食品免疫學(xué)免疫檢測技術(shù)與食品安全檢測

第八章免疫學(xué)技術(shù)第一節(jié)抗原抗體的制備一、抗原的制備制備特異性的抗原是制的合格抗體的前提條件，而作為檢測診斷的抗原也必須是純化的抗原。抗原的物質(zhì)很多，很少是單一成分，必須從復(fù)雜的組分中提取分離。按抗原的物理狀態(tài)，可分為天然抗原、人工抗原和合成抗原三類。1、天然抗原的制備（1）顆粒性天然抗原常見的顆?？乖婕皠游?、植物、微生物的細(xì)胞，和有關(guān)的細(xì)胞組成結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞的細(xì)胞壁、線粒體，細(xì)菌的鞭毛和菌毛等。一般環(huán)節(jié)為：一方面收集抗原細(xì)胞或（和）擴(kuò)增培養(yǎng)，然后離心或過濾收集細(xì)胞或細(xì)胞組成結(jié)構(gòu)物，再進(jìn)行病原微生物滅活。（2）可溶性抗原的分離純化蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、酶、補(bǔ)體、細(xì)菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆為良好的可溶性抗原，免疫前常需純化。細(xì)胞破碎方法有：凍融法；超聲破碎；高速組織搗碎機(jī)法；研磨法；溶菌酶、蝸牛酶、纖維素酶解決可溶性蛋白抗原的分離方法：離心分離法：差速離心、密度梯度離心選擇沉淀法：鹽析沉淀法；有機(jī)溶劑沉淀法，常采用乙醇或丙酮核酸去除法，DNA酶、RNA酶解決；水溶性非離子型聚合物沉淀法：常用非離子型聚合物為分子量為2023～6000的聚乙二醇（PEG）凝膠過濾法：又稱分子篩層析。通過凝膠分子篩作用，可將大、中、小三類分子分開，選擇凝膠柱時應(yīng)注意選用適于分離范圍內(nèi)的凝膠。離子互換層析法：離子互換層析是運用一些帶電離子基團(tuán)的凝膠或纖維素吸附帶有相反電荷的蛋白質(zhì)抗原。親和層析法：親和層析是運用生物分子間所具有的專一性親和力而設(shè)計的層析技術(shù)。如抗原和抗體、酶和酶克制物、酶蛋白和輔酶、激素和受體、DNA和RNA等之間有特殊親和力，一定條件下，兩者可緊密結(jié)合成復(fù)合物，如將復(fù)合物的一方固定于固相載體上，則可從溶液中分離和提純另一方。純化抗原的鑒定重要對純化抗原的含量、理化性質(zhì)、純度及免疫活性進(jìn)行鑒定，常用方法有酚試劑法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、免疫電泳法、免疫雙擴(kuò)散法等。2、人工抗原的制備人工抗原指通過人工修飾的半抗原，即將半抗原與載體連接后形成的完全抗原。小分子半抗原可以是多糖、多肽、核酸、類固醇激素、某些藥物及其它化學(xué)物品。在食品檢查中常見的小分子半抗原有各種農(nóng)藥、獸藥、添加劑與非法添加物（鹽酸克倫特羅）、真菌毒素等等。常用載體：蛋白質(zhì)、多肽聚合物、大分子聚合物。蛋白質(zhì)：常用牛血清白蛋白（bovineserumalbumin,BSA）、卵清白蛋白（OVA）、人血清白蛋白（HSA）、兔血清白蛋白（RSA)。多肽聚合物：常用多聚賴氨酸。大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纖維素(CMC)等皆可與半抗原結(jié)合，加入弗氏佐劑課產(chǎn)生良好的抗體。連接方法：物理法是用物理吸附法將載體與半抗原連接，其原理是通過電荷和微孔來吸半抗原，吸附載體重要有PVP和CMC等；化學(xué)法是運用某些功能基團(tuán)把半抗原連接到蛋白質(zhì)類或多肽類聚合物載體上。不同的半抗原應(yīng)選用不同的方法進(jìn)行連接。根據(jù)半抗原擁有的化學(xué)基團(tuán)不同，連接方法重要有以下幾類：①帶游離氨基或羧基以及二種基團(tuán)皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐法和碳二亞胺法與載體氨基形成穩(wěn)定的肽鍵，帶氨基的半抗原則可與載體羧基縮合。②帶有羥基、酮基、醛基的半抗原：不能直接與載體連接，需要用化學(xué)方法如琥珀酸酐法、O-（羧甲基）羥胺法等方法將之轉(zhuǎn)變?yōu)閹в恤然陌肟乖苌锖蟛鸥膳c載體連接。③帶有酚基的半抗原：可用一氯醋酸鈉法或重氮化的對氨基苯甲酸法，生成帶有羧基的半抗原衍生物。