(高清版)GB∕T 37966-2019 納米技術(shù) 氧化鐵納米顆粒類過氧化物酶活性測量方法

GB/T37966—2019納米技術(shù)氧化鐵納米顆粒類過氧化物酶活性測量方法國家市場監(jiān)督管理總局中國國家標準化管理委員會GB/T37966—2019 I Ⅱ 3術(shù)語和定義、縮略語 25儀器與試劑 2 3 48測量結(jié)果處理 6 6附錄A(資料性附錄)儀器準備 7附錄B(資料性附錄)氧化鐵納米顆粒鐵元素質(zhì)量濃度測量 附錄C(資料性附錄)氧化鐵納米顆粒類過氧化物酶活性計算及不確定度評定實例 IGB/T37966—2019本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由中國科學(xué)院提出。本標準由全國納米技術(shù)標準化技術(shù)委員會(SAC/TC279)歸口。學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所、江蘇省計量科學(xué)研究院、基蛋生物科技股份有限公司、南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)中心。GB/T37966—2019氧化鐵納米顆粒由于豐富的磁學(xué)特性和良好的生物相容性而在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，性和類過氧化氫酶活性，這不僅拓展了磁性納米材料的應(yīng)用，也使模擬酶的研究從有機復(fù)合物拓展到無機納米材料。目前，大量的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究被報道，40多種納米顆粒，包括四氧化三鐵(Fe?O?)、γ-三氧化二鐵(y-Fe?O?)、四氧化三鈷(Co?O?)、氧化銅(Cu?O)、錳鐵氧體(MnFe?O?)、硫化鐵(FeS)、氧化鈰(CeO?)、普魯士藍(PB)、金(Au)、鉑(Pt)、石墨烯、富勒烯、碳納米管等，被發(fā)現(xiàn)具有類過氧化物酶活性和其他模擬酶活性，其中尤以Fe、Co、Cu、Mn等具有變價的Fenton元素化合物納米顆粒最為典型，并且在生物、醫(yī)學(xué)、環(huán)境、農(nóng)業(yè)等多個領(lǐng)域獲得應(yīng)用。納米顆粒模擬酶相對于天然酶具有簡單易得、穩(wěn)定、成本低的優(yōu)勢，同時具有依賴于尺寸和表面可調(diào)的類酶活性，還兼具磁性、光學(xué)等其他多功能特性，因此更具研究意義和廣泛的應(yīng)用價值。納米顆粒類過氧化物酶活性是指單位質(zhì)量或體積樣本中酶活性單位數(shù)。由于納米顆粒類酶活性顯前研究報道的納米顆粒類酶活性數(shù)據(jù)難于比較，即使相同種類的納米顆粒，其尺寸、表面等理化性質(zhì)差異以及不同的測試條件都可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)不具可比性。因此，建立一種納米顆粒類酶活性測量和評價的標準方法至關(guān)重要。本標準為發(fā)展相關(guān)檢測和醫(yī)學(xué)診療試劑，以及環(huán)境、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中納米材料類酶活性的評價提供了參考。1GB/T37966—2019納米技術(shù)氧化鐵納米顆粒類過氧化物酶活性測量方法1范圍本標準規(guī)定了氧化鐵納米顆粒類過氧化物酶活性的測量方法。本標準適用于采用分光光度計對氧化鐵(如三氧化二鐵、四氧化三鐵等)納米顆粒類過氧化物酶活性進行測量和評價。其他納米顆粒的類過氧化物酶活性測量亦可參考。