《酶工程制藥技術(shù)》課件-左旋多巴

左旋多巴（Levodopa）酶工程的應(yīng)用開篇本文介紹目前研究得最多的同時也是爭議最大的具有神經(jīng)保護潛能的藥物——左旋多巴。左旋多巴是治療帕金森氏病的有效藥物之一。理化性質(zhì)左旋多巴鑒定研究進展合成目錄?提取?用途?檢識方法?理化性質(zhì)具有臨二酚結(jié)構(gòu)，性質(zhì)不穩(wěn)定，極易被空氣中的氧氣氧化變質(zhì)。水溶液久置后，可變黃、紅、紫，直至黑色，高溫、水、光、堿、重金屬可加速其變化。鑒定方法一方法二本品溶于0.1mol/L鹽酸溶液中，遇三氯化鐵溶液顯綠色，將該溶液分兩份，一份加稀氨水顯紫色，另一份加過量的氫氧化鈉溶液顯紅色。本品水溶液加1%茚三酮溶液加熱顯紅色。研究進展60年代末，國外一些學(xué)者開始致力于微生物酶法合成L-DOPA的研究。70年代初，日本學(xué)者Yamada等對微生物酶法合成L-DOPA進行了深入的研究，通過菌種選育及發(fā)酵條件的優(yōu)化于1993年在味之素公司投入工業(yè)化生產(chǎn)。目前國外L-DOPA的產(chǎn)率超過100mg/ml.80年代后期，武漢大學(xué)的彭珍榮等在國內(nèi)首先開展了微生物法合成L-DOPA的研究，但至今國內(nèi)尚未有工業(yè)化的報道。雖然現(xiàn)在國內(nèi)有多家制藥廠生產(chǎn)L-DOPA及其藥劑，但大都是從植物中提取的。L-DOPA的合成