3、免疫佐劑某些物質(zhì)與抗原一起或先于抗原注入機(jī)體，可增強(qiáng)機(jī)體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型，此類物質(zhì)稱為佐劑(adjuvant)。應(yīng)用最多的佐劑為福氏佐劑福氏不完全：石蠟油+羊毛脂福氏完全：石蠟油+羊毛脂+卡介苗乳劑的制備：乳劑：抗原與佐劑的混合物抗原與佐劑的比例為1:1，注射前要充足乳化二、多克隆抗體的制備1、免疫動物的選擇選擇動物時應(yīng)考慮以下因素：抗本來源與動物種屬的關(guān)系?？乖膩碓磁c免疫動物種屬差異越遠(yuǎn)，其免疫源性越強(qiáng)，免疫效果越好，而同種系或親緣關(guān)系越近，免疫效果越差。動物個體的選擇。適齡、健康、體重符合規(guī)定的正常動物（以雄性為佳）；抗體的用途和量：抗體需要量少時，選用家兔、豚鼠和雞等小動物；抗體需要量大時，可選用綿羊、山羊、馬、驢等大動物。2、免疫方法選定動物后，在免疫過程中應(yīng)考慮免疫劑量、免疫途徑、免疫次數(shù)、免疫間隔等因素。痹。（1）免疫原的劑量：免疫原的接種劑量按免疫原性的強(qiáng)弱、動物的個體狀態(tài)和免疫時間來擬定。小鼠初次劑量50-400ug/次。大鼠：100-1000ug/次。兔子：200-1000ug/次。加強(qiáng)免疫劑量為初次劑量的1/5-2/5。（2）免疫途徑與免疫間隔時間免疫途徑通常有皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、淋巴結(jié)等，視不同的免疫方案而異。對于不易獲取的寶貴抗原可采用淋巴結(jié)免疫法。免疫間隔時間是影響抗體產(chǎn)生的重要因素，其中初次與第二次免疫的間隔時間尤為重要，一般以2～3周為佳，二次后間隔時間一般為1周，若間隔時間太長，則刺激減弱，抗體效價不高。3、動物采血采集免疫血清前，要預(yù)先測試抗體效價測定，若效價達(dá)成規(guī)定，應(yīng)在末次免疫后一周及時采血，否則抗體效價會下降。(1)頸動脈采血法(2)心臟采血法(3)靜脈采血法4、免疫血清的鑒定（1）效價的測定效價，又叫滴度，是稀釋度的倒數(shù)，指通過血清學(xué)方法能顯示一定反映的抗體或抗血清的最高稀釋倍數(shù)，如終點稀釋度為1/100，效價(每1ml的血清中抗體效價)為100抗體單位。顆粒性抗原可采用凝集實驗?？扇苄钥乖Ｓ秒p向免疫擴(kuò)散實驗、ELISA等方法。（2）特異性的鑒定抗體特異性鑒定常用雙向免疫擴(kuò)散法、免疫電泳法。（3）純度的鑒定抗體純度的鑒定可采用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳（SDS）、雙向擴(kuò)散實驗、免疫電泳等方法。（4）親和力的鑒定抗體結(jié)合部位與抗原表位之間結(jié)合的強(qiáng)度。測定抗體親力的方法較多，如平衡透析法、ELISA或RIA競爭結(jié)合實驗等。5、免疫血清的保存（1）4℃（2）低溫保存（-70℃～-20（3）真空干燥保存（5～2023）注意點：保存前需經(jīng)除菌保存液含防腐劑避免反復(fù)凍融（分裝）三、單克隆抗體的制備單抗：由一個辨認(rèn)單一抗原決定簇（表位）的B細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的同源抗體。單抗制備過程1、致敏淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備2、骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備3、飼養(yǎng)層細(xì)胞的準(zhǔn)備4、細(xì)胞融合5、選擇性培養(yǎng)6、特異性抗體的檢測7、雜交瘤細(xì)胞的克隆化8、雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇9、單克隆抗體的大量制取10、單克隆抗體的純化第二節(jié)抗原抗體反映抗原-抗體反映（antigen-antibodyreaction）是指抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生的特異性結(jié)合的反映。血清學(xué)反映（serologicalreaction）指體外的抗原-抗體反映。一、抗原抗體反映的原理（1）抗原抗體親和力靜電引力（electrostaticforces）范德華引力:作用最?。