應(yīng)用指南 - 使用 CTS AAV-MAX五輔助病毒AAV生產(chǎn)系統(tǒng)在HyPerforma和DynaDrive一次性生物反應(yīng)器中生產(chǎn)AAV

gibco一次性生物反應(yīng)器中生產(chǎn)AAV簡介隨著病毒載體在疫苗和基因治療應(yīng)用中的廣泛應(yīng)用，研究人員必須決定如何放大其生產(chǎn)工藝，以獲得滿足臨床和商業(yè)化需求的產(chǎn)品。在此，我們描述了如何使用Gibco?CTS?AAV-MAX無輔助病毒HyPerforma?5:1一次性生物反應(yīng)器（S.U.B）中以50L規(guī)模生產(chǎn)材料和方法CTS病毒生產(chǎn)細(xì)胞2.0培養(yǎng)物在整個(gè)種子培養(yǎng)和生物反應(yīng)器中，將Gibco?CTS?病毒生產(chǎn)細(xì)胞2.0（VPC2.0）培養(yǎng)在含4mMGibco?GlutaMAX?補(bǔ)充劑的用戶指南[1]中的建議，將細(xì)胞解凍并培養(yǎng)在搖瓶中，表1.用于細(xì)胞培養(yǎng)和規(guī)模放大的材料和試劑。盒CTS病毒生產(chǎn)細(xì)胞2.0CTS病毒生產(chǎn)培養(yǎng)基2一次性生物反應(yīng)器（S.U.B.）硬件生物工藝容器（BPC）2生物反應(yīng)器設(shè)置和種子培養(yǎng)擴(kuò)增DynaDrive和HyPerforma5:1S.U.B.根據(jù)各自的用戶指南[2,3]設(shè)制器控制每個(gè)生物反應(yīng)器。操作參數(shù)見表2。將VPC2.0從搖瓶擴(kuò)細(xì)胞/mL（VC/mL）。將細(xì)胞培養(yǎng)4天至密度為4.5×106VC/mL產(chǎn)運(yùn)行。為了制備轉(zhuǎn)染用培養(yǎng)物，將VPC2.0在接種后24小時(shí)內(nèi)在整個(gè)規(guī)模放大和生產(chǎn)過程中，對照培養(yǎng)物在錐形瓶中生長。測定生長動力學(xué)、代謝譜和病毒基因組滴度，并與相應(yīng)的生物反應(yīng)器數(shù)培養(yǎng)物在生物反應(yīng)器中的轉(zhuǎn)染建議在50L生物反應(yīng)器中轉(zhuǎn)染45L培養(yǎng)物的含有Gibco?CTS?Viral-Plex?絡(luò)合緩沖液的BPC中（4-8℃)。然后將Gibco?CTS?AAV-MAX轉(zhuǎn)染加強(qiáng)劑和CTS?AAV-MAX轉(zhuǎn)染試劑合并，并轉(zhuǎn)移至BPC。將BPC在室溫下孵育，不攪拌，因?yàn)槠湟褵o菌焊接至50L生物反應(yīng)器中的一個(gè)。絡(luò)合完成后，以中。然后用第二個(gè)生物反應(yīng)器重復(fù)該過程。在轉(zhuǎn)染后，將含有Gibco?CTS?AAV-MAX增強(qiáng)劑的BPC無菌焊接到每個(gè)生物反應(yīng)培養(yǎng)物監(jiān)測每天采集樣本以評估細(xì)胞的生長速率和健康狀況。從各生物反應(yīng)器樣本，使用BioProfile?FLEX2自動細(xì)胞培養(yǎng)物分析儀（NovaVi-CELL?XR細(xì)胞活力分析儀（BeckmanCou外的離線pH測定。然后將剩余體積分配至80℃下冷凍用于滴度分析。根據(jù)需要將Gibco?FoamAway?消泡表2.生物反應(yīng)器參數(shù)。最終工作體積溫度攪拌40%40%頂空通氣目標(biāo)接種密度表3.50L生產(chǎn)運(yùn)行的推薦試劑體積。待轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物體積4.5L最終培養(yǎng)物體積*假定質(zhì)粒DNA儲備液濃度為1mg/mL。3試劑試劑最終生產(chǎn)體積液。向反應(yīng)器中加入MgCl2和ThermoScientific?Pierce?細(xì)胞裂解通用核酸U/mL，以消化任何非衣殼化核酸（表4）。然后攪拌反應(yīng)器，并在37℃下孵育2小時(shí)，不通氣。收集樣品并在收獲前在-80℃下冷凍，使用靶向GFP基因序列的引物和探針，通過液滴數(shù)字PCR（ddPCR）結(jié)果HyPerforma5:1S.U.B.