畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）-淺談酸性蛋白酶

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文（設(shè)計(jì)）-目錄摘要………………3關(guān)鍵詞……………3Abstract…………………………3Keywords………………………3前言………………3蛋白酶的發(fā)展歷程………………41.1蛋白酶的定義……………41.2微生物蛋白酶的分類……………………41.3蛋白類酶…………………4酶的生產(chǎn)方法……………………4酸性蛋白酶制劑的性能…………43.1酸性蛋白酶的作用機(jī)理…………………43.2PH對(duì)酶活及酶穩(wěn)定性的影響……………53.3溫度對(duì)酶活性及穩(wěn)定性的影響…………53.4金屬離子對(duì)酶活力的影響………………53.5酸性蛋白酶制劑酶活力定義……………5酸性蛋白酶制劑的生產(chǎn)…………54.1工業(yè)級(jí)酸性蛋白酶制劑的生產(chǎn)…………54.2食品級(jí)酸性蛋白酶制劑的生產(chǎn)…………54.3生產(chǎn)菌株的選擇…………54.4發(fā)酵培養(yǎng)基………………64.5發(fā)酵條件控制……………64.6酸性蛋白酶提取工藝……………………74.7提高酸性蛋白酶產(chǎn)量的措施……………8酸性蛋白酶的應(yīng)用及發(fā)展………………………8參考文獻(xiàn)……………8致謝…………………9

淺談酸性蛋白酶摘要酸性蛋白酶在食品、醫(yī)藥、紡織、皮革、飼料、化妝品、洗滌行業(yè)都有應(yīng)用，天然衛(wèi)生、無毒無害、十分安全。所以本文多酸性蛋白酶的基本內(nèi)容、生產(chǎn)工藝及應(yīng)用發(fā)展做了簡要的介紹。關(guān)鍵詞蛋白酶；生產(chǎn)工藝；發(fā)展及應(yīng)用AcidprolealyticenzymeAbstractAcidproteaseinfood,medicine,textile,leather,feed,cosmetics,washingindustrieshaveapplications,naturalhealth,avirulentandharmless,quitesafe.Sointhispaperthebasiccontentofmoreacidprotease,productionprocessandapplicationdevelopmentwereintroduced.Keywordsprotease;Productionprocess;Developmentandapplication前言水解蛋白質(zhì)肽鍵的一類酶的總稱。按其水解多肽的方式，可以將其分為內(nèi)肽酶和外肽酶兩類。內(nèi)肽酶將蛋白質(zhì)分子內(nèi)部切斷，形成分子量較小的月示和胨。外肽酶從蛋白質(zhì)分子的游離氨基或羧基的末端逐個(gè)將肽鍵水解，而游離出氨基酸，前者為氨基肽酶后者為羧基肽酶。按其活性中心和最適pH值，又可將蛋白酶分為絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。按其反應(yīng)的最適pH值，分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶。工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用的蛋白酶，主要是內(nèi)肽酶。微生物酸性蛋白酶國外從60年代就開始研制，而我國1970年上海工業(yè)微生物研究所首先從黑曲霉篩選一株3．350產(chǎn)酸性蛋白酶菌株，并和上海酒精廠協(xié)作進(jìn)行中試生產(chǎn)，填補(bǔ)了我國酸性蛋白酶制劑的空白。由于3．350酸性蛋白酶菌種發(fā)酵活力較低，生產(chǎn)工藝較繁雜，1977年被中國科學(xué)院微生物研究所和新疆生物土壤沙漠研究所共同研制的由宇佐美曲霉經(jīng)誘變、篩選的537高產(chǎn)酸性蛋白酶菌種取代。