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T19267.2刑事技術(shù)微量物證的理化檢測第2部分：紫外-可見吸收光譜法下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1.1三個維度的外部尺寸都在納米尺度的納米物體。[GB/T32269—2015,定義4.1]3.1.2酶活性enzymeactivity酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力。注1:酶活性大小可以用在一定條件下酶催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率來表示。注2:在本標準中氧化鐵納米顆粒類過氧化物酶活性是指單位Fe元素質(zhì)量對應(yīng)的氧化鐵納米顆粒所含酶活性單位注3:酶活性單位：國際生物化學(xué)協(xié)會酶學(xué)委員會推薦使用國際單位，即在規(guī)定條件下，每分鐘催化一微摩爾(μmol)底物的酶量為一個國際單位(IU),簡稱U。1U=1μmol·min-1。3.2縮略語下列縮略語適用于本文件。DMSO:二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide)H?O?:過氧化氫(Hydrogenperoxide)NPs:納米顆粒(Nanoparticles)SOP:標準操作方法(StandardOperationProcedure)2GB/T37966—20194原理如圖1所示，采用3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)作為測量底物，在37℃和酸性條件(pH=3.6)下經(jīng)氧化鐵納米顆粒的催化，TMB被H?O?氧化為藍色的TMB衍生物，該衍生物在650nm波長下有特征吸收峰。在37℃、650nm波長下檢測反應(yīng)溶液吸光度隨時間的變化，并根據(jù)朗伯比爾定律計算出單位時間內(nèi)TMB衍生物的生成量，從而得到氧化鐵納米顆粒所含酶活性單位數(shù)(bmmo)。將bmmo除以加入的氧化鐵納米顆粒的鐵元素質(zhì)量，得到單位鐵元素質(zhì)量的氧化鐵納米顆粒所含酶活性單位數(shù)(amam),即氧化鐵納米顆粒類過氧化物酶活性。吸光度吸光度一一AA/AAA/A0時間/sTM3十H?O?5儀器與試劑5.1儀器與器具器等。儀器準備參見附錄A。儀器測試波長范圍應(yīng)包括650nm,具有“動力學(xué)模式”。吸光度準確度±0.005,波長準確度(650±1)nm,光譜帶寬≤2nm。儀器校正及實驗條件的設(shè)定應(yīng)符合GB/T19267.2的規(guī)定。用來測量樣品溶液溫度，誤差±1.5%,靈敏度±0.1℃。用來測量樣品溶液pH,準確度等級為0.01級，靈敏度±0.01。5.1.5恒溫水浴箱與分光光度計連接，控制比色皿槽恒溫為(37±1)℃。用來稱量試劑質(zhì)量，最小分度值0.01mg,重復(fù)性(校驗砝碼)≤0.015mg(5g)。3GB/T37966—2019200μL、1000μL可調(diào)移液器。10mL、100mL容量瓶。5.2試劑所用試劑見表1。分類化學(xué)名稱別名/縮略語試劑無水乙酸鈉(分析純)醋酸鈉無水乙酸(分析純)冰醋酸3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(分析純)30%H?O?雙氧水溶劑高純度水電導(dǎo)率<2μS·cm-1,pH6～7無二甲基亞砜DMSO標準物質(zhì)鐵單元素標準溶液(GBW08616)無鄰苯二甲酸氫鉀(GBW(E)130070)無混合磷酸鹽(GBW(E)130071)無6溶液配制6.1一般要求配制溶液時各成分給出的質(zhì)量是指100%含量。