╲anderWaalsinteractions）氫鍵:最具特異性（hydrogenbond）疏水作用力:作用最大（hydrophobicinteractions）（2）抗原抗體親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體抗體、大多數(shù)抗原亦為蛋白質(zhì)，在水中皆為膠體溶液，不會發(fā)生自然沉淀?？乖贵w結(jié)合使電荷減少或消失，蛋白質(zhì)由親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體。如再加入電解質(zhì)，則進(jìn)一步使疏水膠體物互相靠攏，形成可見的抗原抗體復(fù)合物。二、抗原-抗體反映特點1、特異性特異性：抗原與抗體結(jié)合反映的專一性分子基礎(chǔ)：抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型的互補(bǔ)。2、可逆性可逆性：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性影響因素：抗體對相應(yīng)抗原的親和力－親和力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離環(huán)境因素對復(fù)合物的影響－pH、離子強(qiáng)度3、比例性比例性：抗原與抗體發(fā)生可見反映需遵循一定的量比關(guān)系前帶(prezone)：抗體過量后帶(postzone)：抗原過量等價帶(equivalencezone)：抗原抗體比例合適4、階段性第一階段：特異性結(jié)合階段，反映快，不可見。第二階段：反映可見階段，反映慢，出現(xiàn)凝集、沉淀和細(xì)胞溶解等現(xiàn)象。三、抗原-抗體反映類型

反映類型實驗技術(shù)非標(biāo)記凝集反映直接凝集實驗、間接凝集實驗、間接克制凝集實驗、協(xié)同凝集實驗沉淀反映液相內(nèi)凝集實驗、凝膠內(nèi)凝集實驗補(bǔ)體參與的反映補(bǔ)體溶血實驗、補(bǔ)體結(jié)合實驗中和反映病毒中和實驗、毒素中和實驗標(biāo)記標(biāo)記免疫反映熒光免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)金免疫技術(shù)第三節(jié)非標(biāo)記免疫分析技術(shù)一、凝集反映（agglutination）細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后形成肉眼可見的凝集塊現(xiàn)象，稱為凝聚反映。用于凝集反映中的抗原稱凝集原(agglutinogen)。用于凝集反映中的抗體稱凝集素（agglutinin)。1.直接凝集反映顆?？乖c抗體直接結(jié)合玻片法：細(xì)菌及ABO血型鑒定試管法：2.間接凝集反映抗原（或抗體）吸附于載體+相應(yīng)抗體（或抗原）→凝集常用載體：乳膠顆粒、羊紅細(xì)胞二、沉淀反映(precipitation)沉淀反映指可溶性抗原與其相應(yīng)的抗體在合適條件下反映并出現(xiàn)沉淀物的現(xiàn)象。用于沉淀反映中的抗原稱沉淀原(precipitonogen)。用于沉淀反映中的抗體稱沉淀素（precipitin)。1.液相內(nèi)沉淀環(huán)狀沉淀反映：小試管內(nèi)，下層沉淀素與上層沉淀原在界面應(yīng)，形成白色沉淀環(huán)。絮狀沉淀反映：抗原抗體溶液混合，在電解質(zhì)存在下，兩者結(jié)合出現(xiàn)可見的絮狀沉淀。2.凝膠內(nèi)沉淀（1）單向瓊脂擴(kuò)散實驗是將一定量已知抗體混于瓊脂凝膠中制瓊脂板，在適當(dāng)位置打孔后將抗原加入孔中擴(kuò)散?？乖跀U(kuò)散過程中與凝膠中的抗體相遇，形成以抗原孔為中心的沉淀環(huán)，環(huán)的直徑與抗原含量成正比相關(guān)。本法常用于測定血清IgG、IgM、IgA和C3等的含量（2）雙向免疫擴(kuò)散是將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠的小孔中，兩者自由向周邊擴(kuò)散并相遇，在比例合適處形成沉淀線。假如反映體系中含兩種以上的抗原抗體系統(tǒng)，則小孔間可出現(xiàn)兩條以上的沉淀線。本法常用于抗原或抗體的定性、組成和兩種抗原相關(guān)性分析的檢測。