第十單元　第61課時(shí)　基因工程的基本工具和基本操作程序-2025年高中生物大一輪復(fù)習(xí)講義人教版

第61課時(shí)基因工程的基本工具和基本操作程序課標(biāo)要求1.概述基因工程是在微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。2.闡明重組DNA技術(shù)的三種基本工具。3.闡明基因工程的基本操作程序。考情分析1.基因工程的基本工具2023·新課標(biāo)·T62021·全國(guó)乙·T382021·湖北·T72.基因工程的基本操作程序2023·全國(guó)乙·T382023·全國(guó)甲·T382023·湖北·T42023·廣東·T202021·廣東·T22考點(diǎn)一基因工程的基本工具1．基因工程的概念2．基因工程的誕生和發(fā)展(1)肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不僅證明了DNA是遺傳物質(zhì)，還證明了DNA可在同種生物不同個(gè)體之間轉(zhuǎn)移。(2)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的提出和半保留復(fù)制的證明。(3)中心法則的確立。(4)遺傳密碼的破譯。(5)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)。限制酶、DNA連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。(6)DNA體外重組的實(shí)現(xiàn)。(7)重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功。(8)DNA測(cè)序和合成技術(shù)的發(fā)明。(9)PCR技術(shù)的發(fā)明。(10)基因組編輯技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的定點(diǎn)插入、敲除或替換。3．重組DNA技術(shù)的基本工具(1)限制性?xún)?nèi)切核酸酶(簡(jiǎn)稱(chēng)“限制酶”)提醒①限制酶的識(shí)別序列一般由6個(gè)核苷酸組成，少數(shù)由4個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)量的核苷酸組成。②限制酶作用的化學(xué)鍵只能是磷酸二酯鍵。③在切割含目的基因的DNA分子時(shí)，需用限制酶切割兩次此DNA分子，產(chǎn)生4個(gè)末端。只有這樣才能使目的基因的兩端都有可連接的黏性末端或平末端。(2)DNA連接酶(3)載體判斷正誤(1)基因工程是人工操作導(dǎo)致的染色體變異，變異是不定向的(×)提示基因工程是人工操作導(dǎo)致的基因重組，變異是定向的。(2)DNA連接酶可以連接目的基因與載體的氫鍵，形成重組DNA(×)提示DNA連接酶可以將雙鏈DNA片段“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的磷酸二酯鍵。(3)限制性?xún)?nèi)切核酸酶、DNA連接酶和質(zhì)粒是基因工程中常用的三種工具酶(×)提示限制性?xún)?nèi)切核酸酶、DNA連接酶和質(zhì)粒是基因工程中常用的三種工具，前兩者屬于工具酶，質(zhì)粒屬于載體。(4)質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為標(biāo)記基因(×)提示質(zhì)粒上的抗生素抗性基因常作為標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選。將從蘇云金桿菌中獲取的Bt基因轉(zhuǎn)入棉花細(xì)胞內(nèi)培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的過(guò)程中，需借助多種分子工具且經(jīng)歷多個(gè)操作步驟。實(shí)驗(yàn)人員使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割質(zhì)粒。如圖表示常用的限制酶識(shí)別序列和切割位點(diǎn)以及質(zhì)粒上的限制酶切割位點(diǎn)。請(qǐng)思考以下問(wèn)題：(1)請(qǐng)用圖示法寫(xiě)出限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割后形成黏性末端的過(guò)程。提示限制酶EcoRⅠ：限制酶NheⅠ：(2)切割圖示中的目的基因應(yīng)選用哪類(lèi)限制酶？請(qǐng)說(shuō)明理由。提示用限制酶MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。限制酶MunⅠ和EcoRⅠ切割后形成的黏性末端相同，限制酶NheⅠ和SpeⅠ切割后形成的黏性末端相同，實(shí)驗(yàn)人員使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割質(zhì)粒，應(yīng)選用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。歸納總結(jié)限制酶的選擇(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。(2)保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因，所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。若載體上有兩個(gè)及以上的標(biāo)記基因，則可合理對(duì)其中一些標(biāo)記基因進(jìn)行酶切破壞，從而達(dá)到比一個(gè)標(biāo)記基因更高的篩選成功率，防止只有一個(gè)標(biāo)記基因時(shí)出現(xiàn)的“假陽(yáng)性”(即未成功導(dǎo)入目的基因的載體也能正常表達(dá)標(biāo)記基因，造成無(wú)效篩選)。(3)善用“雙酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和載體上存在多種酶切位點(diǎn)時(shí)，一般需要選擇在目的基因所在序列和載體上都存在切割位點(diǎn)的兩種不同的限制酶，對(duì)目的基因所在序列和載體進(jìn)行剪切，即“雙酶切法”。其優(yōu)點(diǎn)和作用是：①防止目的基因環(huán)化；②避免目的基因與載體反向連接，即用DNA連接酶連接后形成的重組DNA分子上，目的基因和載體啟動(dòng)子的方向(或描述為“RNA聚合酶的移動(dòng)方向”)必須是相同的，否則目的基因?qū)牒鬅o(wú)法正常表達(dá)。