T-FJCA 003-2024 特殊食品和化妝品 減脂功效測試 秀麗隱桿線蟲法

ICS19.020CCSC04FJCASpecialfoodsandcosmetics—Anti-obesitytest—CaenorhabditIT/FJCA003—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由福建上源生物科學技術有限公司提出。本文件由福建省特殊食品與化妝品協(xié)會歸口。本文件起草單位：福建上源生物科學技術有限公司、安發(fā)（福建）生物科技有限公司、廣東丸美生物技術股份有限公司、福建省食品藥品質量檢驗研究院。本文件主要起草人：張壬輝、高益槐、劉涵、劉用國、趙培、鄭春源、孫懷慶、張熠、陳嵐彬。1T/FJCA003—2024特殊食品和化妝品減脂功效測試秀麗隱桿線蟲法本文件規(guī)定了運用秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans，以下簡稱“線蟲”）對特殊食品和化妝品進行減脂功效測試的方法。本文件適用于特殊食品和化妝品減脂功效的測試，特殊食品和化妝品的原料可參考本方法執(zhí)行。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。DB35/T2132—2023實驗用秀麗隱桿線蟲飼育技術T/GDCA013—2022化妝品抗氧化活性的評價秀麗線蟲法3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4符號和縮略語下列符號和縮略語適用于本文件。CAS：CAS登錄號（CASRegistryNumber）CI：空白對照組平均總強度值（IntensityofBlankControlGroup）IL：脂質抑制率（InhibitionRateofLipid）LB：溶菌肉湯（Luria-Bertani）NGM：線蟲生長培養(yǎng)基（NematodeGrowthMedium）OP50-NGM：含有尿嘧啶合成缺陷型大腸桿菌的線蟲生長培養(yǎng)基（EscherichiacoliOP50onNematodeGrowthMedium）P：P值（Pvalue）SI：樣品組平均總強度值（IntensityofSampleGroup）t-test：T檢驗（Student’sttest）5檢測原理油紅O是一種脂溶性二唑染料，可與線蟲的中性脂質和膽固醇酯特異性結合而著色。線蟲通身透明，可以通過觀測油紅O在線蟲體內的著色水平來判斷其脂肪含量。利用ImageJ2軟件處理線蟲的油紅著色樣圖即可進行定量分析。6材料與試劑6.1材料所需材料如下：——線蟲、尿嘧啶合成缺陷型大腸桿菌（EscherichiacoliOP50，E.coliOP50——挑蟲器；——培養(yǎng)皿；2T/FJCA003—2024——移液槍。6.2試劑除非另有說明，化學試劑使用符合國家標準的分析純試劑。配制方法見附錄A及DB35/T2132—2023。油紅O（C26H24N4O）、氯化鈉（NaCl）、氯化鈣（CaCl2）、硫酸鎂（MgSO4）、氯化鉀（KCl）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、二甲基亞砜（DMSO）、無水乙醇、膽固醇、瓊脂粉（Agar）、LB、蛋白胨、異丙醇、免疫染色通透液（TritonX-100）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS緩沖液）。6.3陽性對照品奧利司他標準品（Orlistat），純度≥98％，CAS：96829-58-2。7實驗儀器與設備所需儀器與設備如下：——體視顯微鏡，放大倍數(shù)5倍～50倍；——恒溫培養(yǎng)箱，精度±1℃;——潔凈工作臺；——萬分之一天平，精度0.1mg；——高壓滅菌鍋；——高速離心機；——恒溫搖床；——旋轉混勻儀；——﹣20℃冰箱；——光學顯微鏡，物鏡變倍不小于10倍。8測試方法8.1受試樣品處理配制受試樣品測試母液時，若受試樣品為水溶性物質，則使用無菌雙蒸水作為溶劑；若受試樣品為非水溶性物質，可選用DMSO作為溶劑。8.2線蟲NGM制備8.2.1空白對照組NGM的配制空白對照組NGM的配制按照DB35/T2132—2023的相關規(guī)定執(zhí)行。