（3）對流免疫電泳是先將待側(cè)血清標(biāo)本作瓊脂凝膠電泳，血清中各蛋白組分被提成不同的區(qū)帶，然后與電泳方向平行挖一小槽，加入相應(yīng)的抗血清，把提成區(qū)帶的蛋白抗原成分作雙向免疫擴(kuò)散，在各區(qū)帶相應(yīng)的位置形成沉淀弧。該法常用于血清蛋白種類分析，以觀測Ig的異常增多或缺失。（4）火箭電泳將單向免疫擴(kuò)散與電泳技術(shù)結(jié)合，可快速測定標(biāo)本中可溶性抗原的含量。（5）免疫比濁法該技術(shù)是運用抗原－抗體復(fù)合物在液相中形成濁度來測量抗原含量的方法。方法：透射光比濁法散射光比濁法免疫乳膠比濁法速率克制免疫比濁法三、補(bǔ)體參與的反映此類反映是運用抗體與紅細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合后，使反映體系中補(bǔ)體激活導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞，出現(xiàn)溶血現(xiàn)象建立的。是在補(bǔ)體參與下，以綿羊紅細(xì)胞和溶血素作為指示系統(tǒng)，來檢測未知的抗原或抗體的血清學(xué)實驗。四、中和實驗（病毒、毒素）原理：病毒、細(xì)菌、毒素與相應(yīng)抗體特異結(jié)合后，喪失生物活性。用途：1.用已知血清鑒定病毒、細(xì)菌、毒素、獸藥殘留等。2.用已知病毒、細(xì)菌檢測血清抗體——測定抗體免疫血清效價（中和價）。第四節(jié)免疫標(biāo)記分析技術(shù)－用標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行抗原抗體反映抗原抗體反映與標(biāo)記技術(shù)結(jié)合，定位、定量、定性測定。標(biāo)記物：熒光素、酶、放射性核素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、膠體金等。類型：免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)、同位素標(biāo)記技術(shù)等。一、酶聯(lián)免疫吸附實驗(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)用酶標(biāo)記的抗體或抗抗體來進(jìn)行的抗原抗體反映常用的酶：辣根過氧化酶、堿性磷酸酶常用底物：鄰苯二胺（OPD）用酶標(biāo)記Ab(或Ag)與標(biāo)本中的Ag(或Ab)發(fā)生特異性結(jié)合。加入酶的底物，在酶作用下產(chǎn)生有色物質(zhì),根據(jù)顏色可作出判斷或測量光密度值。二、免疫熒光法(異硫氰酸熒光素、藻紅蛋白)直接法：用已知熒光標(biāo)記的抗體檢測未知抗原。間接法：用熒光標(biāo)記的抗抗體，檢測未知的抗原/抗體。補(bǔ)體法：三、放射免疫法將放射性核素分析的高度靈敏性與抗原抗體反映的特異性結(jié)合起來的技術(shù)，測定激素和藥物。常用I125和I131快速，敏感（pg)，但污染環(huán)境，有一定的危害性。四、免疫膠體金技術(shù)Immunologicalcolloidalgoldsignature是用膠體金顆粒標(biāo)記抗體或抗原，用以檢測未知抗原或抗體的技術(shù)，可用于多種液相免疫測定和固相免疫分析。免疫層析法：immunochromatography五、化學(xué)發(fā)光免疫分析Chemiluminescenceimmunoassay標(biāo)記物：魯米諾等。是將化學(xué)發(fā)光分析和免疫反映相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。六、免疫印跡法（Westernblotting)先將抗原經(jīng)SDS電泳分開，再將分開的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到醋酸纖維膜上，然后放入具有抗體的溶液中，洗去未結(jié)合抗體，再加標(biāo)記的二抗，通過顯色或發(fā)光顯示結(jié)果。第五節(jié)免疫細(xì)胞及其功能檢測檢測各群體淋巴細(xì)胞的數(shù)量與功能是觀測機(jī)體免疫狀態(tài)的重要手段。外周血是病人重要的檢測標(biāo)本，但僅代表再循環(huán)的淋巴細(xì)胞。實驗動物還可取胸腺、脾、淋巴結(jié)等作為標(biāo)本進(jìn)行檢查。一、外周血單個核細(xì)胞的