目前國內(nèi)生產(chǎn)酸性蛋白酶的廠家，基本上都是用537酸性蛋白酶菌種生產(chǎn)，發(fā)酵酶活力一般在6000～7000u／ml，成品劑型有工業(yè)級(jí)的粉劑、食品級(jí)的粉劑和濃縮劑，成品的酶活力有5萬u／g、4萬u／g、2萬u／g（ml）。1蛋白酶的發(fā)展歷程1.1蛋白酶的定義蛋白酶是催化肽鍵水解的一類酶，它可迅速水解蛋白質(zhì)為胨、肽類，廣泛存在于動(dòng)物內(nèi)臟、植物莖葉、果實(shí)和微生物中。同時(shí)大多數(shù)微生物蛋白酶都是胞外酶。1.2微生物蛋白酶的分類微生物蛋白酶按其作用的最適pH可分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶三類。 堿性蛋白酶為透明褐色液體，能與水混溶，最適溫度50~60℃，最適pH8.5。 中性蛋白酶為金屬酶，褐色顆?；蛞后w，易溶于水，最適溫度45~55℃，最適pH5.5~7.5。 酸性蛋白酶為近乎白色至淺黃色無定型粉末或液體，易溶于水，最適溫度45℃，最適pH2.5。1.3蛋白類酶蛋白類酶主要是指由蛋白質(zhì)組成的酶（P酶）；而主要由核糖核酸組成的酶稱為核酸類酶（R酶）。蛋白類酶分為氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、合成酶（或稱連接酶）。2酶的生產(chǎn)方法酶的生產(chǎn)方法主要有：提取分離法、生物合成法、化學(xué)合成法。 酶的微生物合成法主要有：液體深層發(fā)酵、固體培養(yǎng)發(fā)酵、固定化細(xì)胞培養(yǎng)、固定化原生質(zhì)發(fā)酵。 酸性蛋白酶用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，采用液體深層發(fā)酵。液體深層發(fā)酵是指液體培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中滅菌冷卻后，接入產(chǎn)酶細(xì)胞，一定條件下發(fā)酵，適用于微生物細(xì)胞、動(dòng)植物細(xì)胞的培養(yǎng)。具有機(jī)械化程度高、技術(shù)管理嚴(yán)格、酶產(chǎn)率高、質(zhì)量穩(wěn)定，產(chǎn)品回收率高的特點(diǎn)，是目前酶發(fā)酵的主要方式。3酸性蛋白酶制劑的性能3.1酸性蛋白酶的作用機(jī)理

酶是一種蛋白質(zhì)，它是活細(xì)胞產(chǎn)生的生物催化劑，生物體的新陳代謝活動(dòng)都離不開酶的作用。酶的種類很多，酸性蛋白酶是水解酶類的一種，能夠在微酸環(huán)境下（pH2．5～4．0）水解動(dòng)植物蛋白質(zhì)，通過內(nèi)切和外切作用將蛋白質(zhì)水解為小肽和氨基酸。

3.2pH對(duì)酶活及酶穩(wěn)定性的影響

酸性蛋白酶穩(wěn)定pH范圍2.0～4.0之間，最適pH2.5，pH低于2．0、高于4．0將影響水解速度。

3.3溫度對(duì)酶活性及穩(wěn)定性影響

酸性蛋白酶適宜溫度范圍30℃～50℃，最適作用溫度為50℃，低于40℃酶活穩(wěn)定，超過50℃，酶活性損失嚴(yán)重。

3.4金屬離子對(duì)酶活力的影響

酸性蛋白酶可被Mn2＋、Ca2＋、Mg2＋離子激活，被Cu2＋、Hg2＋、Al3＋離子抑制，液體酸性蛋白酶，長時(shí)間存放碳鋼罐中失活較多。

3.5酸性蛋白酶制劑酶活力定義

酸性蛋白酶活力是指1克固體酶粉或1ml液體酶，在45℃左右和pH2.5條件下，1分鐘水解酪酸蛋白產(chǎn)生1微克酪氨酸即為一個(gè)酶活力單位。酸性蛋白酶45℃酶活為50138左右。4酸性蛋白酶制劑的生產(chǎn)4.1工業(yè)級(jí)酸性蛋白酶制劑的生產(chǎn)

開始生產(chǎn)的微生物酸性蛋白酶，只是工業(yè)級(jí)的，主要用于皮毛軟化。微生物菌種通過液體通風(fēng)發(fā)酵，成熟發(fā)酵醪再經(jīng)硫酸銨鹽析，板框壓濾，氣流（沸騰）干燥，粉碎，化驗(yàn)，包裝制成工業(yè)級(jí)粉劑酸性蛋白酶。

4.2食品級(jí)酸性蛋白酶制劑的生產(chǎn)