如果化學(xué)物質(zhì)的含量低于100%[例如y(%)],則應(yīng)用因子：Fcontent=100/y,計算出與給出質(zhì)量相當?shù)哪郴瘜W(xué)物質(zhì)的質(zhì)量。溶液的配制要求應(yīng)符合GB/T19267.2的規(guī)定。使用天平稱量時，稱量差異不應(yīng)超過±0.5%。摩爾吸光系數(shù)具有顯著的pH依賴性。因此，應(yīng)嚴格校準pH計和調(diào)整緩沖液的pH值。使用至少兩種標準緩沖液進行校準，校準緩沖液的定值包括的范圍應(yīng)包含或接近本標準中反應(yīng)的pH值。稱量醋酸鈉0.164g,溶解于8mL水，轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，加水至容量瓶刻度得0.2mol·的醋酸鈉溶液。4GB/T37966—2019將適量兩種溶液混勻測pH,并用少量0.2mol·L-1的冰醋酸溶液或0.2mol·L-1的醋酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH至3.6(37℃),得0.2mol·L-1,pH=3.6的冰醋酸/醋酸鈉緩沖液。該溶液2℃~8℃保質(zhì)期為3個月。6.3溶液2稱量TMB0.10g溶于8mLDMSO中制成穩(wěn)定的分散液，轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，加DMSO至容量瓶刻度得10g·L-1TMB的DMSO溶液。該溶液2℃~8℃避光保存，保質(zhì)期為1個月，宜分裝保存。使用時應(yīng)使其充分溶解，避免反復(fù)凍融，觀察是否變色，并采用紫外可見分光光度計檢驗其吸收光譜是否發(fā)生變化。如果發(fā)生變化則嚴禁使用，并重新配制。6.4納米顆粒分散液將待測的氧化鐵納米顆粒分散液用水稀釋至適宜濃度。7測量步驟7.1測量條件具體測量條件見表2。參數(shù)指標溫度檢測波長光程孵育時間測量時間讀點數(shù)7.2測量步驟7.2.2開啟恒溫水浴箱，監(jiān)測比色皿內(nèi)溫度，達到37℃時開始準備試劑與待測液。7.2.3將適當體積的溶液1、氧化鐵納米顆粒分散液、溶液2和30%H?O?在恒溫水浴中平衡到37℃。7.2.4將上述溶液按表3的體積和順序加入到反應(yīng)杯中。表3測量步驟體積步驟溶液1加入到反應(yīng)杯中，并且平衡至37℃氧化鐵納米顆粒分散液加入到反應(yīng)杯中，充分混合5GB/T37966—2019表3(續(xù))體積步驟溶液2加入到反應(yīng)杯中，充分混合，孵育60s。在孵育結(jié)束時，反應(yīng)杯中的溶液溫度應(yīng)達到37℃加入到反應(yīng)杯中，充分混合，轉(zhuǎn)移適量反應(yīng)液至比色皿中，測量規(guī)定時間內(nèi)的吸光度(650nm)變化7.2.5具體測量流程見圖2。達37℃達37℃加入0.100mL溶液2,充分混勻達37℃7.3試劑空白率測量試劑空白率測量1:用純水代替30%H?O?溶液，測量方法同7.2。試劑空白率測量2:用純水代替氧化鐵納米顆粒分散液，測量方法同7.2。注：宜重復(fù)3次，采用3次的平均值參與計算。7.4氧化鐵納米顆粒鐵元素質(zhì)量濃度測量參見附錄B。6GB/T37966—20198測量結(jié)果處理8.1計算通過吸光度與時間的線性擬合得出吸光度隨時間變化速率(min-1)。扣除試劑空白率后，按式(1)計算氧化鐵納米顆粒所含酶活性單位數(shù)?！