L-DOPA的化學(xué)合成

利用基因工程菌合成L-DOPA從植物中提取L-DOPA1911年人們首次利用3，4-碳酰二氧苯甲醛為原料化學(xué)合成多巴，后來人們還利用胡椒醛、香草醛、兒茶酚、酪氨酸來合成L-DOPA。國內(nèi)還有人用的D-麻黃堿拆分N-乙酰-3-（3，4-二甲氧基苯）-DL-丙氨酸來合成L-DOPA，90年代初人們開始運用基因工程的手段獲取TPL的基因片段，然后連接到不同的載體中讓其在宿主細胞中高效表達。植物中的天然DOPA都是L-型的。目前，從植物中撮L-DOPA由于受到原料來源的限制，產(chǎn)量小，遠不能滿足市場需求。70年代初，國外化學(xué)合成多巴的產(chǎn)量已達150噸。雖用化學(xué)法合成多巴的途徑有許多，但遇到一個主要的困難是合成出來的產(chǎn)品是D-型和L-型的混合物，將二者分開較困難。由于L-DOPA會引起毒性反應(yīng)，因此醫(yī)學(xué)上需控制它的旋光度。1990年，西北大學(xué)的孫曉莉用不對稱催化法合成L-DOPA，但過程復(fù)雜難以工業(yè)化。1913年就有人從蠶豆籽苗種豆莢中提取天然L-DOPA，1949年從野生植物藜豆中撮出L-DOPA。國內(nèi)于1972年從豆科植物藜豆種子中提取L-DOPA獲得成功，1974年商品L-DOPA投放市場。從貓豆中提取L-DOPA的得率，從1.5%已提高到3.25%。90年Kurusu.Y等人構(gòu)建了pGRY30-TPL1質(zhì)粒，此質(zhì)粒含有來自Escherichiaintermedia的酪氨酸酚解酶（I）基因。91年Kurusu,Y等人分析了Escherichiaintermedia中TPL結(jié)構(gòu)基因的核酸序列，91年Fukushima.M等人構(gòu)建了pHTDI質(zhì)粒，比質(zhì)粒在E.coli中能高效地表達產(chǎn)生酪氨酸酚解酶。這個質(zhì)粒產(chǎn)生的酪氨酸酚解酶的量比其親株Escherichiaintermedia多15倍。91年波蘭的Polak.J等人從Cfreundii中提取出TPL基因并構(gòu)建質(zhì)粒。92年Hideyuki.S等人對ErwiniaherbicolaAJ2982的TPL基因克隆到E.coli中進行表達，再將培養(yǎng)的細胞轉(zhuǎn)入多巴合成體系中，反應(yīng)30h后，反應(yīng)液中多巴含量為105mM（20.7mg/ml）。94年，有人將編碼TPL的基因克隆到質(zhì)粒載體pGY1000和pGY4000中并將其轉(zhuǎn)入E.coli中進行表達，用于L-DOPA的生產(chǎn)。至今，利用基因工程菌合成L-DOPA仍無新進展。L-DOPA的提取為了獲得純凈的符合標準的產(chǎn)品，必須有適宜的L-DOPA的提取方法。利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-DOPA，其最終發(fā)酵產(chǎn)物含有許多不溶和可溶性雜質(zhì)，必須采用適當?shù)姆椒ǔミ@些雜質(zhì)，分離出純凈的L-DOPA。從發(fā)酵液中提取L-DOPA的一般步驟為（1）離心去掉菌體等不溶物（2）采用適當方法除去一些可溶性雜質(zhì)，有必要還需脫色（3）濃縮得到結(jié)晶，再采用一定的方法純化，得到純凈的晶體。以L-酪氨酸為底物用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-DOPA，最后的發(fā)酵產(chǎn)物為棕黑色液體，要從其中提取出純凈的L-DOPA，首先必須進行脫色，活性炭脫色法的人們廣為使用脫色方法。但活性炭對各種天然氨基酸具有吸附作用，對芳香族氨基酸表現(xiàn)出最強的吸附力，吸附率達20%左右，因此在L-DOPA提取過程中用活性炭脫色損失較大。近來，有許多研究者研制和尋找新的替代活性炭的脫色劑。L-DOPA的提取HitoshiEnei等TomohisaNagsaki等HitoshiEnei等以活性炭層析法來分離純化L-DOPA，他們將最終發(fā)酵產(chǎn)物的pH用濃鹽酸調(diào)至1.0，然后酸洗，水洗，最后以氨水洗脫，洗脫液經(jīng)濃縮后調(diào)pH至3.5，得到沉淀以酸堿法重結(jié)晶得到純凈L-DOPA，得率56%。TomohisaNagsaki等最終發(fā)酵產(chǎn)物用10%HCI調(diào)pH至2.5；然后離心去掉菌體等不溶物，上清液經(jīng)真空濃縮后，用乙酸乙酯洗兩次，調(diào)pH至4.5，放置過夜得粗結(jié)晶，粗結(jié)晶用等電點沉淀法純化兩、三次，用熱水溶化，重新結(jié)晶兩次，獲得較純晶體，得率為50%。L-DOPA的提取AddyourtitleKatsujihaneda等Kaiser，A.等Kaiser，A.等用硼酸復(fù)合物來提取L-DOPA。SealockR.R和Brenner.M.SealockR.R和Brenner.M.用鉛復(fù)合物法來提取L-DOPA，但此方法步驟較多，且產(chǎn)品中可能有對人體有害的鉛。Blocker.P.等Blocker.P.等用液態(tài)離子交換。Katsujihaneda等采用Dowex50-4X（200-400目）H+-型樹脂來分離L-DOPA。L-DOPA的提取Micker.D.等日本Micker.D.等發(fā)現(xiàn)，在低于30℃的情況下，從過飽和的溶液中結(jié)晶出來的L-DOPA為針形晶體，比高于30℃情況下結(jié)晶出來的立方形晶體更純，針形晶體在加熱的情況下可變成立方體形晶體。日本在L-DOPA的提取方面作了大量的研究，他們向反應(yīng)液中添加L-DOPA的無水結(jié)晶，在25℃以下繼續(xù)反應(yīng)，無水結(jié)晶不斷析出。反應(yīng)在25℃以上可析出一水結(jié)晶，但向其中加入無水結(jié)晶時，析出無水結(jié)晶。條件探索可見-紫外分光光度法檢識方法高效液相色譜法流動注射分析法高效毛細管電泳法左旋多巴為含有一兒茶酚環(huán)的氨基酸,它的芳香環(huán)和-COOH結(jié)構(gòu)決定了分子具有一定的紫外吸收,因此分光光度法是一個可供選擇的定量方法;而它的兒茶酚結(jié)構(gòu)可以發(fā)生氧化還原反應(yīng),為電化學(xué)檢測、比色法和其他衍生化檢測奠定了基礎(chǔ);另外,由于左旋多巴具有α-氨基酸結(jié)構(gòu),因此可應(yīng)用于氨基酸的分析方法(如:HPLC,HPCE等),也將可以應(yīng)用于左旋多巴的測定中。L-DOPA薄層色譜法電化學(xué)傳感器測定法檢識方法