和250mL對照細(xì)胞瓶中，AAV生產(chǎn)期間細(xì)胞密度和活力相的葡萄糖用量、乳酸鹽和氨產(chǎn)量也相當(dāng)（圖1B–D這表明從搖瓶到生物反應(yīng)規(guī)模，獲得的病毒基因組（vg）滴度與對照細(xì)胞瓶中獲得的滴度相當(dāng)。DynaDriveS.U.B.中的滴度超過1.5×1011vg/mL，7.0×1010vg/mL（圖1E）。值得注意的這一初始性能水平所需的優(yōu)化極少。給定AAV產(chǎn)品的額外靶向優(yōu)化可進(jìn)一步提高生表4.AAV收獲的建議試劑體積。*假設(shè)MgCl儲備液濃度為1M。**假設(shè)儲備液濃度為250,000U/mL。個(gè)細(xì)胞/mL）S.U.B.S.U.B.5:1S.U.B.4結(jié)論S.U.B.或HyPerforma5:1S.U.B.搭配，用于大規(guī)模AAV生產(chǎn)。在本研究中，兩個(gè)生物反應(yīng)器產(chǎn)生的AAV6滴度與搖瓶中獲得的AAV6滴度相當(dāng)。在每個(gè)50LS.U.B.中進(jìn)行的容器內(nèi)細(xì)胞擴(kuò)增產(chǎn)生了生產(chǎn)運(yùn)行所需的細(xì)胞數(shù)量。DynaDriveS.U.B.還用作兩個(gè)反應(yīng)器器、耗材和操作空間的需求，降低了種子培養(yǎng)工作流程的復(fù)雜性。它還可通過減少連接數(shù)量和轉(zhuǎn)移損失，來提高種子培養(yǎng)本身的效生產(chǎn)系統(tǒng)進(jìn)行的工作[4]，通過選擇簡單的規(guī)模放大參數(shù)實(shí)現(xiàn)了而不會對細(xì)胞造成剪切損傷或產(chǎn)生過多泡沫。HyPerforma5:1S.U.B.中的滴度略低我們研究中的滴度，原因可能是兩個(gè)系統(tǒng)所需的葉尖速度、氣體流速和消泡劑量之間的差異。當(dāng)以與HyPerforma5:1S.U.B.相同的每體積功率輸入運(yùn)行時(shí)，DynaDriveS.U.B.的獨(dú)特動力傳動系統(tǒng)可產(chǎn)生顯著更低的攪拌速率。其在混合過程中產(chǎn)生的剪切作用較小，并且在VCD、活力和滴度方面，對細(xì)胞無明顯不良影響。DynaDriveS.U.B.還現(xiàn)更有效的氣體交換。我們在DynaDriveS.U.B.中形成導(dǎo)致的起泡和剪切較少，沒有必要添加消泡劑。轉(zhuǎn)染前，在HyPerforma5:1S.U.B.中觀察到更多的通氣和起泡，需要添加消泡品滴度。AAV-MAX系統(tǒng)的可擴(kuò)展性使基因治療研究人員可在整個(gè)拌罐式反應(yīng)器以及再次放大到50LS.U.B.所需的工作極少，對特定AAV血清型和目標(biāo)基因的靶向優(yōu)化可能會進(jìn)一步提高系統(tǒng)的整體生產(chǎn)力。DynaDriveS.U.B.和HyPerforma5:1S.U.B.中CTS小變更，即可使用任一平臺將其工藝放大，以滿足臨床和商業(yè)化需2022.5附錄50L一次性生物反應(yīng)器方案1.對CTSVPC2.0進(jìn)行傳代培養(yǎng)和擴(kuò)增，直至其密度達(dá)到9個(gè)細(xì)胞，用于接種50LDynaDriveS.U.B.（工作體積為5L）。這將產(chǎn)生0.3×106至0.6×106VC/mL的起始密度，具體取決于您是進(jìn)行3天還是4天傳代。如果使用5:1HyPerformaS.U.B.，則對細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，使起始密度，具體取決于您是進(jìn)行3天還是4天傳代。注2.接種前，準(zhǔn)備DynaDriveS.U.B.或HyPerforma5:1S.U.B.。a.接種前兩天，將BPC裝載到硬件中并充氣，并夾緊未使b.如果需要，可在用培養(yǎng)基灌裝S.U.B.前，用N2或空氣吹掃BPC。c.如果S.U.B.中尚未內(nèi)置一次性DO和pH傳感器，則使用探針組件制作傳感器并進(jìn)行高壓滅菌，并在添加培養(yǎng)基前將其插入S.U.B.。d.接種前一天，向DynaDriveS.U.B.中加入4LCTS病毒生產(chǎn)培養(yǎng)基，或向HyPerforma5:1S.U.B.