街校篵nano--—氧化鐵納米顆粒所含酶活性單位數(shù)，單位為酶單位(IU或U);ε--——TMB衍生物的摩爾吸光系數(shù)，取值為39000mol-1·L·cm-1;l——比色皿光程，單位為厘米(cm);△A/△t———經(jīng)空白率校正的反應(yīng)液吸光度隨時間變化速率，單位為每分(min-1)。將bnamo除以加入的氧化鐵納米顆粒的鐵元素質(zhì)量，得單位鐵元素質(zhì)量的氧化鐵納米顆粒所含酶活性單位數(shù)。按式(2)計算氧化鐵納米顆粒類過氧化物酶活性。式中：mFe-——氧化鐵納米顆粒所含鐵元素質(zhì)量，單位為毫克(mg)。8.2數(shù)據(jù)處理8.2.1必要時，每個實驗室應(yīng)建立適當?shù)臄?shù)據(jù)剔除規(guī)則。8.2.2計算多次測量值的均值、標準差，必要時應(yīng)檢查數(shù)據(jù)分布類型，計算均值的標準偏差。8.2.3必要時，評定測量不確定度。9報告測量報告應(yīng)包含但不限于以下信息：b)樣品信息：測量樣品名稱、數(shù)量等；c)測量依據(jù)(包括發(fā)布或出版年號);d)測量儀器；e)樣品測量條件；f)測量結(jié)果；GB/T37966—2019(資料性附錄)A.1分光光度計準備測量工作前，按已制定的SOP文件或JJG178規(guī)定的檢定規(guī)程對分光光度計進行檢查，填寫表A.1。表A.1分光光度計準備準備事項具體內(nèi)容開機前檢查□溫度□濕度□機身清潔□比色倉清潔□比色窗清潔組合恒溫裝置：□與分光光度計連接完整□提前開機測溫裝置：□電量口測溫探頭勿擠壓、碰撞堅硬物體比色皿：口完整□清潔度口光程□比色皿間匹配開機注意事項光源燈：□提前預(yù)熱儀器性能檢查□核實是否在國家計量機構(gòu)檢定合格有效期內(nèi)□儀器的自檢是否正常預(yù)防性維護分光光度計：□無明顯振動□及時待機□無線電干擾□UPS□使用后清潔溫度計探頭各實驗室可根據(jù)具體情況制定本實驗室分光光度計的準備流程。A.2溫度計準備測量工作前，按已制定的SOP文件對溫度計進行檢查，填寫表A.2。表A.2溫度計準備準備事項具體內(nèi)容開機前檢查□電源□機身清潔口溫度計溫度探頭是否正常組合□主機與溫度計溫度探頭連接完整開機注意事項電量：□查看剩余電量校準提示：□查看校準有效期是否到期儀器性能檢查□核實是否在國家計量機構(gòu)檢定合格有效期內(nèi)大型實驗前性能檢查：□用計量合格的標準溫度計檢查溫度的準確性預(yù)防性維護主機：□機身清潔溫度探頭：□使用后及時清潔78GB/T37966—2019各實驗室可根據(jù)具體情況制定本實驗室溫度計的準備流程。A.3pH計準備測量工作前，按已制定的SOP文件對pH計進行檢查，填寫表A.3。表A.3pH計準備準備事項具體內(nèi)容開機前檢查□電源□接地□溫度□濕度□機身清潔組合溫度探頭：□與pH計連接完整電極：口與pH計連接完整□內(nèi)液的量□外液的量磁力攪拌器：□電源□接地□轉(zhuǎn)速磁力攪拌子：□完整□清潔度□磁力pH標準溶液：□剩余量□有效期儀器性能保證每次應(yīng)用前性能保證：更換電極內(nèi)液和電極外液進行電極激活采用pH標準溶液進行校準預(yù)防性維護應(yīng)用前：口更換電極內(nèi)液和電極外液：電極激活應(yīng)用后：□更換電極內(nèi)液和電極外液：電極保養(yǎng)□清潔電極各實驗室可根據(jù)具體情況制定本實驗室pH計的準備流程。A.4恒溫水浴箱準備測量工作前，按已制定的SOP文件對恒溫水浴箱進行檢查，填寫表A.4。表A.4恒溫水浴箱準備準備事項具體內(nèi)容開機前檢查組合□與分光光度計連接開機注意事項儀器性能檢查□溫度校正□溫度穩(wěn)定性預(yù)防性維護□定期更換進口水管□定期更換出口水管□清洗濾網(wǎng)□水箱內(nèi)部消毒各實驗室可根據(jù)具體情況制定本實驗室恒溫水浴箱的準備流程。