T-CSBM 0050.3-2024 創(chuàng)面修復(fù)材料有效性評價(jià) 第3部分：刺激因子屏蔽評價(jià)方法

T/CSBMT/CSBM0050.3—2024創(chuàng)面修復(fù)材料有效性評價(jià)第3部分：刺激因子屏蔽評價(jià)方法EffectivenessevaluationofwoundrepairmaterialsPart3:Invitroirritantsbarrierevaluationmethod中國生物材料學(xué)會發(fā)布I 3 5 7本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起本文件起草單位：杭州英健生物科技有限公司、中國食品藥品檢定驗(yàn)在有保護(hù)材料存在時(shí)顯示細(xì)胞遷移作用。本文件采用Transwell細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)評價(jià)創(chuàng)面修復(fù)再生材料12規(guī)范性引用文件GB/T16886.5—2017醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)第5部分：體外細(xì)胞毒性T/CSBM0050.1創(chuàng)面修復(fù)材料有效性評價(jià)第1部分：水溶性材料體外評價(jià)T/CSBM0050.1界定的術(shù)語和定義適用于本文3,14刺激物濃度確定試驗(yàn)4.2器具、試劑和耗材、細(xì)胞系、刺激物4.2.1器具24.2.2試劑和耗材b)二甲基亞砜（DMSO）；4.2.3細(xì)胞系對于用于不同部位的修復(fù)材料選擇合適的細(xì)胞系，如用于皮膚的修復(fù)材料可用皮膚細(xì)胞，用4.2.4刺激物4.3樣品制備4.3.1刺激物梯度溶液4.3.2陰性對照3計(jì)算直徑為1cm的高密度聚乙烯雙面的面積，按3cm2/mL加入含10％FBSDMEM低糖120r/min搖床中浸提24h，取上清液使用。取適量DMSO加入含10％FBSDMEM低糖培養(yǎng)基內(nèi)，制備10％DMSO溶液，37℃、120r/min搖床中震蕩4.3.4空白對照4.4試驗(yàn)方法間按表1進(jìn)行。試驗(yàn)設(shè)置空白對照組、陰性對照組將復(fù)蘇好的成纖維細(xì)胞傳至兩代以上呈對數(shù)生長期時(shí)，按照1×105個(gè)/mL密度制備細(xì)胞懸液，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，然后接種到96孔板內(nèi)，放入二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱在37℃下培養(yǎng)24h，移去舊培養(yǎng)基，按照試驗(yàn)設(shè)置加入對應(yīng)培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，在顯微鏡下觀察每組細(xì)胞形態(tài)，棄去每組培養(yǎng)液后加入1mg/mL50μLMTT溶液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3h后棄去孵育液，加入100μL異丙醇，用振蕩器上振蕩使藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解混勻，在酶標(biāo)儀上檢測570nm和650nm波長的吸光度值并按照式（1）計(jì)算細(xì)胞存共培養(yǎng)24hMTT法P1=?×100%··························································(1)P1——細(xì)胞相對存活率，%;A570nm——陰性對照組在570nm處的平均吸光度；A650nm——陰性對照組在650nm處的平均吸光度；B570nm——陽性對照組在570nm處的平均吸光度；B650nm——陽性對照組在650nm處的平均吸光度。4.5試驗(yàn)用刺激物濃度的確定的3個(gè)濃度用于物理屏蔽細(xì)胞活力和物理屏蔽細(xì)胞遷移試驗(yàn)。若試驗(yàn)結(jié)果的細(xì)胞毒性存活率未能達(dá)到以5物理屏蔽細(xì)胞活力試驗(yàn)4采用Transwell細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)評價(jià)創(chuàng)面修復(fù)再生材料對胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶、過氧化氫、細(xì)菌內(nèi)毒素等刺激因子屏障作用。物理屏蔽保護(hù)試驗(yàn)?zāi)Ｊ饺鐖D1所示。在有保護(hù)材料屏蔽的情況下可以避a）加入材料5.2.1器具5.2.2試劑和耗材5.2.3細(xì)胞系55.3刺激物溶液制備5.4試驗(yàn)方法分別向每組中加入3個(gè)不同濃度的刺激物觀察24h、48h、72h細(xì)胞增殖情況，酶標(biāo)儀下檢測450nm的吸光24h、48h、72hP1——細(xì)胞存活率，%;A450nm——試驗(yàn)組在450nm處的平均吸光度；B450nm——空白對照組在450nm處的平均吸光度。5.5結(jié)果分析驗(yàn)組和空白對照組比較p＜0.05則認(rèn)為該材料具有屏蔽保護(hù)細(xì)胞活力的作用，否則材料沒有屏蔽保護(hù)細(xì)6物理屏蔽細(xì)胞遷移試驗(yàn)6.1原理采用Transwell細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)評價(jià)創(chuàng)面修復(fù)再生材料對胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶、過氧化氫、細(xì)菌內(nèi)毒素等刺激因子屏障作用。物理屏蔽保護(hù)試驗(yàn)?zāi)Ｊ饺鐖D1所示。在有保護(hù)材料屏蔽的情況下可6m)細(xì)胞培養(yǎng)瓶；6.3刺激物溶液制備個(gè)復(fù)孔，24h后將一滅菌直尺放置于孔板孔上方，用1mL槍垂直于孔板和直尺間劃一道橫線，在10×顯微鏡下觀察。樣品組的Transwell孔板中加入0.2mL的保護(hù)膠使其厚度為1.0mm～1.5mm，空白對照組不做處理，分別在每組中加入3個(gè)不同濃度的刺激物。拍攝0h、以及培養(yǎng)12h、24h時(shí)的細(xì)胞圖片，應(yīng)用ImageJ按式（3）計(jì)算不同時(shí)間的P2——細(xì)胞遷移率，%;SSS6.5結(jié)果分析驗(yàn)組和空白對照組比較p＜0.05則認(rèn)為該材料具有屏蔽保護(hù)促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用，否則材料沒有屏蔽保7究[J].北京生物醫(yī)學(xué)工程,2022,41(of