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為生命品質(zhì)的提升貢獻(xiàn)智慧和力量,成為世界級(jí)領(lǐng)先企業(yè)。 4 4 6 82.嗅覺行為訓(xùn)練原理u 2.1.2延遲非匹配樣本任務(wù)DNMS(DelayedNonMatchtosampletask) 2.1.3延遲配對(duì)偶聯(lián)任務(wù)DPA(DelayedpairedAssociationtask) .使用光纖記錄技術(shù)應(yīng)用至嗅覺研究isau實(shí)驗(yàn)設(shè)備和材料 4.2.2器具消毒、儀器檢查 400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司 4,3.5埋植陶瓷插針及固定嗅覺頭桿 aa光纖記錄與嗅覺行為實(shí)驗(yàn) 4,4.2光纖記錄結(jié)合嗅覺行為實(shí)驗(yàn) 5.5耗材參數(shù)搭配 2.嗅覺研究數(shù)據(jù)34 深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l 1.3.1超100小時(shí)穩(wěn)定采集 1.4.1滿足皮瓦級(jí)微弱信號(hào)檢測(cè)需求(軸突i膠質(zhì)細(xì)胞) 2.嗅覺行為訓(xùn)練系統(tǒng)主要功能特點(diǎn)44 深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l 3.1外側(cè)內(nèi)嗅皮層直接編碼獎(jiǎng)賞關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí) 記憶下丘腦環(huán)路調(diào)控海馬神經(jīng)發(fā)生促進(jìn)記憶提取對(duì)抗焦慮樣行為 s.嗅覺行為訓(xùn)練系統(tǒng)應(yīng)用案例so5.1延遲期間的內(nèi)側(cè)前額葉活動(dòng)有助于學(xué)習(xí)工作記憶任務(wù) 1.3光纖及陶瓷插針的的NA值是什么意思?代表什么意義? 1.5融合光纖是什么?和一分二光纖的區(qū)別? 2.嗅覺訓(xùn)練系統(tǒng)常見問題及解析58 2.2嗅覺記憶認(rèn)知行為訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)會(huì)用到多少個(gè) 深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l 2.4嗅覺行為訓(xùn)練能同步進(jìn)行電生理記錄實(shí)驗(yàn)嗎? 2.5嗅覺行為訓(xùn)練過程中產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)氣味擴(kuò)散到實(shí)驗(yàn)室是否構(gòu)成危害? 400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司第一章初學(xué)者導(dǎo)航本章將介紹光纖記錄發(fā)展歷史和嗅覺研究的基本知識(shí),如果你是剛開始學(xué)習(xí)光纖記錄技術(shù)并應(yīng)用到嗅覺研究上,以下的概要內(nèi)容將對(duì)你非常有幫助。1.光纖記錄發(fā)展歷史光學(xué)來測(cè)量熒光分子在大腦中發(fā)出的光信號(hào)。那么從這個(gè)原理中,我們能夠明白,實(shí)現(xiàn)這個(gè)實(shí)驗(yàn)需要能夠在大腦表達(dá)熒光的探針工具,同時(shí)需要一套可以傳輸熒光,檢測(cè)熒光的設(shè)備。目前最常用的熒光工具分為鈣信號(hào)探針,神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)探針,電壓敏感探針等。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)應(yīng)用的動(dòng)物模型種類很多,同時(shí)我們還需要研究特定腦區(qū)甚至特定種類細(xì)胞,所以基因編輯技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用在探針的開發(fā)上。2014年,斯坦福大學(xué)的karlDeisseroth教授實(shí)驗(yàn)室在發(fā)表的文章中首次命名了末梢鈣活動(dòng)的同時(shí)追蹤,結(jié)合光遺傳技術(shù),闡明了腹側(cè)背蓋區(qū)-伏隔核的神經(jīng)投射在編碼和預(yù)測(cè)社交行為中的作用?;谶z傳編碼鈣指示劑的發(fā)展,實(shí)驗(yàn)人員可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞類型特異性的標(biāo)記,監(jiān)測(cè)小鼠在完成復(fù)雜行為任務(wù)過程中一群特定類型細(xì)胞的平均活動(dòng)。這種技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)于編碼社交行為、學(xué)習(xí)記憶和恐懼等行為以及病理回路水平神經(jīng)信號(hào)的探測(cè)具有里程碑式的意義。近年來,隨著可遺傳編碼熒光指示劑的不斷更新迭代和神經(jīng)遞質(zhì)探針的開發(fā),應(yīng)用光纖記錄技術(shù)來檢測(cè)清醒自由活動(dòng)動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的鈣信號(hào)及神經(jīng)遞質(zhì),以反應(yīng)神經(jīng)元活動(dòng)和神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)過程,已成功發(fā)表近千篇文章,并成為發(fā)育、神經(jīng)可塑性和神經(jīng)退行性疾病等研究的重要技術(shù)手段。