Nagaraja等采用可見分光光度法用于測定制劑中兒茶酚胺衍生物多巴胺、左旋多巴、甲基多巴和腎上腺素方法。該法根據(jù)兒茶酚衍生物在酸性介質(zhì)中鉬酸根離子存在下與重氮磺胺反應(yīng),生成紅色產(chǎn)物進行定量,方法穩(wěn)定,具有良好的靈敏度和準確性。為消除復(fù)方制劑中芐絲肼的干擾或同時測定二者的含量,雙波長分光光度法常用來消除復(fù)方制劑中芐絲肼對左旋多巴的干擾,或同時測定二者的含量。在0.11mol·L-1鹽酸介質(zhì)中,以左旋多巴的最大吸收波長280nm為測定波長,參比波長在264～265nm之間;根據(jù)測試條件的不同,測定前需用對照品進一步確定。檢識方法測定L-DOPA控釋片血藥濃度測定狗爪豆中的左旋多巴應(yīng)用MERCKLichrospher100C18色譜柱（5μm，250mm*4mm）預(yù)柱：Nova-PakC18；柱溫：35℃；流動相：水相（EDTA0.08mmol/L,KH2PO470mmol/L,庚烷磺酸鈉2.08mmol/L）：甲醇（90：10），流速：1.0ml/min。熒光檢測：激發(fā)波長：278nm，發(fā)射波長：325nm，血漿樣品用高氯酸沉淀蛋白后直接進樣。結(jié)果：方法回收率為95.50%～102.55%，最低檢測限為0.25ng，日內(nèi)RSD<4.29%(n=4)，線性范圍為0.125～4.0μg/ml。采用ODS柱，以甲醇-0.01mol/LKH2PO4(25:75,pH3.0)作為流動相，巰嘌呤為內(nèi)標，檢測波長280nm。結(jié)果：實現(xiàn)實現(xiàn)色譜分離,左旋多巴濃度在100～1000mg/L范圍內(nèi)線性良好,r=0.9999,加樣回收率在100.81%～101.42%之間。左旋多巴保留時間及峰形受流動相pH值影響較大。當pH值為3.7時，保留時間較合適，峰形較好。該法回收率高，操作系統(tǒng)誤差小，靈敏度高，重現(xiàn)性好，雜志干擾少。結(jié)論:本法簡便,