如圖甲、乙也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指來(lái)源不同，但能產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶。當(dāng)不適合選擇某種限制酶時(shí)，可用其同尾酶替換，以獲得相同的黏性末端?？枷蛞槐嫖龌蚬こ痰幕竟ぞ?．(2021·湖北，7)限制性?xún)?nèi)切核酸酶EcoRⅠ識(shí)別并切割雙鏈DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蠅基因組DNA，理論上得到DNA片段的平均長(zhǎng)度(堿基對(duì))約為()A．6B．250C．4000D．24000答案C解析據(jù)圖可知，EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)有6個(gè)堿基對(duì)，由于DNA分子的堿基組成為A、T、G、C，則某一位點(diǎn)出現(xiàn)該序列的概率為1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4＝1/4096，即4096個(gè)堿基對(duì)可能出現(xiàn)一個(gè)限制酶EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)，故理論上得到DNA片段的平均長(zhǎng)度(堿基對(duì))約為4096，與4000最接近，C符合題意。2．(2024·連云港高三調(diào)研)質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體，質(zhì)粒有標(biāo)記基因(如圖所示)，通過(guò)標(biāo)記基因可以推知外源基因(目的基因)是否轉(zhuǎn)移成功。質(zhì)粒上箭頭表示三種限制酶的酶切位點(diǎn)。外源基因插入的位置不同，細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況不同。如表是外源基因插入(插入點(diǎn)有a、b、c)后細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。下列有關(guān)敘述正確的是()項(xiàng)目細(xì)菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況細(xì)菌在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況①能生長(zhǎng)不能生長(zhǎng)②能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)③不能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)A.質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)上有RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)B．①②③三種重組后細(xì)菌的外源基因插入點(diǎn)①是a，②是c，③是bC．質(zhì)粒被一種限制酶切開(kāi)時(shí)，被水解的磷酸二酯鍵有2個(gè)D．將外源基因與質(zhì)粒連接時(shí)需用DNA聚合酶答案C解析質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)上有DNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，A錯(cuò)誤；①②③三種重組后細(xì)菌的外源基因插入點(diǎn)①是b，②是c，③是a，B錯(cuò)誤；將外源基因與質(zhì)粒連接時(shí)需用DNA連接酶，D錯(cuò)誤。歸納提升與DNA有關(guān)的幾種酶的比較考點(diǎn)二基因工程的基本操作程序1．目的基因的篩選與獲取(1)目的基因：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因。(2)篩選合適的目的基因①?gòu)南嚓P(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。②利用序列數(shù)據(jù)庫(kù)和序列比對(duì)工具進(jìn)行篩選。(3)目的基因的獲?、偃斯ず铣赡康幕?。②PCR獲取和擴(kuò)增目的基因a．PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))：是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。b．PCR反應(yīng)的條件：一定的緩沖溶液、DNA模板、2種引物、4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶，以及能自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。c．PCR擴(kuò)增的過(guò)程d．PCR產(chǎn)物的鑒定：常采用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。歸納提升PCR技術(shù)和DNA復(fù)制的比較③通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)來(lái)獲取目的基因。2．基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。