中加入8LCTS病g.DO探針校準(zhǔn)后，打開運(yùn)行級聯(lián)回路以平衡系統(tǒng)，并抽取種S.U.B.：將步驟1中的CTSVPC2.0添加至最終密度為建議設(shè)定值見表5。6.轉(zhuǎn)染當(dāng)天，測定活細(xì)胞百分比和VC密度。我們建議在進(jìn)行轉(zhuǎn)力≥95%。（表8）。注：應(yīng)根據(jù)質(zhì)粒大小和血清型分類優(yōu)化質(zhì)粒比例。表8中列出的所有轉(zhuǎn)染組分在使用前均應(yīng)保存在2-8℃。e.開始攪拌S.U.B.并將其加熱至37℃,同時(shí)向系統(tǒng)中噴射2。反應(yīng)器溫度達(dá)到37℃且DO讀數(shù)穩(wěn)定后，在零點(diǎn)時(shí)表5.50LS.U.B.中N-2培養(yǎng)物的建議設(shè)定值和工作體積I5L（DynaDriveS.U.B溫度氣體分布器葉輪直徑攪拌頂空氣體2控制）6表6.50LS.U.B.中N-1培養(yǎng)物的建議設(shè)定值溫度WV氣體分布器加強(qiáng)型DHS葉輪直徑攪拌90rpm；P/V：14.1W/m3;葉尖速度：0.5頂空氣體2控制）2控制）表7.50LS.U.B.中生產(chǎn)運(yùn)行的建議設(shè)定值溫度WV氣體分布器葉輪直徑攪拌95rpm；P/V：15.6W/m3;葉尖速度：0.5頂空氣體2控制）2控制）表8.轉(zhuǎn)染45L培養(yǎng)物的推薦轉(zhuǎn)染參數(shù)。4.5L*假定質(zhì)粒DNA儲備液濃度為1mg/mL。7試劑容量反應(yīng)器中的最終濃度最終生產(chǎn)體積試劑容量反應(yīng)器中的最終濃度最終生產(chǎn)體積2–a.輕輕翻轉(zhuǎn)含有CTSAAV-MAX轉(zhuǎn)染試劑的瓶子4-5b.向新鮮的1LPETG瓶中加入CTSAA度為6mL/L。輕輕渦旋瓶子以混合內(nèi)容物，并在室溫下d.手動輕輕混合LabtainerBPC5-10秒，然后瓶上加蓋轉(zhuǎn)移蓋，并將其無菌焊接至BPC上。然后可通BPC無菌焊接至生物反應(yīng)器。孵育后，使用蠕動泵以僅當(dāng)必要時(shí)才可進(jìn)行，以避免破壞絡(luò)合反應(yīng)。為了使用冷試劑在更大規(guī)模下實(shí)現(xiàn)最佳AAV生產(chǎn)，我們建議將轉(zhuǎn)染步驟后10min內(nèi)，將所有絡(luò)合混合物加入生物反應(yīng)器表9.推薦的裂解和核酸酶處理?xiàng)l件。*假設(shè)MgCl的儲備液濃度為1M。**假設(shè)儲備液濃度為250,000U/mL。9.向生物反應(yīng)器中加入體積等于轉(zhuǎn)染體積1%的CTSAAV-MAX10.轉(zhuǎn)染后約72小時(shí)收獲培養(yǎng)物。最佳收獲時(shí)間將取液至1X的最終濃度，來裂解CTSVPC2.0。加入MgCl2和U/mL，以消化任何非衣殼化核酸（表9）。關(guān)于放大至較大容器的建議?需要考慮每體積的功率輸入（P/V）、葉尖速度、混合時(shí)間和S.U.B.類型。這是針對50L工作體積的穩(wěn)健方案，可最大限度減少葉輪產(chǎn)生的剪切作用，同時(shí)仍可提供最佳混合。我們?注意轉(zhuǎn)染試劑、DNA和轉(zhuǎn)染絡(luò)合物的放置時(shí)間和混合。確保gibcogibco僅供研究使用。不可用于診斷程序。?2022ThermoFisherScientificInc.版權(quán)所有。除另有說明外，所有商標(biāo)均為ThermoFisherScientificInc.及其子公司的財(cái)產(chǎn)。BioProfile是NovaBiomedical的商標(biāo)。Vi-CELL是BeckmanCoulter的商標(biāo)。Oakton是Cole-ParmerInstrumentCompany,LLC的商標(biāo)。COL349650722產(chǎn)品產(chǎn)品1L病毒生產(chǎn)培養(yǎng)基6x1病毒生產(chǎn)細(xì)胞2.0A505151LCTS病毒生產(chǎn)培養(yǎng)基A5416001病毒生產(chǎn)培養(yǎng)基，AGT形式1LA5147102A5147103CTS病毒生產(chǎn)細(xì)胞2.01瓶A48400?CTSAAV-MAX增強(qiáng)劑?