8.2.2受試樣品組NGM的配制受試樣品組NGM的配制按照T/GDCA013—2022的相關規(guī)定執(zhí)行。8.2.3陽性對照組NGM的配制陽性對照奧利司他組：用DMSO配制成6mg/mL母液，取奧利司他母液分別同熔融的NGM及E.coliOP50菌液按999:1比例混合均勻，將奧利司他終濃度為6μg/mL的NGM加入6cm培養(yǎng)皿中，待冷卻凝固后，用移液槍吸取150μL奧利司他終濃度為6μg/mL的E.coliOP50菌液打在NGM板的中央，避光晾干后封膜，4℃保存?zhèn)溆谩?.3線蟲同期化線蟲的飼育與質量控制應按照DB35/T2132—2023的相關規(guī)定執(zhí)行。線蟲的生命周期見附錄B，挑取L4時期的線蟲轉移至OP50-NGM培養(yǎng)皿中，每皿放置30～50只，在20℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d后，挑取20只至各組NGM培養(yǎng)皿中，產卵1h，而后將母蟲盡數(shù)挑出。20℃培養(yǎng)3d。3T/FJCA003—20248.4油紅O染色用1.5mL的PBST緩沖液將NGM培養(yǎng)皿上的線蟲沖洗轉移至無菌2mL離心管中，在845g轉速下離心1min，棄上清，加1.5mL的PBST緩沖液沖洗線蟲并在同樣條件下離心2次，棄上清。加入600μL的40%異丙醇，在旋轉混勻儀中，8g旋轉3min，棄上清，再加入600μL的油紅染液，在旋轉混勻儀中，8g旋轉2h。棄上清，加入600μL的PBST緩沖液，在旋轉混勻儀中，8g旋轉30min，棄上清，余下50μL含線蟲的緩沖液，用于圖像的拍攝及脂質的定量分析。8.5圖像拍攝及脂質的定量分析取10μL待檢的線蟲緩沖液，滴加至載玻片中央，蓋上蓋玻片。在光學顯微鏡100×放大倍數(shù)下拍攝線蟲圖像，并使用ImageJ2軟件對圖像中線蟲紅色的脂質進行定量分析。實驗設置3個平行，每個平行隨機挑選至少20只線蟲進行拍攝分析。9結果評價9.1統(tǒng)計學分析采用ImageJ2軟件對圖像中線蟲紅色的脂質進行定量分析，得到總強度值（分析方法見附錄C）。采用GraphPadPrism8軟件繪制柱狀圖并進行t-test差異分析，P＜0.05表示有顯著性的差異。線蟲體脂抑制率計算見公式。9.2結果判斷及說明最終用于脂質定量分析的單組實驗線蟲數(shù)量不少于60條。線蟲的孵化率不低于95％。奧利司他陽性對照組應與空白對照組應具有顯著性差異且脂質抑制率不低于30如附錄D所示）。受試樣品組線蟲的總強度值顯著低于空白對照組（P＜0.05），且脂質抑制率不低于10％說明樣品在該濃度下具有減少線蟲脂質的功效。在同一批次實驗中，可以通過比較不同樣品的線蟲脂質抑制率來判定其減脂功效的強弱。4T/FJCA003—2024（資料性）試劑配制A.1磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST緩沖液）1×PBS緩沖液100mL，10μL的TritonX-100，混勻。A.2油紅O染液36mg油紅O加入18mL異丙醇，混勻；再加入12mL的雙蒸水，混勻。5T/FJCA003—2024（資料性）線蟲生命周期20℃標準實驗條件下，線蟲從受精卵發(fā)育為成蟲需84h左右，途中經歷14h的胚胎發(fā)育期，而后分別在受精后大約第26h、33h、41h、51h進行連續(xù)的幾次蛻皮，經過L1期、L2期、L3期、L4期四個幼蟲階段發(fā)育為成蟲。在L4期蛻皮后約12h，進入產卵生殖期。在生殖期之后，線蟲可以再存活14d～21線蟲的生命周期如圖B.1所示。圖B.1線蟲生命周期6T/FJCA003—2024（資料性）ImageJ2測定線蟲紅色脂質總強度的方法ImageJ2軟件下載地址：/Fiji/Downloads：1)在ImageJ2軟件中打開圖像（File—Open—SelectFile—Open）；2)選擇多邊形工具（菜單欄左至右第三個繪圖工具），在圖像上完整地勾勒出線蟲的輪廓，點擊窗口Edit—ClearOutside；3)調整顏色的閾值（Image—Adust—ColorThreshold），將Colorspace選擇為RGB格式，調節(jié)Red通道的亮度和對比度的值（同一批次實驗均采用此數(shù)值），盡可能選中線蟲的脂滴而不選中背景，最后點擊Select（注