準確,重現(xiàn)性好.檢識方法分光光度法檢測Marcolino-Junior等利用左旋多巴在固相反應(yīng)器中與固化在聚酯樹脂上的二氧化鉛(Ⅳ)進行反應(yīng),采用流動注射分光光度法測定片劑中左旋多巴含量,生成的多巴色素在520nm進行測定。線性范圍為110×10-4～110×10-3mol·L-1,最低檢測限810×10-5mol·L-1。電化學(xué)檢測Galvez等選擇了Fe(Ⅲ)/Fe(Ⅱ),VO-3/VO+2等可逆電對作為藥物安培計，用于藥物制劑的測定，檢測效果良好。酶法結(jié)合分光光度法檢測Fatibello-Filho等在測定制劑中左旋多巴與卡比多巴時,應(yīng)用甜馬鈴薯根粗提取物中存在的多酚氧化酶,將兒茶酚胺類物質(zhì)氧化成多巴醌,進而繼續(xù)氧化生成多巴色素,左旋多巴和卡比多巴的氧化產(chǎn)物分別在480和360nm處有強烈吸收,可用分光光度法進行定量。檢識方法CE法測定美多芭片劑中的左旋多巴HPCE測定血清中左旋多巴的含量優(yōu)化了緩沖溶液濃度(50mmol/L的硼砂-HCl緩沖溶液)和pH(pH=8.5)、分離電壓(14kV)和進樣時間（5s）等條件。在優(yōu)化的條件下,15min內(nèi)實現(xiàn)了左旋多巴和羥芐絲肼兩種物質(zhì)的基線分離。左旋多巴在0.06～1.0mg/mL濃度范圍內(nèi)和電泳峰高成線性關(guān)系,檢出限為0.021mg/mL。運用高效毛細管電泳法,75μm石英熔融毛細管總長75cm(有效長度50cm),緩沖液為20mmol/L硼砂,紫外檢測波長280nm,壓力進樣,電壓10kV,溫度25℃。結(jié)果:測定左旋多巴濃度在5～160mmol/L范圍內(nèi)線性良好,r=0.9958,平均加樣回收率97.5%～100.0%。實際樣品分析結(jié)果表明該方法快速、準確、可靠,有望成為該類藥物質(zhì)量控制的一種有效分析方法。本法簡便、高效、快速、靈敏和準確、重現(xiàn)性好的特點,并顯示出樣品用量少、無污染和自動化運行的優(yōu)勢,可為左旋多巴體內(nèi)藥動學(xué)的研究提供可靠的方法?？蔀樽笮喟团R床藥動學(xué)研究提供參考。檢識方法

Percu等采用薄層色譜法在280nm波長處測定了左旋多巴.陳勇等則采用薄層掃描法,在硅膠板上,以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶2)為展開劑,用0.5%茚三酮乙醇溶液顯色,反射式鋸齒掃描,掃描波長λs=350nm,測定了藥用植物貓豆和黎豆中左旋多巴含量。檢識方法

Bergamini等采用屏幕印刷技術(shù)開發(fā)了一種金電極作為電化學(xué)傳感器,該法在9.9×10-5～1.2×10-3mol·L-1的范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,可用于監(jiān)測固定溶液和流動系統(tǒng)中的左旋多巴。該方法穩(wěn)定、靈敏、易于制作和貯存,具有自動化和微型化的潛力。方法成功地用于測定制劑中的左旋多巴,不需進行任何前處理。L-DOPA的用途

多巴的衍生物多巴胺是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，但多巴胺不能通過血腦屏障而進入腦組織，而L-DOPA可以通過血腦屏障，在腦組織中可脫羧形成多巴胺，可增加多巴胺含量而達到治療帕金森氏病的功效。L-DOPA還有其他許多用途，可用來治療腿多動綜合癥、肝昏迷、CO中毒、錳中毒和精神病、心力衰竭、潰瘍病、脫毛癥、調(diào)節(jié)人的性功能等。L-DOPA的用途保健美容人們發(fā)現(xiàn)L-DOPA有抗衰老的神奇功效。在日本有人利用酪氨酸酶將L-酪氨酸轉(zhuǎn)化，經(jīng)L-DOPA氧化形成黑色素，作為染發(fā)的商品出售。L-DOPA是一種在醫(yī)藥衛(wèi)生、保健美容等諸方面有顯著功效的氨基酸衍生物?？古两鹕∽笮喟驮谀X內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟桶?，補充紋狀體中多巴胺的不足，因而具有抗帕金森病的療效。用左旋多巴治療后，約75%的患者獲得較好療效。治療初期療效更顯。治療肝昏迷用左旋多巴能在腦內(nèi)轉(zhuǎn)變?nèi)ゼ啄I上腺素。使正常神經(jīng)活動得以恢復(fù)，患者可由昏迷轉(zhuǎn)為蘇醒。因不能改善肝功能，作用只是暫時性的。左旋多巴的作用特點是：①對輕癥及較年輕患者療效較好，而重癥及年老衰弱患者療效差；②對肌肉僵直及運動困難療效較好，而對肌肉震顫癥狀療效差，如長期用藥及較大劑量對后者仍可見效；③作用較慢，常需用藥2～3周才出現(xiàn)客觀體征的改善，1～6個月以上才獲得最大療效，但作用持久，且隨用藥時間延長而遞增。最新成果日前，治療性克隆技術(shù)治療實驗鼠帕金森氏癥獲得成功，如果該技術(shù)應(yīng)用于人類，研究人員相信今后像拳王阿里所患的帕金森氏癥有望治愈。治療實驗鼠帕金森氏癥獲得了成功，專家認為，這是人類向治療帕金森氏癥邁出了重要的一步。

