DB22T 2015-2014 壞死梭桿菌檢測PCR法

DB22DB22/T2015—2014壞死梭桿菌檢測PCR法DeterminationofFusobacteriumnecrophorum—PolymeraseChainReaction吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別這些1警告——使用本標(biāo)準(zhǔn)的人員應(yīng)有正規(guī)實驗室工作的實踐經(jīng)驗，本標(biāo)準(zhǔn)并未指出所有可能的安全問GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和WS/T230臨床診斷中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)的應(yīng)用壞死梭桿菌fusobacteriumnecro體外酶促合成特異性DNA片段的一種分子生物學(xué)實驗方法，主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸分別與兩條模板DNA鏈上的一段互補序列發(fā)生退火，接著在DNA聚合酶的催化下以四種脫氧核苷三磷酸DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleosideadNTP:脫氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosbate）。2針對壞死梭桿菌白細胞毒素兩亞種啟動子的特異性區(qū)域基因序列設(shè)計引物，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)除非另有說明，所有的化學(xué)試劑均為分析純。實驗用水規(guī)格應(yīng)符上游引物：P1:5-GCTCTCCTGCTTGTTT上游引物：P2:5-GATCTTTGTTGGAAGC下游引物：P3:5-GCACGACAA）（）：），37.8微量可調(diào)移液器：0.2μL～2μL，2用無菌棉拭子沾取疑似感染壞死梭桿菌的動物病灶的病健結(jié)合處的組織或膿汁，放入滅菌的凍存吸取上清至另一滅菌EP管，12000r/min離心5min，棄上清；加200μLTE重懸沉淀，12000r/min離心5min，棄上清，洗三次；沉淀加200μLT基因組DNA；按照基因組試劑盒說明書分別提取壞死梭桿菌necrophorum亞種（ATCC27852）和壞死梭桿菌funduliforme亞種（ATCC51357）基因組42.02.5Mg2//（25mM）2.0注：按照上述試劑順序逐項加樣至已編好號的0.2mL的P用TAE電泳緩沖液配制成1%瓊脂糖平板（溴化乙錠終濃度0.5μg/mL加入1×TAE電泳緩沖液剛剛高出凝膠表面，將PCR擴增產(chǎn)物6μL與6μL上樣緩沖液混合，分別加入樣品孔中，取5μLDNAMarkerDL2000加入到標(biāo)準(zhǔn)分子量對照孔內(nèi)。5V/cm恒壓電泳30min-455用凝膠成像系統(tǒng)進行分析。在陰性和陽性對即判定為Fnn亞型；出現(xiàn)809bp特異性片段，即為Fnf亞型。必要時取PCR擴增產(chǎn)物進行測序，如果結(jié)果6