化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則 第10部分：蜜蜂急性毒性試驗(yàn) 征求意見稿

4化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第10部分：蜜蜂急性毒性試驗(yàn)警示——使用本標(biāo)準(zhǔn)的人員應(yīng)有正規(guī)實(shí)驗(yàn)室工作的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。本標(biāo)準(zhǔn)并未指出所有可能的安全問題。使用者有責(zé)任采取適當(dāng)?shù)陌踩徒】荡胧?，本文件?guī)定了蜜蜂急性毒性試驗(yàn)的試驗(yàn)條件、試劑或材料、儀器設(shè)備、樣品、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理、質(zhì)量控制以及試驗(yàn)報(bào)告等的基本本文件適用于為化學(xué)農(nóng)藥登記而進(jìn)行的蜜蜂急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、急性接觸毒性試驗(yàn)和蜜蜂幼下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格NY/T4195.1農(nóng)藥登記環(huán)境影響試驗(yàn)生3.1劑量，用LD50表示.3.253.3成年工蜂Adultforagerhon在蜜蜂種群繁殖期，指蜂群中具備外勤采集能力和行為的蜜3.4將不同劑量的被試物分散在蔗糖溶液中飼喂成年工蜂，藥液消耗完后測(cè)定藥液的消耗量，并4.2蜜蜂急性接觸毒性在蜜蜂被麻醉后，將不同濃度試驗(yàn)藥液點(diǎn)滴在受試蜜蜂的中胸背板處，待溶劑揮發(fā)后，將蜜4.3蜜蜂幼蟲單次暴露毒性試驗(yàn)），6溫度可出現(xiàn)一定的偏差，但不應(yīng)低于23℃或高于40℃,且每24h內(nèi)出現(xiàn)的偏差不應(yīng)超過一次，除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，水為6.1.3丙酮（C3H6OCAS號(hào)：67-64-1）。6.1.5二甲基亞砜（C2H6OS，CAS號(hào)：67-68-5）。6.1.6葡萄糖-D（C6H12O6，CAS號(hào)6.1.9蔗糖（C12H22O11，CAS號(hào)：57-506.2供試生物4195.1的要求飼養(yǎng)，受試蜜蜂應(yīng)為健康、大小一致前對(duì)蜂群進(jìn)行了衛(wèi)生處理（如螨蟲或疾病治療），需7該控制器應(yīng)避免放置在蜂箱邊緣。第2天檢查新卵6.2.2.3移蟲前將移蟲針、人工育工臺(tái)基浸沒在75%酒精（體積比）或其他6.3人工飼料6.3.2.1應(yīng)待酵母提取物、葡萄糖6.3.2.2整個(gè)試驗(yàn)期間，在每次試驗(yàn)開始前7.1試驗(yàn)蜂籠（易清潔、通風(fēng)好，材質(zhì)可為不銹鋼、金屬絲網(wǎng)、7.2蜂王產(chǎn)卵控制器，構(gòu)成見附錄A7.6聚苯乙烯或聚丙烯材質(zhì)的育王臺(tái)基，構(gòu)成見附錄B的圖88.2參比物按正式試驗(yàn)的條件，以較大間距設(shè)置4個(gè)～5個(gè)處理組，以確定正式試驗(yàn)的劑量理組，并設(shè)空白對(duì)照組，使用有機(jī)溶劑、乳化劑、分散劑等助溶的還需增設(shè)溶劑對(duì)照組。每組3可使用有機(jī)溶劑、乳化劑或?qū)γ鄯涠拘暂^低的分散劑（如丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜等）），99.2蜜蜂急性接觸毒性按正式試驗(yàn)的條件，以較大間距設(shè)置4個(gè)～5個(gè)處理組，以確定正式設(shè)置上限劑量100μga.i./蜂，即在被試物達(dá)100μga.i./蜂時(shí)仍未見蜜蜂死亡，則無(wú)需繼續(xù)試9.3蜜蜂幼蟲單次暴露毒性試驗(yàn)方法置于同一細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔一個(gè)育王臺(tái)基一只幼蟲。