A.5天平準備測量工作前，按已制定的SOP文件對天平進行檢查，填寫表A.5。9GB/T37966—2019準備事項具體內(nèi)容開機前檢查□電源口清潔□干燥劑顏色□水平珠位置開機自檢□電量口零位顯示校準□核實是否在國家計量機構(gòu)檢定合格有效期內(nèi)大型實驗前：□標準砝碼校準每次應(yīng)用前：□儀器自帶校準預(yù)防性維護□定期進行保養(yǎng)口定期校準各實驗室可根據(jù)具體情況制定本實驗室天平的準備流程。A.6移液器準備測量工作前，按已制定的SOP文件對移液器進行檢查，填寫表A.6。表A.6移液器準備準備事項具體內(nèi)容使用前檢查□機身清潔□機械操作儀器性能檢查□加樣量正確性□加樣量精密度預(yù)防性維護□定期進行保養(yǎng)□定期校準各實驗室可根據(jù)具體情況制定本實驗室移液器的準備流程。(資料性附錄)氧化鐵納米顆粒鐵元素質(zhì)量濃度測量氧化鐵納米顆粒鐵元素質(zhì)量濃度測量采用紫外分光光度法。適當鹽酸的酸化，鹽酸羥胺的還原，以及鄰二氮菲顯色后，將溶液pH調(diào)至5左右，定容到50mL,用紫外可見分光光度計測量其在510nm處的吸光度。將吸光度數(shù)據(jù)同對應(yīng)的Fe質(zhì)量濃度進行線性擬合得C-A直線方程，見式(B.1):A=0.19956C+0.06171…………(B.1)式中：A——溶液在510nm處的吸光度。取待測溶液100μL,經(jīng)過與對Fe溶液標準樣品同樣的處理方法顯色后，定容到50mL,之后對其進行五次吸光度的測量，根據(jù)以上方程分別計算出質(zhì)量濃度，取平均值后折算出100μL待測溶液的鐵元素質(zhì)量濃度。注：推薦使用質(zhì)量可靠的鐵單元素標準溶液，商品化的可溯源至國家或國際的鐵標準樣品已有出售。GB/T37966—2019(資料性附錄)氧化鐵納米顆粒類過氧化物酶活性計算及不確定度評定實例C.1氧化鐵納米顆粒類過氧化物酶活性計算實驗所用氧化鐵(Y-Fe?O?)納米顆粒濃度為0.046mg·mL-1,重復(fù)測量次數(shù)n=3,去除試劑空白率后得到TMB衍生物吸光度隨時間的變化圖，見圖C.1。吸光度0,900.85吸光度0.700.650.600.55-0.90-0.85-0.800.75-0.65-0.600.55-0.950.900.800.75-0.70-0.65-0.60-0.55-時間/min時間/min時間/min圖C.1TMB衍生物吸光度隨時間變化圖(三次重復(fù)測量)對其進行線性擬合，得到直線斜率，見表C.1。表C.1測量結(jié)果匯總組號第一次測量第二次測量第三次測量△A/△t(min-1)0.15730.15870.1589標準偏差6.31×10-41.51×10-31.23×10-3將以上三次測量得到的斜率、mFe=CFe×VFe=0.046mg·mL-1×0.1mL=4.6×10-3mg、V=2400μL、l=1.000cm、E=39000mol-1·L·cm-1帶入式(C.1)和(C.2):…………(C.1)anano=bnano/mFe…………(C.2)得到的計算結(jié)果見表C.2:表C.2anno計算結(jié)果組號第一次測量第二次測量第三次測量平均值標準偏差(單位：U·mg-1)C.2不確定度評定C.2.1標準不確定度A類評定按照本標準規(guī)定的測量方法，對Y-Fe?O?納米顆粒類過氧化物酶活性進行多次測量，經(jīng)計算得到GB/T37966—2019anano,見表C.3。