隨著現(xiàn)代超濾膜濃縮技術(shù)在酶制劑行業(yè)上的應(yīng)用，近幾年生產(chǎn)了食品級(jí)酸性蛋白酶制劑。食品酸性蛋白酶前發(fā)酵與工業(yè)級(jí)相同，只是后提取不同，成熟發(fā)酵醪進(jìn)入絮凝罐，加入絮凝劑絮凝沉淀再經(jīng)板框壓濾機(jī)壓濾，濾餅經(jīng)干燥后可做飼料酶添加劑，濾清液經(jīng)超濾膜濃縮器濃縮經(jīng)化驗(yàn)合格，加入防腐劑、穩(wěn)定劑就是成品的濃縮酸性蛋白酶制劑（見附表）。因濃縮劑酸性蛋白酶要求在低溫存放，環(huán)境溫度超過15℃嚴(yán)重失活，只能短時(shí)間就近使用，但濃縮酶經(jīng)載體（食用級(jí)淀粉）吸附干燥后，在常溫下可長時(shí)間存放不失活。食品級(jí)酸性蛋白酶與工業(yè)級(jí)酸性蛋白酶檢測酶活力都是按照qb1805．3－93執(zhí)行，但食品級(jí)酸性蛋白酶，不含有對(duì)人體有害的物質(zhì)，是采用食品級(jí)淀粉作為載體，吸附干燥制成粉劑。為滿足糧食生產(chǎn)酒精、白酒、啤酒工藝的需要，微生物指標(biāo)有著嚴(yán)格要求，除致病菌不得檢出外，每克粉劑或每毫升濃縮劑酸性蛋白酶、雜菌酶，不得高于5000個(gè)／g（ml）。4.3生產(chǎn)菌株的選擇目前已經(jīng)用于生產(chǎn)酸性蛋白酶的微生物菌株有：黑曲霉、米曲霉、擬青霉、啤酒酵母、乳酸桿菌、枯草桿菌等，其中以黑曲霉為主，這些曲霉產(chǎn)生的蛋白酶有一定的耐酸性和耐熱性。我國生產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株有黑曲霉AS3.301，AS3.350等。黑曲霉是曲霉屬黑曲霉群霉菌，菌絲體由具有橫隔的分支菌絲構(gòu)成，菌叢黑褐色，頂囊大球形，小梗雙層，分生孢子球形，平滑或粗糙。黑曲霉可以用于生產(chǎn)多種酶，有胞外酶也有胞內(nèi)酶，主要用于酸性蛋白酶等的生產(chǎn)。4.4發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酸性蛋白酶的微生物，它們的發(fā)酵培養(yǎng)基都基本選擇麩皮、米糠、玉米粉、淀粉、飼料魚粉、豆餅粉、玉米漿等各種碳氮源，按各種不同比例混合，添加無機(jī)鹽配成各種培養(yǎng)基。C源：蛋白酶的生產(chǎn)既受分解代謝產(chǎn)物阻遏也受底物的誘導(dǎo)。葡萄糖等容易利用的碳源?？梢鸱纸獯x阻遏使產(chǎn)酶降低，因此通常用大麥粉、玉米粉、淀粉，有時(shí)也用麥芽糖做碳源。黑曲霉生產(chǎn)酸性蛋白酶時(shí)利用玉米粉作為碳源。N源：黑曲霉生產(chǎn)酸性蛋白酶時(shí)需要較高濃度的氮源濃度，在有機(jī)氮存在時(shí)，NH4+或NO3-對(duì)黑曲霉生產(chǎn)酸性蛋白酶有顯著促進(jìn)作用。故一般采取高濃度的有機(jī)氮并輔與濃度為1%--3%的無機(jī)氮。有機(jī)氮常用蛋白胨、豆餅粉、魚粉的石灰水解物等。無機(jī)鹽：磷酸鹽對(duì)微生物蛋白酶的生產(chǎn)很重要。磷酸鹽對(duì)微生物蛋白酶的生產(chǎn)很重要，使用麩皮、米糠等含磷較豐富的原料時(shí)，添加磷酸鹽對(duì)產(chǎn)酶具有促進(jìn)作用，在黑曲霉3.350酸性蛋白酶的生產(chǎn)培養(yǎng)基中添加0.1%~0.3%的磷酸鹽可使酶活性提高20%~30%。Ca2+對(duì)某些菌株產(chǎn)蛋白酶具有很大影響，培養(yǎng)基中添加0.5%CaCl2黑曲霉3.350酸性蛋白酶的產(chǎn)量會(huì)提高40%左右。其他成分：向培養(yǎng)基中添加適量表面活性劑可以改善細(xì)胞膜的通透性或誘導(dǎo)酶的生成，在一定條件下可顯著促進(jìn)蛋白酶的生產(chǎn)。下面列出的是黑曲霉3．350發(fā)酵培養(yǎng)基的配方：

玉米粉6％豆餅粉4％玉米漿0.6％氯化銨1.0％氯化鈣0.5％磷酸二氫鈉0.2％

豆餅石灰水解液10％4.5發(fā)酵條件控制（1）接種量：適當(dāng)控制接種量對(duì)菌株產(chǎn)酸性蛋白酶的活力關(guān)系很大。一般接種量為5%~10%，且有研究表明5％的接種量比10％的接種量要好。