據(jù)英國媒體報道，美國凱特林癌癥研究所研究人員給患帕金森氏癥的實驗鼠移植了由其自身皮膚細胞克隆產(chǎn)生的神經(jīng)細胞，后者能產(chǎn)生神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)多巴胺，結(jié)果實驗鼠的病情出現(xiàn)明顯改善。帕金森氏綜合征是一種神經(jīng)疾病，主要病因是腦中的多巴胺分泌量不足。研究人員稱，這種利用治療性克隆技術(shù)治療帕金森氏癥的療法前景看好，因為移植的神經(jīng)細胞來自實驗鼠自身，不會被實驗鼠的免疫系統(tǒng)排斥。美國和日本的科學(xué)家能夠從24只試驗鼠身上提取187種胚胎干細胞，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒有排斥反應(yīng)。胚胎干細胞能生成所有其他細胞和組織?？寺⊙芯空呦Ｍ?，有朝一日能夠取一小片皮膚，從中得到胚胎干細胞，然后用于根據(jù)患者定制的治療過程。研究者認為帕金森氏癥也許能夠用上述技術(shù)治療。帕金森氏癥目前不能治愈，原因是某些腦細胞受到了損害。目前治療帕金森氏癥的方法中，有一種是移植腦細胞。干細胞研究者認為，克隆技術(shù)也許能提供更合適的腦細胞。治療性克隆即利用克隆技術(shù)獲取人類早期胚胎，但目的不是將胚胎培育成人，而是為了提取全能型胚胎干細胞，然后在合適的條件下，使其發(fā)育成為所需的細胞甚至器官，用于治療人類疾病。最新突破——帕金森氏癥有藥可救??！沒有排斥反應(yīng)?展望

隨著我國人口老齡化速度的加快，對L-DOPA的需求將迅速增加。而目前國內(nèi)市場上的L-DOPA來源絕大部分依靠進口，如何能使微生物法合成L-DOPA在國內(nèi)投入工業(yè)化生產(chǎn)是一個急待解決的問題。運用現(xiàn)代生物技術(shù)對菌種進行改造，期望獲得高效表達酪氨酸酚解酶的菌株對于提高L-DOPA的產(chǎn)率是非常重要的。另外，固定化細胞法的進一步研究，可提高生產(chǎn)的連續(xù)性、穩(wěn)定性、高效性。雖然L-DOPA的提取方法有多種多樣，但L-DOPA易于氧化，這樣給提取帶來許多不便。又由于L-DOPA大都被用作藥來治療帕金森病，因而對此純度要求很高，這樣對下游提取技術(shù)提出更高的要求。因此，L-DOPA作為藥物被研究開發(fā)成為一個世界性的問題，亟待科研工作者的深入研究。結(jié)束