(2)基因表達(dá)載體的組成及作用(3)構(gòu)建過(guò)程提醒啟動(dòng)子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對(duì)比項(xiàng)目啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)DNADNAmRNAmRNA位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)翻譯的起始信號(hào)(編碼氨基酸)翻譯的結(jié)束信號(hào)(正常情況下，不編碼氨基酸)3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞生物種類(lèi)植物動(dòng)物微生物常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法顯微注射法Ca2＋處理法受體細(xì)胞體細(xì)胞或受精卵受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA中→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上→表達(dá)將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物Ca2＋處理細(xì)胞→細(xì)胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)→基因表達(dá)載體導(dǎo)入辨析(1)轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上；第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。4．目的基因的檢測(cè)與鑒定判斷正誤(1)目的基因一定是編碼蛋白質(zhì)的基因(×)提示目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。(2)真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2＋(√)(3)基因表達(dá)載體中的啟動(dòng)子和終止子決定著翻譯的開(kāi)始與結(jié)束(×)提示啟動(dòng)子和終止子決定著轉(zhuǎn)錄的開(kāi)始與結(jié)束。(4)Ti質(zhì)粒上的T－DNA可與植物受體細(xì)胞的染色體DNA整合在一起(√)(5)為培育抗除草劑的作物新品種，導(dǎo)入抗除草劑基因時(shí)只能以受精卵為受體(×)提示為培育抗除草劑的作物新品種，導(dǎo)入抗除草劑基因時(shí)能以受精卵為受體，也能以體細(xì)胞為受體。(6)檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞可用抗原—抗體雜交技術(shù)(×)提示檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法是PCR等技術(shù)。1．Bt抗蟲(chóng)蛋白基因(簡(jiǎn)稱(chēng)Bt基因)是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉較為合適的目的基因，篩選Bt基因后可以利用PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行大量擴(kuò)增。回答下列問(wèn)題：(1)什么是引物？DNA復(fù)制時(shí)為什么需要引物？提示引物是指一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。在DNA擴(kuò)增時(shí)，DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能從引物的3′端延伸DNA鏈，因此復(fù)制DNA時(shí)應(yīng)加入兩種引物。(2)PCR擴(kuò)增Bt基因需要知道Bt基因的全部核苷酸序列嗎？提示不需要，只要知道Bt基因兩端的部分核苷酸序列即可(以便根據(jù)這部分序列合成兩種引物)。(3)為檢測(cè)Bt基因在轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉細(xì)胞中是否轉(zhuǎn)錄，科研人員提取棉花細(xì)胞中的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程獲得總cDNA，通過(guò)PCR技術(shù)可在總cDNA中專(zhuān)一性地?cái)U(kuò)增出Bt基因的cDNA，原因是什么？提示引物是依據(jù)Bt毒蛋白基因的一段已知序列設(shè)計(jì)合成的(或引物能與Bt基因的cDNA特異性結(jié)合)。(4)PCR擴(kuò)增過(guò)程中的循環(huán)圖示與規(guī)律如圖所示，若一個(gè)Bt毒蛋白基因在PCR中經(jīng)過(guò)n輪循環(huán)，理論上得到多少個(gè)DNA分子？含引物的DNA分子多少個(gè)？含其中一種引物的DNA分子多少個(gè)？同時(shí)含兩種引物的DNA分子多少個(gè)？共需要消耗多少個(gè)引物？含不等長(zhǎng)脫氧核苷酸鏈的DNA分子多少個(gè)？含等長(zhǎng)脫氧核苷酸鏈的DNA分子多少個(gè)？提示經(jīng)過(guò)n輪循環(huán)，得到2n個(gè)DNA分子，含引物的DNA分子2n個(gè)，含其中一種引物的DNA分子數(shù)(2n－1)個(gè)，同時(shí)含兩種引物的DNA分子(2n－2)個(gè)，共需要消耗(2n＋1－2)個(gè)引物。含不等長(zhǎng)脫氧核苷酸鏈的DNA分子2n個(gè)，含等長(zhǎng)脫氧核苷酸鏈的DNA分子(2n－2n)個(gè)。(5)PCR擴(kuò)增Bt基因的過(guò)程中需要解旋酶嗎？并說(shuō)明理由。所需要的DNA聚合酶應(yīng)具有什么特點(diǎn)？提示不需要解旋酶，因?yàn)镻CR過(guò)程中，DNA雙鏈在高溫下即可完成解旋。由于PCR過(guò)程溫度較高，故所需要的DNA聚合酶應(yīng)具有耐高溫的特點(diǎn)。2．據(jù)圖分析抗蟲(chóng)棉的培育過(guò)程。(1)該過(guò)程中的目的基因是Bt基因，載體是Ti質(zhì)粒。(2)基因工程中，往往使用兩種限制酶切割目的基因，這樣做的原因是什么？提示為了避免目的基因和載體的自身環(huán)化和反向連接。(3)為了保證目的基因在受體細(xì)胞中能正確表達(dá)，對(duì)目的基因在質(zhì)粒中的插入位點(diǎn)有什么要求？提示目的基因應(yīng)插入啟動(dòng)子與終止子之間。(4)該實(shí)例中，導(dǎo)入目的基因的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。為什么目的基因可以整合到染色體的DNA上？提示由于Ti質(zhì)粒上的T－DNA可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞且能整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，而目的基因又插入T－DNA，所以目的基因可以整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上。