每組處理組用一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)板應(yīng)按正式試驗(yàn)的條件，以5倍~10倍幾何級(jí)差設(shè)置處致，并置于同一細(xì)胞培養(yǎng)板中。如果與空白對(duì)照組相比，死亡率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，應(yīng)每次試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)置參比物對(duì)照組，樂果暴露a）用無(wú)菌水或有機(jī)溶劑將被試物溶解并稀釋至不同濃度，將不同濃度被試物溶液分別與人對(duì)照組。臺(tái)基（參見附錄B）。所有幼蟲每天定時(shí)(±0.5h）投喂一次（除第2d），投喂前將飼料預(yù)熱至9.3.7.2判斷蜜蜂幼蟲死亡的標(biāo)準(zhǔn)為9.3.8試驗(yàn)終止在第7天（D7在≤-10℃冷凍培養(yǎng)板以表格形式總結(jié)數(shù)據(jù)，給出每個(gè)觀察時(shí)間，處理組和對(duì)照組中每個(gè)重復(fù)亡率和中毒癥狀。以濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以累積死亡百分率對(duì)應(yīng)的概率單位為縱坐標(biāo)，繪制每個(gè)暴露周期內(nèi)的劑量-效應(yīng)曲線，并選擇適宜的統(tǒng)計(jì)方法和程序估算LD50及其95%置信區(qū)間。P--被試物處理組的死亡百分比（%數(shù)量，D5、D6和D7的死亡數(shù)（即分別為被試學(xué)方法（如概率單位法、移動(dòng)平均、二項(xiàng)式概率等）分析死亡數(shù)據(jù)。在每個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)繪制劑量11.1蜜蜂急性經(jīng)口毒性和急性接b)參比物樂果對(duì)蜜蜂急性經(jīng)口試驗(yàn)結(jié)果LD50(24h)內(nèi)，樂果對(duì)蜜蜂急性接觸試驗(yàn)結(jié)果LD50(24h)應(yīng)在0.10μga.i./蜂～0.30μga.i./蜂范圍之內(nèi)。a)從第4天（D4）到第7天（D7），對(duì)照組b)到第7天（D7）、用參比物對(duì)照組中幼蟲累積死亡率應(yīng)＞52）收集試驗(yàn)用蜂的采集方法、采集日期、大概日齡（以周計(jì)算）、健康狀況、飼養(yǎng)情況、3）試驗(yàn)給藥方法，包括使用的載體溶劑、使用的試驗(yàn)溶液的體積、使用的麻醉方式4）試驗(yàn)設(shè)計(jì)，例如，所使用試驗(yàn)濃度和數(shù)量，對(duì)照組數(shù)量，各處理籠重復(fù)數(shù)以及每籠中蜜蜜蜂拒食情況）、處理組和對(duì)照組食物的消耗b）供試生物3）幼蟲試驗(yàn)培養(yǎng)條件：溫度（平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、最大值和最小值）、相對(duì)濕度及試驗(yàn)方5）貯備液中被試物的配制濃度和實(shí)測(cè)濃度，實(shí)測(cè)濃度與配制濃度的偏B.1幼蟲應(yīng)在透明的聚苯乙烯材質(zhì)的育王臺(tái)基（內(nèi)直徑為8.8mm，深度為9.5mm）或聚丙烯材質(zhì)的育王臺(tái)基（內(nèi)直徑為8.5mm，深度為8.3mm）中飼養(yǎng)。育王臺(tái)基在試驗(yàn)開始時(shí)進(jìn)行殺菌，如可用酒精或其他殺菌溶液浸泡30min，取出后在通風(fēng)櫥中晾干，將育王臺(tái)基每個(gè)格放置于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板的一個(gè)小孔中。宜將一片牙科棉吸入加有150g/L甘油的殺菌液500μLB.2將這些培養(yǎng)板放入密封的有機(jī)玻璃干燥器。為保持干燥器中空氣水分飽和，其中放一個(gè)盛有硫酸鉀（K2SO4）飽和溶液的培養(yǎng)皿。將干燥器置于一個(gè)配有強(qiáng)制空氣循環(huán)系統(tǒng)的培養(yǎng)箱中，試B.3蜜蜂幼蟲毒性試驗(yàn)人工飼養(yǎng)單元孔構(gòu)成見圖B[1]OECD(1998a)Guideline213:Honeybees,acuteoralto