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司2.嗅覺研究基本知識(shí)大腦持續(xù)從周圍環(huán)境接收大量的感官刺激,例如氣味、光線、聲音、碰觸等。在生命體正常狀態(tài)下,大腦靈活地調(diào)整各種信號(hào)通路,高效處理感官刺激信息。嗅覺是基于前期的解剖和功能研究,已知嗅覺傳導(dǎo)包括3個(gè)部分:①嗅裂的嗅覺神經(jīng)元接受嗅刺激,經(jīng)嗅神經(jīng)到嗅球;②嗅球換元經(jīng)嗅束到達(dá)初級(jí)嗅覺皮層,包括前嗅核、梨狀皮層、杏仁核及內(nèi)嗅區(qū)等;③傳遞至次級(jí)嗅覺皮層,包括海馬體、額眶皮質(zhì)、島葉及等。值得一提的是,嗅覺、味覺和三叉神經(jīng)功能雖是3種截然不同的方式,但在日常生活中,他們往往是伴隨激活的。嗅覺作為關(guān)鍵的感覺之一,就感知能力來說極為復(fù)雜,人類可以辨識(shí)約一萬種以上的不同氣味,許多生物雖然沒有很好的視力,卻有相當(dāng)敏銳的嗅覺,嗅覺的重要性逐漸被人們認(rèn)識(shí)。嗅覺感受器的類型是所有感覺系統(tǒng)中最多的,小鼠有著約1000種編碼嗅覺感受器的基因,占了全基因組的3%。而人類功能性的嗅覺感受器編碼基因大約為400個(gè),還有約600個(gè)假基因。氣味多是一系列化合物的復(fù)雜成分構(gòu)成,所以當(dāng)我們感受一種氣味時(shí),其實(shí)是不同的嗅覺感受器產(chǎn)生不同強(qiáng)度的響應(yīng),綜合感受處理嗅覺信息。因此,嗅覺信息整合處理的嗅覺環(huán)路機(jī)制本身,就是非常有價(jià)值的科學(xué)問題。另外,大量臨床研究發(fā)現(xiàn),許多腦部病變的發(fā)生都伴隨著嗅覺障礙,例如頭部外傷、丘腦或前額葉皮質(zhì)病變、顱內(nèi)壓增高等病變,另外在阿爾茨海默癥、路易體癡呆、帕金森病、亨廷頓舞蹈病、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中也障礙。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中,嗅覺作為驅(qū)動(dòng)認(rèn)知行為的重要感覺模式,在嗅覺辨別、學(xué)習(xí)記憶、決策、沖動(dòng)等認(rèn)知行為中發(fā)揮重要作用,基于嗅覺刺激的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)在相關(guān)研究中應(yīng)用廣泛,推動(dòng)了認(rèn)知及神經(jīng)系統(tǒng)疾病機(jī)制的研究進(jìn)展。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司嗅覺系統(tǒng)示意圖參考文獻(xiàn):2.LUO,L.(2020).principlesofNeurobiology(2nded.).Garlandscience,3.DUW,chenF.[Applicationresearchanddezazhi.2022Jun;36(6):482-486.chinese.深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司第二章工作原理及數(shù)據(jù)采集分析本章節(jié)將解釋光纖記錄及嗅覺行為實(shí)驗(yàn)的工作原理、優(yōu)點(diǎn),并展示相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作步驟、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)及數(shù)據(jù)分析等內(nèi)容。3.光纖記錄的優(yōu)點(diǎn)4.使用光纖記錄技術(shù)應(yīng)用至嗅覺研究5.光纖記錄實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)7.嗅覺研究數(shù)據(jù)8.光纖記錄數(shù)據(jù)分析1.光纖記錄工作原理1.1基本原理人類大腦有大約900億個(gè)神經(jīng)元,這些神經(jīng)元通過突觸相互連接,形成復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),從而產(chǎn)生各種復(fù)雜的功能。大腦可以合成和釋放數(shù)百種神經(jīng)遞質(zhì),神經(jīng)信號(hào)通過突觸釋放的神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)元之間傳遞。當(dāng)神經(jīng)興奮傳遞到突觸末端時(shí),會(huì)刺激突觸上的鈣通道打開,促進(jìn)鈣離子的流入,細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度瞬時(shí)上升,驅(qū)動(dòng)突觸小泡將神經(jīng)遞質(zhì)釋放到突觸間隙,并與突觸后膜上的受體結(jié)合,將神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)傳遞給下一個(gè)神經(jīng)元,從而逐步傳遞信息。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司以鈣離子的檢測(cè)為例,在神經(jīng)系統(tǒng)中,靜息狀態(tài)下神經(jīng)元的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度約為50-100nM,但當(dāng)神經(jīng)元興奮時(shí),細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度會(huì)增加10-100倍,因此我們可以通過注射鈣離子基因編碼指示劑(calciumindicator,如GcaMPSRcaMPS等)來標(biāo)記鈣離子。