（2）pH：pH對(duì)于生產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株來說，培養(yǎng)基的起始pH對(duì)其產(chǎn)量有較大的影響，黑曲霉酸性蛋白酶的最適pH是2.5~2.7，但黑曲霉AS3.350發(fā)酵產(chǎn)生酸性蛋白酶培養(yǎng)基的最初濃度應(yīng)調(diào)節(jié)為4.5~5.5左右。（3）溫度：黑曲霉酸性蛋白酶生產(chǎn)對(duì)于溫度的變化很敏感，黑曲霉正常發(fā)酵控制在30℃左右。（4）通風(fēng)量：液體深層培養(yǎng)中大部分微生物在合成蛋白酶時(shí)需要強(qiáng)烈攪拌通風(fēng)。氧是黑曲霉生物合成酸性蛋白酶必須的，通風(fēng)量較大對(duì)產(chǎn)酸性蛋白酶有利，通風(fēng)氣量不足對(duì)黑曲霉菌絲體的生長無明顯影響，但對(duì)酶產(chǎn)量有嚴(yán)重的影響，通風(fēng)量對(duì)產(chǎn)酶的影響在培養(yǎng)前期更為明顯，短暫停止通風(fēng)攪拌會(huì)導(dǎo)致酶產(chǎn)量急劇下降。因此發(fā)酵工程中應(yīng)控制好通風(fēng)量，0~24h為1:0.25,24~48h為1:0.5,48h至結(jié)束為1:1.0，發(fā)酵周期為72h左右。（5）氧載體：在發(fā)酵過程中，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入正十二烷、全氟化碳，液態(tài)烷烴(為12—16碳直鏈烷烴混合物)等氧載體，使培養(yǎng)基中氧傳遞速度加快，產(chǎn)生氣泡少，剪切力小，能明顯提高菌株產(chǎn)酸性蛋白酶的量。（6）滅菌：工業(yè)發(fā)酵穩(wěn)產(chǎn)的關(guān)鍵條件之一是在整個(gè)生產(chǎn)過程中維持純種培養(yǎng)，避免雜菌的入侵。行業(yè)上把過程污染雜菌的現(xiàn)象簡稱染菌。染菌對(duì)工業(yè)發(fā)酵的危害，輕則影響產(chǎn)品的值和量，重則倒灌，顆粒無收，嚴(yán)重影響工廠的效益。應(yīng)該注意對(duì)培養(yǎng)基、發(fā)酵罐、通入空氣等進(jìn)行滅菌，包含空消和實(shí)消等過程。（7）消泡：泡沫堆積多降低了發(fā)酵罐的裝料系數(shù)；增加了菌群的非均一性；增加了污染雜菌的機(jī)會(huì)；大量起泡會(huì)引起逃液，招致產(chǎn)物流失；消泡劑的加入有時(shí)會(huì)給發(fā)酵或提煉加工帶來不便。因此，應(yīng)該盡量避免泡沫的產(chǎn)生。4.6酸性蛋白酶提取工藝酸性蛋白酶生產(chǎn)的最后一道工藝就是提取，提取的方法主要有鹽析沉淀法、單寧酸沉淀法，或者采取多種方法結(jié)合來提取酸性蛋白酶。4.6.1鹽析沉淀法將培養(yǎng)物濾去菌體用鹽酸調(diào)節(jié)pH4.0以下，加入硫酸銨至濃度55%，靜置過濾棄上清液，將沉淀壓濾去母液，于40℃烘干磨粉，得到工業(yè)用的粗制酶制劑粉末。亦可將發(fā)酵液濾除菌體后，使用刮板式薄膜蒸發(fā)器40℃濃縮3~4倍，可直接作為液體的粗酶制劑商品。醫(yī)藥和啤酒工業(yè)用酶需鹽析后進(jìn)一步用離子交換樹脂脫色處理，然后濃縮并以陽離子樹脂脫鹽，最后干燥、磨粉，得到淡黃色或乳白色粉末。4.6.2單寧酸沉淀法單寧酸是一種離子型表面活性劑，能與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物而使其沉淀，將發(fā)酵液過濾后調(diào)節(jié)pH5.5左右，在攪拌下向?yàn)V液中加入10%單寧酸，使單寧酸的終濃度為1%左右，靜置1h，離心收集酶與單寧酸的復(fù)合物。接著向此復(fù)合物中加入10%聚乙二醇（相對(duì)分子質(zhì)量6000）溶液，使聚乙二醇用量為原酶液的0.3%~0.5%。然后不斷攪拌，離心去除單寧酸聚乙二醇聚合物（濃縮量10倍，收率90%以上），再將濃縮酶液調(diào)節(jié)pH4.5左右，加入糖用活性炭3%脫色，得到淺黃脫色酶液（回收率90%~95%）。脫色液在低溫下以乙醇沉淀活用硫酸銨鹽析，干燥后制得淺色酶粉，其活性可達(dá)4X105U以上，總收率70%以上。4.7提高酸性蛋白酶產(chǎn)量的措施（1）添加誘導(dǎo)物包括酶的作用底物、反應(yīng)產(chǎn)物、作用底物的類似物等。（2）控制阻遏物的濃度，解除反饋?zhàn)瓒?、分解代謝物阻遏等，主要通過減少葡萄糖等易分解利用的碳源而用玉米粉、大麥粉等做碳源。（3）添加表面活性劑包含離子型、非離子型的表面活性劑等。5酸性蛋白酶的應(yīng)用及發(fā)展酸性蛋白酶的用途可以說是涉及到生活中的方方面面：醫(yī)