(5)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞時(shí)，能否僅把目的基因整合到線(xiàn)粒體DNA或葉綠體DNA上？為什么？提示一般不能。如果僅把目的基因整合到線(xiàn)粒體DNA或葉綠體DNA上，由于細(xì)胞分裂可能導(dǎo)致目的基因丟失，無(wú)法穩(wěn)定遺傳。(6)該實(shí)例中，檢測(cè)目的基因是否成功表達(dá)的常見(jiàn)方法有哪些？提示抗原—抗體雜交、用棉葉飼喂棉鈴蟲(chóng)?？枷蚨嫖龌蚬こ痰幕静僮鞒绦?．(2023·湖北，4)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是()A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通過(guò)DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落答案D解析若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，A正確；若用PvuⅠ酶切，重組質(zhì)粒和質(zhì)粒中都有四環(huán)素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；DNA凝膠電泳技術(shù)可以分離出不同大小的DNA片段，重組質(zhì)粒的大小與原質(zhì)粒不同，能夠鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否，C正確；SphⅠ的酶切位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重組質(zhì)粒中含氨芐青霉素抗性基因(AmpR)，因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)的培養(yǎng)基中能形成菌落，在含Tet的培養(yǎng)基中不能形成菌落，D錯(cuò)誤。4．(2024·江蘇揚(yáng)州中學(xué)高三模擬)土壤農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，Ti質(zhì)粒上的T－DNA片段轉(zhuǎn)入植物的基因組。利用農(nóng)桿菌以Ti質(zhì)粒作為載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，下列相關(guān)敘述正確的是()A．目的基因應(yīng)插入T－DNA片段外，以防止破壞T－DNAB．用Ca2＋處理農(nóng)桿菌，以利于其侵染植物細(xì)胞C．Ti質(zhì)粒是一種環(huán)狀DNA分子，沒(méi)有雙螺旋結(jié)構(gòu)D．可以用PCR技術(shù)檢測(cè)外源DNA是否整合到植物的染色體DNA上答案D解析在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，需要將目的基因插入到T－DNA片段上，有利于介導(dǎo)外源DNA整合到植物的染色體DNA上，A錯(cuò)誤；農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞不需要用Ca2＋處理，B錯(cuò)誤；Ti質(zhì)粒是一種環(huán)狀DNA分子，是存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中的DNA，具有雙螺旋結(jié)構(gòu)，C錯(cuò)誤。1.(選擇性必修3P67)基因工程：按照人們的愿望，通過(guò)轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品。2．(選擇性必修3P71)限制酶能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。3．(選擇性必修3P72)載體上有特殊的標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選。4．(選擇性必修3P77)PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中才能進(jìn)行，需提供DNA模板、2種引物、4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶。5．(選擇性必修3P77)真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸，引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開(kāi)始連接脫氧核苷酸。6．(選擇性必修3P80)基因表達(dá)載體的構(gòu)建的目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。基因表達(dá)載體是載體的一種，除目的基因、標(biāo)記基因外，還必須含有啟動(dòng)子、終止子等。啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達(dá)出人類(lèi)需要的蛋白質(zhì)。7．(選擇性必修3P81)轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。8．(選擇性必修3P81～82)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法；導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的方法是顯微注射法；導(dǎo)入微生物細(xì)胞的方法是Ca2＋處理法。9．(選擇性必修3P82)目的基因的檢測(cè)與鑒定：首先是分子水平的檢測(cè)，包括通過(guò)PCR等技術(shù)檢測(cè)棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因或檢測(cè)Bt基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA；從轉(zhuǎn)基因棉花中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原—抗體雜交，檢測(cè)Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲(chóng)蛋白等。其次，還需要進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定。