Thankyou！左旋多巴片左旋多巴片

【英文名】LEVODOPATABLETS【藥品類別】抗震顫麻痹藥【性狀】本品為白色或類白色片。【藥理毒理】本品為擬多巴胺類抗帕金森病藥，左旋多巴為體內(nèi)合成多巴胺的前體物質(zhì)，本身并無藥理活性，通過血腦屏障進入中樞，經(jīng)多巴脫羧酶作用轉(zhuǎn)化成多巴胺而發(fā)揮藥理作用，改善帕金森病癥狀。由于本品可以增加腦內(nèi)多巴胺及去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)，還可以提高大腦對氨的耐受，而用于治療肝昏迷，改善中樞功能，使病人清醒，癥狀改善?！舅幋鷦恿W(xué)】口服后由小腸吸收?？崭狗?~2小時血藥濃度達峰值，廣泛分布于體內(nèi)各組織，1%進入中樞轉(zhuǎn)化成多巴胺而發(fā)揮作用，其余大部分均在腦外代謝脫羧成多巴胺，故起效緩慢。半衰期（t1/2）為1~3小時，如用外周多巴脫羧酶抑制劑，可減少左旋多巴的用量，使之進入腦內(nèi)的量增多，并可減少外周多巴胺引起的不良反應(yīng)?？诜?0%于24小時內(nèi)降解成多巴胺代謝物，主要為高香草酸及二羥苯乙酸，由腎臟排泄，有些代謝物可使尿變紅色。原型排出體外約5%，可通過乳汁分泌?！具m應(yīng)癥】用于帕金森病及帕金森綜合征?！居梅ㄓ昧俊靠诜_始一次250mg，一日2~4次，飯后服用。以后視患者耐受情況，每隔3~7日增加一次劑量，增加范圍為每日125~750mg，直至最理想的療效為止。每日最大量6g，分4~6次服用。腦炎后及老年患者應(yīng)酌減劑量。【不良反應(yīng)】常見的不良反應(yīng)有：惡心，嘔吐，直立性低血壓，頭、面部、舌、上肢和身體上部的異常不隨意運動，精神抑郁，排尿困難。較少見的不良反應(yīng)有：高血壓、心律失常、溶血性貧血?！窘砂Y】嚴重精神疾患、嚴重心律失常、心力衰竭、青光眼、消化性潰瘍和有驚厥史者禁用?！咀⒁馐马棥扛哐獕骸⑿穆墒С?、糖尿病、支氣管哮喘、肺氣腫、肝腎功能障礙、尿潴留者慎用。有骨質(zhì)疏松的老年人，用本品治療有效者，應(yīng)緩慢恢復(fù)正常的活動，以減少引起骨折的危險。用藥期間需注意檢查血常規(guī)、肝腎功能及心電圖。【孕婦及哺乳期婦女用藥】本品可分泌入乳汁，也會減少乳汁分泌；動物實驗表明本品可引起內(nèi)臟和骨骼畸形。孕婦及哺乳期婦女應(yīng)禁用。左旋多巴片取本品10片，精密稱定，研細，精密稱取適量（約相當于左旋多巴30mg），置100ml量瓶中，加鹽酸溶液（9→1000）適量，振搖使左旋多巴溶解，用鹽酸溶液（9→1000）稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10ml，置另一100ml量瓶中，加鹽酸溶液（9→1000）稀釋至刻度，搖勻，照紫外-可見分光光度法，在280nm的波長處測定吸光度，按C9H11NO4的吸收系數(shù)（E1%/1cm）為136-146。計算即得。檢識方法（藥典方法）帕金森氏病

帕金森氏病又稱震顫麻痹，是中老年人最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。是一種以震顫、肌強直、運動遲緩和姿勢障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病,主要病因是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的進行性減少。其得名是因為一個名為帕金森的英國醫(yī)生首先描述了這些癥狀，包括運動障礙、震顫和肌肉僵直。目前其病因仍不清楚，醫(yī)學(xué)界沒有治愈該病的有效方法，但科學(xué)家正在不斷地努力探索。帕金森氏病的治療現(xiàn)在主要還是綜合地運用各種方法來阻止或者是延緩它的發(fā)生和發(fā)展，效果還是比較好的。左旋多巴又稱L-多巴（L-DOPA）化學(xué)名：L-3,4-二羥基苯丙氨酸（L-3，4-Dihydroxylphenylalanin）PrintPagePrinttopicshereTransitionalPageBackdrops:-Thesearefullsizedbackdrops,justscalethemup!-CanbeCopy-PastedoutofTemplatesforuseanywhere!CONTENTSAddyourtitleAddyourtitlewelcometousethesepowerpointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperiencewelcometousethesepowerpointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperienceCONTENTSAddyourtitlewelcometousethesepowerpointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperienceAddyourtitlewelcometousethesepowerpointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperienceAddyourtitlewelcometousethesepowerpointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperienceCONTENTSwelcometousethesepowerpointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperiencewelcometousethesepowerpointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperienceCONTENTSAddyourtitleAddyourtitleAddyourtitlewelcometousethesepowerpointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperiencewelcometousethesepowerpointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperiencewelcomet