胎牛血清中堿性磷酸酶的測(cè)定 熒光分光光度法征求意見(jiàn)稿

2T/SHAIAXXXX—XXXX胎牛血清中堿性磷酸酶的測(cè)定熒光分光光度法本文件規(guī)定了胎牛血清中堿性磷酸酶物質(zhì)含量的熒光分光光度測(cè)定方法。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。3原理基于稀土/核苷酸配位聚合物獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)以及固有良好的生物相容性，制備得到熒光檢測(cè)試劑CIP@SiO2-Ce/ATP-Tris。熒光試劑在295nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，產(chǎn)生363nm和435nm的熒光信號(hào)，當(dāng)熒光試劑加入ALP，進(jìn)行孵育后，363nm處熒光猝滅，435nm處熒光保持穩(wěn)定，通過(guò)I435/I363熒光強(qiáng)度的比值測(cè)定ALP的含量。4儀器設(shè)備4.1熒光分光光度計(jì)：激發(fā)波長(zhǎng)220-730nm；發(fā)射波長(zhǎng)220-900nm。4.2分析天平：感量0.01mg和0.1mg。4.3pH計(jì)：精度±0.05。4.4離心機(jī)：離心力≥8000g。4.5恒溫水浴鍋：能保持（37±0.5）℃。5試劑和材料除非另有說(shuō)明，分析時(shí)均使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭?，?shí)驗(yàn)用水為蒸餾水或去離子水。5.1硝酸鈰。5.2正硅酸乙酯（TEOS）。5.3無(wú)水乙醇。5.4濃氨水。5.5三磷酸腺苷（ATP）。5.6三羥甲基氨基甲烷（Tris）。3T/SHAIAXXXX—XXXX5.7環(huán)丙沙星（CIP）。6分析步驟6.1熒光檢測(cè)試劑CIP@SiO2-Ce/ATP-Tris的制備取環(huán)丙沙星溶于無(wú)水乙醇，去離子水，濃氨水（160mL：40mL:1.5mL）的混合溶液中，得到50molL-1的混合溶液，室溫下超聲30min，得到透明狀液體。然后逐滴加入0.4mL正硅酸乙酯，室溫下機(jī)械攪拌過(guò)夜。反應(yīng)結(jié)束后，離心收集，依次用無(wú)水乙醇和去離子水洗滌，得到CIP@SiO2試劑，用3mL去離子水分散，待用。配置0.25molL-1的硝酸鈰水溶液和0.125molL-1的ATP的Tris-HCl溶液（50mM，pH=7.1）,取2mLCIP@SiO2分散液，磁力攪拌下加入8.3mLATP溶液，攪拌5min后逐滴加入16.7mL硝酸鈰水溶液室溫下繼續(xù)攪拌60min。離心收集，用去離子水洗滌，得到熒光試劑，用3mL去離子水分散，于4℃的冰箱中保存待用。6.2堿性磷酸酶ALP標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。分別量取6.1中熒光檢測(cè)試劑溶液于13組5mL離心管中，分別加入100μL不同濃度的ALP溶液，ALP的Tris-HCl緩沖溶液至3mL，37℃孵育60min，在激發(fā)波長(zhǎng)為295nm，發(fā)射波長(zhǎng)為363nm和435nm條件下，使用1cm石英熒光比色皿，測(cè)量熒光強(qiáng)度，以堿性磷酸酶濃度（U/L）為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度比值I435/I363為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。6.3熒光檢測(cè)試劑CIP@SiO2-Ce/ATP-Tris對(duì)胎牛血清樣品中ALP的熒光檢測(cè)將胎牛血清樣品用Tris-HCl緩沖液稀釋至100倍，然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的相同步驟進(jìn)行熒光檢測(cè)。7檢出限在0.1-20U/L線性范圍內(nèi)，方法檢出限0.0025U/L。8測(cè)量結(jié)果胎牛血清中堿性磷酸酶的單位濃度c（U/L）按照公式（1）計(jì)算：（1）式中：c──胎牛血清中堿性磷酸酶單位濃度，U/L；A──試樣的I435/I363熒光強(qiáng)度比值；a──標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；b──標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；n──胎牛血清樣品的稀釋倍數(shù)。9重復(fù)性每個(gè)樣品平行測(cè)量三次；通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)胎牛血清樣品中的ALP進(jìn)行了測(cè)量。如附表1所示，胎牛血清樣品中ALP的回收率為96.75-104.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.0%。4T/SHAIAXXXX—XXXX型號(hào)LS-55(美國(guó)PerkinElmer公司)儀器測(cè)試條件A.1測(cè)試條件如下：工作參數(shù)a）激發(fā)波長(zhǎng)：295nm；b）發(fā)射波長(zhǎng)：363nm和435nm；c）