例如，通過(guò)采摘抗蟲(chóng)棉的葉片飼喂棉鈴蟲(chóng)來(lái)確定Bt基因是否賦予了棉花抗蟲(chóng)特性以及抗性的程度。10．如圖為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)為：HindⅢ(A↓AGCTT)、PvitⅡ(CAG↓CTG)、KpnⅠ(G↓GTACC)、EcoRⅠ(G↓AATTC)、PstⅠ(CTGCA↓G)、BamHⅠ(G↓GATCC)。為使phb2基因(該基因序列不含圖中限制酶的識(shí)別序列)與載體正確連接，在擴(kuò)增的phb2基因兩端分別引入PvitⅡ和EcoRⅠ兩種不同限制酶的識(shí)別序列。將經(jīng)過(guò)這兩種酶酶切的phb2基因和載體進(jìn)行連接時(shí)，可選用T4DNA連接酶(填“E.coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”)。課時(shí)精練一、選擇題1．(2024·泉州高三質(zhì)檢)像BclⅠ(－T↓GATCA－)、BglⅡ(－A↓GATCT－)、MboⅠ(－↓GATC－)這樣，識(shí)別序列不同，但能產(chǎn)生相同的黏性末端的一類(lèi)限制酶被稱(chēng)為同尾酶。如圖表示目的基因及質(zhì)粒上的酶切位點(diǎn)。選用不同的限制酶對(duì)質(zhì)粒和目的基因進(jìn)行切割，并用DNA連接酶進(jìn)行連接。下列分析錯(cuò)誤的是()

選項(xiàng)切割質(zhì)粒切割目的基因結(jié)果分析ABclⅠ和BglⅡBclⅠ和BglⅡ形成的重組質(zhì)粒的堿基排列順序不一定相同BBclⅠ和BglⅡMboⅠ切割后的質(zhì)粒不可自我環(huán)化，切割后的目的基因可以自我環(huán)化CMboⅠBclⅠ和BglⅡ形成的重組質(zhì)?？杀籑boⅠ再次切開(kāi)，但可能無(wú)法被BclⅠ和BglⅡ再次切開(kāi)DMboⅠMboⅠ切割后的質(zhì)?？梢宰晕噎h(huán)化，切割后的目的基因也可以自我環(huán)化答案B解析切割質(zhì)粒和切割目的基因均用BclⅠ和BglⅡ時(shí)，切割后產(chǎn)生的黏性末端相同，形成重組質(zhì)粒時(shí)目的基因可能反向連接，形成的堿基排列順序不一定相同，A正確；用BclⅠ和BglⅡ切割質(zhì)粒，切割后產(chǎn)生的黏性末端相同，切割后的質(zhì)?？赡茏晕噎h(huán)化，B錯(cuò)誤；切割質(zhì)粒用MboⅠ，切割目的基因用BclⅠ和BglⅡ，產(chǎn)生相同的黏性末端，形成的重組質(zhì)粒中有MboⅠ的切割位點(diǎn)，但不一定有BclⅠ和BglⅡ的切割位點(diǎn)，因此形成的重組質(zhì)?？杀籑boⅠ再次切開(kāi)，但可能無(wú)法被BclⅠ和BglⅡ再次切開(kāi)，C正確；切割質(zhì)粒用MboⅠ，切割目的基因用MboⅠ，切割后的質(zhì)粒和目的基因均可以自我環(huán)化，D正確。2．(2023·新課標(biāo)，6)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn))和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是()A．質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B．質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C．質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D．質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接答案C解析酶3切割后得到的是平末端，應(yīng)該用T4DNA連接酶連接，A不符合題意；質(zhì)粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到黏性末端，二者不能連接，B不符合題意；質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA連接酶連接后，還能保證目的基因在質(zhì)粒上的連接方向，此重組表達(dá)載體的構(gòu)建方案最合理且高效，C符合題意；若用酶2和酶4切割質(zhì)粒和目的基因，會(huì)破壞質(zhì)粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達(dá)載體缺少標(biāo)記基因，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)的篩選，D不符合題意。3．(2023·重慶，12)某小組通過(guò)PCR(假設(shè)引物長(zhǎng)度為8個(gè)堿基短于實(shí)際長(zhǎng)度)獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進(jìn)行酶切(下圖)，再用所得片段成功構(gòu)建了基因表達(dá)載體。下列敘述錯(cuò)誤的是()A．其中一個(gè)引物序列為5′－TGCGCAGT－3′B．步驟①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠC．用步驟①的酶對(duì)載體進(jìn)行酶切，至少獲得了2個(gè)片段D．酶切片段和載體連接時(shí)，可使用E.coliDNA連接酶或T4DNA連接酶答案B解析由于引物只能引導(dǎo)子鏈從5′端到3′端延伸，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，其中一個(gè)引物序列為5′－TGCGCAGT－3′，A正確；根據(jù)三種酶的酶切位點(diǎn)，左側(cè)的黏性末端是使用NheⅠ切割形成的，右邊的黏性末端是用CfoⅠ切割形成的，B錯(cuò)誤；用步驟①的限制酶NheⅠ和限制酶CfoⅠ對(duì)載體(環(huán)狀DNA)進(jìn)行酶切，切割之后至少獲得了2個(gè)片段，C正確；E.coliDNA連接酶只能連接黏性末端，T4DNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端，圖中酶切后形成的是黏性末端，酶切片段和載體連接時(shí)，可使用E.coliDNA連接酶或T4DNA連接酶，D正確。4．(2024·鎮(zhèn)江高三二模)轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因的剔除可有效防止基因污染，剔除常用分離剔除法和重組剔除法。