組號ann(單位為U·mg-1)第一次測量第二次測量第三次測量第四次測量Day1I2.1332.1012.3542.0902.0612.215Ⅲ2.3332.0212.101Day2V2.021V2.077Day3VI2.0982.1172.119V2.2132.0312.1332.0982.063注：表中“—”為用格拉布斯準則剔除掉異常值。根據(jù)實驗標準偏差計算式(C.4),得S(a;)為0.142U·mg-1。類標準不確定度為0.024U·mg-1?！?C.3)…………(C.4)…………(C.5)C.2.2標準不確定度B類評定C.2.2.1B類不確定度根據(jù)ammo的計算式(C.1)和式(C.2)類不確定度分量來源有：e、1、V、△A/△t、mFe。其中，TMB衍生物的摩爾吸光系數(shù)∈為常量，不產(chǎn)生不確定度。故B類不確定度的計算式(C.6)如下：下面對各不確定分量進行逐一分析。(C.6)C.2.2.2比色皿光程l比色皿由計量機構(gòu)出具校準證書，并給出不確定度及擴展系數(shù)：l=1.000cm,U=0.003cm,k=2。由式(C.7)計算，得l的相對不確定度為0.0015。C.2.2.3反應(yīng)杯內(nèi)溶液總體積V該項不確定度來源于移液器。由于氧化鐵納米顆粒分散液、溶液2、30%H?O?的加樣體積分別為100μL、100μL、200μL,遠小于溶液1的加樣體積(2000μL),故它們產(chǎn)生的不確定度可忽略不計。所以V的不確定度主要來自于可調(diào)量程移液器(量程100μL～1000μL),該值由移液器生產(chǎn)公司提供。由式(C.8)計算V的相對不確定度為0.002。C.2.2.4經(jīng)過空白率校正的反應(yīng)液吸光度隨時間變化率△A/△t時間產(chǎn)生的不確定度可忽略不計。分光光度計由計量機構(gòu)出具校準證書，并給出吸光度的不確定度及擴展系數(shù)：U=0.008,k=2。故Uc(A)=0.004。經(jīng)分析，△A/△t的不確定來源有：分光光度計測量吸光度引入的不確定度、線性擬合引入的不確定度。將本例中具體數(shù)值帶入，得反應(yīng)溶液吸光度隨時間變化速率的計算式(C.9)為：因此，分光光度計測量吸光度引入的標準不確定度的計算式(C.10)為：線性擬合直線斜率標準偏差的計算見式(C.11):式中：b——線性擬合直線的斜率；r——線性擬合的相關(guān)系數(shù)。經(jīng)計算S,過小，可忽略不計。故△A/△t的相對不確定度可由式(C.12)表示：C.2.2.5氧化鐵納米顆粒所含鐵元素質(zhì)量mFe根據(jù)式(C.13)mFe=VFe×CFe…………(C.13)可得mFe的不確定度計算式(C.14)為：其中，VFe的不確定度來源于移液器，故：GB/T37966—2019CFe的不確定度來源于稀釋過程。根據(jù)式(C.15)可得CFe的不確定度計算式(C.16)為：…………(C.15)C?(Fe)為氧化鐵納米顆粒分散液(原溶液)的鐵元素質(zhì)量濃度。該質(zhì)量濃度的測量方法參見附錄B,測量結(jié)果為3.845mg/mL。將C。(Fe)溯源至國家鐵單元素標準溶液，經(jīng)分析，Uc[C?(Fe)]=0.010mg/mL;V?(Fe)的不確定度來源于1000μL移液器，Uc[V?(Fe)]=2μL;V總的不確定度來源于50mL容量瓶。該容量瓶由計量機構(gòu)出具校準證書，并給出不確定度及擴將上述數(shù)據(jù)帶入式(C.14),可得：綜上所述，在B類不確定度的計算式(C.6)中：由于△A/△t≈0.15遠遠大于其他所有分量引入的不確定度。根據(jù)不確定度計算中的三分之一微小不確定度原則，可代表整體的相對不確定度。故B類不確定度為：C.2.3擴展不確定度根據(jù)不確定度傳