用于分離病毒的細(xì)胞常常污染支原體，而細(xì)胞和病毒一旦污染支原體很難清除，為此，提醒對使用的毒種須高度重視，徹底查清毒種是否確已污染支原體，以免所選毒種不符合生產(chǎn)疫苗用毒種，浪費人力、物力、時間和資源。4．毒種的病毒滴度

鑒于目前的研究資料顯示，SARS病毒在Vero細(xì)胞中的復(fù)制滴度一般可達(dá)108，在二倍體細(xì)胞中為106左右，用于疫苗研究的毒種應(yīng)分別達(dá)到上述要求。5．毒種免疫原性檢查

鑒于目前尚無測定疫苗免疫原性的有效方法和標(biāo)準(zhǔn)，建議以實驗性滅活疫苗（即用已建立的毒種庫制備的滅活病毒液）單次或多次免疫動物后采血清測定中和抗體滴度，測定方法應(yīng)為蝕斑形成減少法或細(xì)胞病變抑制法，可能時應(yīng)對所測抗體的種類進(jìn)行分析。用于中和抗體測定的病毒株應(yīng)為非同源株，免疫用動物可考慮家兔、小鼠、豚鼠或其他敏感動物。如有條件時也可測定疫苗的ED506．疫苗候選株病毒的純化問題

新分離的病毒往往是群體病毒毒種，難免存在不同特性的病毒，如毒種病毒滴度和免疫原性未達(dá)要求，必要時可考慮用終末稀釋法或蝕斑形成法挑斑反復(fù)多次純化。滅活疫苗的研制，如毒種病毒滴度和免疫原性能達(dá)到基本要求，可用現(xiàn)有毒種直接制備實驗性疫苗，無須純化。7．毒種的其他檢定

按《中國生物制品規(guī)程》疫苗生產(chǎn)用毒種的要求進(jìn)行二、疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞

鑒于目前SARS病毒對各種細(xì)胞的敏感性研究，以VeroE6細(xì)胞最好，Vero細(xì)胞和二倍體細(xì)胞次之。但VeroE6細(xì)胞不能用于生產(chǎn)，可選擇Vero細(xì)胞、和/或二倍體細(xì)胞進(jìn)行研究。Vero細(xì)胞、二倍體細(xì)胞均為傳代細(xì)胞，因此須建立三級細(xì)胞庫。這兩種細(xì)胞建立細(xì)胞庫和各細(xì)胞庫的各項檢定應(yīng)按《中國生物制品規(guī)程》“生物制品生產(chǎn)用動物細(xì)胞制備及檢定規(guī)程”項下的相應(yīng)要求進(jìn)行。Vero細(xì)胞是由非洲綠猴腎建立的傳代細(xì)胞系，至170代以后已有明顯的致瘤性，一般使用的疫苗生產(chǎn)終末安全代次為160代以前，建議使用Vero細(xì)胞研制疫苗的機(jī)構(gòu)應(yīng)注意該細(xì)胞的資料。三、生產(chǎn)工藝研究

（一）生產(chǎn)工藝的主要技術(shù)參數(shù)

1．病毒與細(xì)胞的接種比例，MOI的最佳參數(shù)。

2．細(xì)胞培養(yǎng)和病毒培養(yǎng)的最佳溫度、培養(yǎng)時間和收獲時間。

3．病毒液的收獲

鑒于Vero作培養(yǎng)基質(zhì)時，后續(xù)純化工藝去除細(xì)胞DNA時的困難，因此建議不作細(xì)胞凍化以提高病毒收獲的做法。

4．滅活或裂解條件及滅活效果的驗證

鑒于SARS病毒的強(qiáng)感染和強(qiáng)傳播特性，滅活劑的選擇和滅活效果的驗證尤為重要，建議如下：·滅活劑

根據(jù)其他疫苗的滅活經(jīng)驗，一般情況下可采用甲醛、β-丙內(nèi)酯或其他有效的滅活劑，如選擇甲醛，其濃度、滅活的作用時間、作用溫度、pH等條件對疫苗的抗原的活性具有較大的影

響，在研究中應(yīng)引起注意；

如用β-丙內(nèi)酯應(yīng)使用95%以上濃度的新試劑，β-丙內(nèi)酯保存時間過長引起自身聚合，影響滅活效果。β-丙內(nèi)酯由于能在疫苗液體中完全水解，不必考慮在成品疫苗中的殘留，因此可考慮在純化前低劑量預(yù)滅活一次，提高生產(chǎn)工序時的安全性，在純化后再滅活一次以確保完全滅活?！缁钚Ч尿炞C

提供病毒滅活驗證的詳細(xì)資料?？刹捎妹舾屑?xì)胞VeroE6盲傳3代，每代用直接免疫熒光驗證無活病毒。

5．病毒液的濃縮和/或活性抗原的提取純化，可考慮用膜過濾法濃縮和柱層析法或區(qū)帶離心法純化或其他有效方法。建議參照其他純化疫苗的要求，對疫苗的總蛋白含量進(jìn)行控制。

6．佐劑

目前能用于疫苗的佐劑僅為鋁佐劑，而鋁佐劑通常使疫苗產(chǎn)生的抗體滯后，且增加注射局部的副反應(yīng)機(jī)率。如疫苗的抗原量能滿足免疫的需要，建議不加佐劑。（二）滅活疫苗的安全性（免疫感染增強(qiáng)作用）

鑒于呼吸道病毒感染的疫苗預(yù)防（麻疹病毒、呼吸道合胞病毒等）易產(chǎn)生滅活疫苗導(dǎo)致免疫感染增強(qiáng)的病理反應(yīng)，因此，本滅活疫苗須排除免疫感染增強(qiáng)作用的潛在危險，為本滅活疫苗的研究、實驗和今后的安全使用提供依據(jù)。但是目前沒有明確的實驗動物模型可以驗證有無免疫感染增強(qiáng)作用，為此建議：可用猴體接種滅活疫苗后再攻擊SARS病毒，一定時間后測定猴體是否產(chǎn)生病毒血癥、臟器是否減少或無病毒抗原、以及作組織病理學(xué)和免疫病理學(xué)等檢查，可以得到初步的證據(jù)。另外也可考慮