分離剔除法是在轉(zhuǎn)基因時(shí)將目的基因和標(biāo)記基因分別構(gòu)建在兩個(gè)Ti質(zhì)粒上，通過(guò)共轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因植物后讓其自交得到不含標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因個(gè)體；重組剔除法利用Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)，Cre酶能有效剔除重組載體中含有標(biāo)記基因的序列，只留下一個(gè)LoxP位點(diǎn)，具體原理如圖。下列說(shuō)法不正確的是()A．利用分離剔除法時(shí)，目的基因和標(biāo)記基因都應(yīng)插到Ti質(zhì)粒的T－DNA序列內(nèi)部B．分離剔除時(shí)目的基因和標(biāo)記基因插到植物細(xì)胞的同源染色體或非同源染色體上均可成功C．上述重組載體中啟動(dòng)子1在農(nóng)桿菌中可發(fā)揮作用，而在植物細(xì)胞中不能發(fā)揮作用D．經(jīng)重組剔除后的標(biāo)記基因，因沒(méi)有啟動(dòng)子而無(wú)法啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄答案C解析Ti質(zhì)粒的T－DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體DNA上，所以利用分離剔除法時(shí)，目的基因和標(biāo)記基因都應(yīng)插到Ti質(zhì)粒的T－DNA序列內(nèi)部，進(jìn)而成功整合到受體細(xì)胞染色體DNA上，A正確；分離剔除時(shí)目的基因和標(biāo)記基因插到植物細(xì)胞的同源染色體或非同源染色體上最終均可獲得不含標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因個(gè)體，即均可成功，B正確；重組剔除時(shí)，Cre酶基因應(yīng)該在植物細(xì)胞中表達(dá)，故上述重組載體中啟動(dòng)子1在農(nóng)桿菌中不能發(fā)揮作用，而在植物細(xì)胞中能發(fā)揮作用，C錯(cuò)誤；由圖可知，經(jīng)重組剔除后的標(biāo)記基因沒(méi)有啟動(dòng)子，無(wú)法啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，D正確。5．如圖是培育抗除草劑玉米的技術(shù)路線(xiàn)圖，含有內(nèi)含子的報(bào)告基因只能在真核生物中正確表達(dá)，其產(chǎn)物能催化無(wú)色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色。轉(zhuǎn)化過(guò)程中愈傷組織表面常殘留農(nóng)桿菌，會(huì)導(dǎo)致未轉(zhuǎn)化的愈傷組織可能在含除草劑的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。下列相關(guān)敘述正確的是()A．過(guò)程①中除草劑抗性基因插入T－DNA中，導(dǎo)致T－DNA片段失活B．過(guò)程①用兩種限制酶就可防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化C．過(guò)程②用Ca2＋處理，使農(nóng)桿菌細(xì)胞壁通透性改變，使其處于能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)D．過(guò)程③應(yīng)在培養(yǎng)基中加入除草劑和物質(zhì)K答案D解析過(guò)程①中除草劑抗性基因插入T－DNA中，不會(huì)導(dǎo)致T－DNA片段失活，A錯(cuò)誤；過(guò)程①使用兩種限制酶，且這兩種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端不同，才可以防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化，B錯(cuò)誤；過(guò)程③應(yīng)在培養(yǎng)基中加入除草劑和物質(zhì)K，除草劑是用來(lái)檢測(cè)目的基因是否正確表達(dá)，物質(zhì)K是用來(lái)檢測(cè)目的基因有沒(méi)有導(dǎo)入植物細(xì)胞中，加入除草劑可保留轉(zhuǎn)化的愈傷組織和附著農(nóng)桿菌但未轉(zhuǎn)化的愈傷組織，其中變藍(lán)的為轉(zhuǎn)化的愈傷組織，D正確。6．(2024·西安高三一模)我國(guó)科學(xué)家利用XbaⅠ和SacⅠ兩種限制酶，并運(yùn)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，將富含賴(lài)氨酸的蛋白質(zhì)編碼基因(含678bp)導(dǎo)入某植物細(xì)胞，再經(jīng)植物組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株，使賴(lài)氨酸的含量比對(duì)照組明顯提高，如圖表示相關(guān)培育過(guò)程(質(zhì)粒的其他部位和目的基因內(nèi)部均無(wú)XbaⅠ、SacⅠ、HindⅢ的識(shí)別位點(diǎn))，下列說(shuō)法不正確的是()A．一個(gè)內(nèi)含目的基因的模板DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增4次，共產(chǎn)生8個(gè)等長(zhǎng)DNA分子B．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的常用方法C．植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基需添加卡那霉素以便篩選轉(zhuǎn)基因植株D．使用SacⅠ和HindⅢ切割重組質(zhì)粒后能得到1500bp左右的片段答案C解析一個(gè)內(nèi)含目的基因的模板DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增4次共產(chǎn)生等長(zhǎng)的DNA分子數(shù)24－2×4＝8(個(gè))，A正確；因?yàn)椴迦胫参锛?xì)胞染色體上的是質(zhì)粒的T－DNA，而卡那霉素抗性基因不在此片段上，導(dǎo)入成功的植物細(xì)胞對(duì)卡那霉素?zé)o抗性，C錯(cuò)誤；根據(jù)切割目的基因的限制酶在質(zhì)粒上的切割位點(diǎn)，可知由于重組質(zhì)粒上移除1900bp而補(bǔ)充了含678bp的目的基因，加上未移除的822bp，所以用SacⅠ和HindⅢ切割重組質(zhì)粒后，可得到822＋678＝1500(bp)左右的新片段，D正確。7．自然界中很少出現(xiàn)藍(lán)色的花，天然藍(lán)色花產(chǎn)生的主要原因是花瓣細(xì)胞液泡中花青素在堿性條件下顯藍(lán)色。我國(guó)科學(xué)家利用鏈霉菌的靛藍(lán)合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)構(gòu)建基因表達(dá)載體(如圖)，通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入白玫瑰中，在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中形成穩(wěn)定顯色的靛藍(lán)。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是()A．上述獲得藍(lán)色玫瑰的方案中不需要轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因B．將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時(shí)使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠC．同時(shí)使用SpeⅠ和SacⅠ能提高idgS基因和Ti質(zhì)粒的重組效率D．sfp和idgS基因具有各自的啟動(dòng)子，表達(dá)是相互獨(dú)立進(jìn)行的答案B解析靛藍(lán)能夠穩(wěn)定顯色，不受pH的影響，故本題方案中不需要轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因，A正確；將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時(shí)若使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ，則會(huì)將終止子一同切除，故只能用BamHⅠ，B錯(cuò)誤。8．(2024·莆田高三質(zhì)檢)如圖表示利用基因工程生產(chǎn)黃金大米時(shí)所構(gòu)建的基因表達(dá)載體，其中基因Ⅰ和基因Ⅱ是β－胡蘿卜素合成所必需的基因，基因Ⅲ表達(dá)的蛋白質(zhì)可使細(xì)菌在特殊培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。下列分析錯(cuò)誤的是()A．A序列是該基因表達(dá)載體的復(fù)制原點(diǎn)B．基因Ⅲ的作用是便于篩選該重組質(zhì)粒C．β－胡蘿卜素是檢測(cè)基因Ⅰ、基因Ⅱ表達(dá)的關(guān)鍵指標(biāo)之一D．圖中基因插入質(zhì)粒時(shí)需要限制酶和DNA連接酶答案A解析由題圖可知，每個(gè)基因前都存在A序列，可推測(cè)該序列應(yīng)為啟動(dòng)子序列，啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別與結(jié)合的位點(diǎn)，一個(gè)質(zhì)粒一般只有一個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，A錯(cuò)誤。9．(2024·南京高三聯(lián)考)某課題組為得到青蒿素產(chǎn)量高的新品系，使青蒿素合成過(guò)程中的某一關(guān)鍵酶基因fps在野生青蒿中過(guò)量表達(dá)，其過(guò)程如圖所示。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是()A．也可用PCR技術(shù)直接擴(kuò)增RNA來(lái)獲取目的基因B．酶1、酶2和酶3作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵C．本過(guò)程中，可以采用一種、兩種甚至四種酶2D．通過(guò)抗原—抗體雜交技術(shù)可檢測(cè)fps基因是否表達(dá)出蛋白質(zhì)答案A解析PCR技術(shù)不能直接擴(kuò)增RNA來(lái)獲取目的基因，A錯(cuò)誤；據(jù)圖可知，酶1表示逆轉(zhuǎn)錄酶，酶2表示限制酶，酶3表示DNA連接酶，酶1、酶2和酶3作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵，B正確；不同的限制酶切割可能產(chǎn)生相同的黏性末端，因此為了成功構(gòu)建表達(dá)載體，可以采用一種、兩種甚至四種酶2切割含fps基因的DNA片段和質(zhì)粒a，C正確。10．(2024·徐州高三質(zhì)檢)圖甲為培育轉(zhuǎn)基因生物時(shí)選用的載體，圖乙是含有目的基因的一段DNA序列，圖中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。下列敘述錯(cuò)誤的是()A．若通過(guò)PCR技術(shù)提取該目的基因，應(yīng)該選用引物a和引物cB．構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)可選用BclⅠ和HindⅢ這兩種限制酶C．若將基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中，需用Ca2＋處理大腸桿菌D．只利用含四環(huán)素的培養(yǎng)基就可以直接篩選出成功導(dǎo)入表達(dá)載體的受體細(xì)胞答案D解析根據(jù)圖甲可知，BamHⅠ會(huì)導(dǎo)致兩種抗性基因都被破壞，所以不宜選用BamHⅠ，為防止目的基因自身環(huán)化，可選用BclⅠ和HindⅢ兩種限制酶切割，B正確；由于選擇BclⅠ和HindⅢ這兩種限制酶，破壞了氨芐青霉素抗性基因，但沒(méi)有破壞四環(huán)素抗性基因，因此應(yīng)該先用含四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出含有基因表達(dá)載體和普通質(zhì)粒的大腸桿菌，再用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，D錯(cuò)誤。二、非選擇題11．(2021·全國(guó)乙，38)用重組DNA技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類(lèi)需要的生物產(chǎn)品。在此過(guò)程中要使用多種工具酶，其中4種限制性?xún)?nèi)切核酸酶的切割位點(diǎn)如圖所示?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶，上圖中酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接，上圖中切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是。(3)重組DNA技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征，如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中；質(zhì)粒DNA分子上有，便于外源DNA的插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是。(4)表達(dá)載體含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子是指。答案(1)EcoRⅠ、PstⅠEcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅤ(2)磷酸二酯鍵(3)自我復(fù)制一至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞(4)位于基因上游的一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，是RNA聚合酶識(shí)別及結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程解析(1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coliDNA連接酶來(lái)源于大腸桿菌，只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來(lái)，而T4DNA連接酶來(lái)源于T4噬菌體，可用于連接黏性末端和平末端，但連接效率較低。因此圖中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coliDNA連接酶連接，除了這兩種限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4DNA連接酶連接。(2)DNA連接酶將兩個(gè)DNA片段連接形成磷酸二酯鍵。(3)質(zhì)粒是小型環(huán)狀的DNA分子，常作為基因表達(dá)的載體，首先質(zhì)粒上含有復(fù)制原點(diǎn)，能保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中自我復(fù)制。質(zhì)粒DNA分子上有一個(gè)至多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，便于目的基因的導(dǎo)入。質(zhì)粒上的標(biāo)記基因便于重組DNA分子的篩選，具體做法是用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞。(4)啟動(dòng)子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達(dá)出人類(lèi)需要的蛋白質(zhì)。12．(2021·福建，21)微生物吸附是重金屬?gòu)U水的處理方法之一。金屬硫蛋白(MT)是一類(lèi)廣泛存在于動(dòng)植物中的金屬結(jié)合蛋白，具有吸附重金屬的作用?？蒲腥藛T將棗樹(shù)的MT基因?qū)氪竽c桿菌構(gòu)建工程菌?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)根據(jù)棗樹(shù)的MTcDNA的核苷酸序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物(圖1甲)，通過(guò)PCR擴(kuò)增MT基因。已知A位點(diǎn)和B位點(diǎn)分別是起始密碼子和終止密碼子對(duì)應(yīng)的基因位置。選用的引物組合應(yīng)為。(2)本實(shí)驗(yàn)中，PCR所用的DNA聚合酶擴(kuò)增出的MT基因的末端為平末端。由于載體E只有能產(chǎn)生黏性末端的酶切位點(diǎn)，需借助中間載體P將MT基因接入載體E。載體P和載體E的酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的酶切序列如圖1乙所示。①選用酶將載體P切開(kāi)，再用(填“T4DNA”或“E.coli81DNA”)連接酶將MT基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P′。②載體P′不具有表達(dá)MT基因的和。選用酶組合對(duì)載體P′和載體E進(jìn)行酶切，將切下的MT基因和載體E用DNA連接酶進(jìn)行連接，將得到的混合物導(dǎo)入到用離子處理的大腸桿菌，篩出MT工程菌。(3)MT基因在工程菌的表達(dá)量如圖2所示。結(jié)果仍無(wú)法說(shuō)明已經(jīng)成功構(gòu)建能較強(qiáng)吸附廢水中重金屬的MT工程菌，理由是。答案(1)引物1和引物4(2)①EcoRⅤT4DNA②啟動(dòng)子終止子X(jué)hoⅠ和PstⅠ鈣(3)尚未在個(gè)體生物學(xué)水平上對(duì)MT工程菌吸附重金屬的能力進(jìn)行鑒定解析(1)密碼子位于mRNA上，是決定氨基酸的三個(gè)相鄰堿基，起始密碼子和終止密碼子分別控制翻譯的開(kāi)始和結(jié)束，故為保證基因的正常表達(dá)，一對(duì)引物應(yīng)分別位于位點(diǎn)A和位點(diǎn)B的兩側(cè)，故選擇引物1和引物4。(2)①M(fèi)T基因的末端為平末端，故需要用EcoRⅤ或SmaⅠ切割載體P，但后續(xù)需進(jìn)一步將重組載體P′和載體E連接，故需將MT基因插入XhoⅠ和PstⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，故選EcoRⅤ將載體P切開(kāi)；由于E.coli81DNA連接酶只能連接黏性末端，而T4DNA連接酶可以連接平末端，MT基因的末端為平末端，故需要用T4DNA連接酶將MT基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P′。②由圖可知，載體P′不含有表達(dá)MT基因的啟動(dòng)子和終止子；為避免自身環(huán)化和反向連接，