常見的基因編碼鈣離子指示劑來自于綠色熒光蛋白(GFP等)及其變異體(例如循環(huán)排列GFP、YFP、CFP、RFP等)的熒光蛋白質(zhì),可與鈣調(diào)蛋白(caM)和肌球蛋白輕鏈激酶M13域結(jié)合。當(dāng)神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)時(shí),鈣通道打開,大量構(gòu)重排,從而增強(qiáng)綠色熒光信號(hào)。光纖記錄系統(tǒng)的技術(shù)原理是借助鈣濃度的變化與神經(jīng)元活動(dòng)之間的嚴(yán)格對(duì)應(yīng)關(guān)系,使用特殊的熒光指示劑或熒光探針,將神經(jīng)元中鈣離子的濃度通過熒光強(qiáng)度表達(dá),并被光纖記錄系統(tǒng)捕獲,從而達(dá)到檢測(cè)神經(jīng)元活動(dòng)的目因此,我們可以通過檢測(cè)鈣信號(hào)的變化來表征神經(jīng)元的活動(dòng),進(jìn)而研究神經(jīng)元活動(dòng)與動(dòng)物行為之間的相關(guān)性,探索復(fù)雜行為背后的調(diào)節(jié)機(jī)制。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司光纖記錄檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)的原理與上述相同,把對(duì)結(jié)構(gòu)變化敏感的熒光蛋白 變,并增強(qiáng)熒光信號(hào),結(jié)合現(xiàn)有的成像技術(shù),實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)濃度的動(dòng)態(tài)變化。1.2光纖記錄常用的熒光指示劑通過病毒注射、轉(zhuǎn)染等技術(shù)手段,可以將上述可遺傳編碼的指示劑或探針表達(dá)在細(xì)胞或小鼠腦部。現(xiàn)在使用較廣泛的基因編碼鈣離子指示劑有:GcaMP、pericams、cameleons、TN-XXL和Twitch等,其中GcaMP6GcaMP7由于有著超強(qiáng)的敏感度,現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用于活體鈣成像研究。以下是常見基因編碼鈣離子指深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司GcaMP6GcaMP6SGcaMP6mGcaMP6fneuritisornervefibHighcontrast,suitablefobeusedwithGcaMPjRcaMplbAxon-GcaMPAxon-GcaMPMarktheaxon(膽囊收縮素),VIP(血管活性常肽),ecB(內(nèi)源性大麻素)等。因?yàn)殁}信號(hào)以及神經(jīng)遞質(zhì)的信號(hào)變化周期相對(duì)較慢(ms),如果我們想要記錄膜電位的快速信號(hào),就需要使用電壓敏感探針(GEVI)等相關(guān)工具。膜電位的變化是突觸電位和動(dòng)作電位的直接標(biāo)志。在某些情況下,深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司在了解這些熒光指示劑之后,我們需要清楚該如何將指示劑表達(dá)到動(dòng)物體內(nèi)。常見的辦法有病毒轉(zhuǎn)染,動(dòng)物雜交等。以腦立體定位注射為例,整體實(shí)驗(yàn)流程包括:①選擇合適的病毒工具(病毒包含著指示劑的編碼信息)注射到特定位置;②在注射位點(diǎn)埋植光纖,用于傳送激發(fā)光和收集發(fā)射光,并固定嗅覺頭桿,用于將小鼠固定于嗅覺行為訓(xùn)練系統(tǒng)的固定器上;③等待2-3周時(shí)間,病毒表達(dá)后即可結(jié)合嗅覺訓(xùn)練系統(tǒng)1.3熒光信號(hào)的激發(fā)當(dāng)動(dòng)物準(zhǔn)備完成,需要選擇一款合適的系統(tǒng)用于收集分析熒光信號(hào)。光纖記錄系統(tǒng)基本的組成包括激發(fā)光源,濾光片,二色像鏡,探測(cè)器,以及能夠傳輸激發(fā)光和發(fā)射光的光纖耗材等。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司選擇不同種類的配件導(dǎo)致了系統(tǒng)的核心功能有所差示劑的激發(fā)波長(zhǎng)范圍進(jìn)行選擇,Gcamp的激發(fā)波長(zhǎng)集中在450nm-480nm之間,而Rcamp激發(fā)波長(zhǎng)集中在550nm-600nm之間。同時(shí)需要選擇合適的激發(fā)功率,例如GcaMP的激發(fā)功率在20W~50uW之間較為合適,如果功率過高,則容易導(dǎo)550nm之間,而Rcamp發(fā)射波長(zhǎng)集中在570nm-630nm之間。不同熒光蛋白激發(fā)及發(fā)射波長(zhǎng)范圍PMT光電倍增管靈敏度高,適合用于極弱信號(hào)的檢測(cè),但是僅可用于單通道實(shí)驗(yàn);CCD可用于多通道記錄,但是成像速度較慢;CMOS具有更好的性價(jià)比,可用于多通深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司道記錄,同時(shí)圖像處理速度很快。多通道實(shí)驗(yàn)記錄可以使用多分支光纖,通過一個(gè)系統(tǒng)就可以記錄多個(gè)腦區(qū)或者多只動(dòng)物的信號(hào)變化,極大拓展研究場(chǎng)景及提高實(shí)驗(yàn)效l光纖耗材等需要選擇帶有黑色保護(hù)層,且自發(fā)熒光較低的材質(zhì),可以更好的避免環(huán)境光以及自發(fā)熒光對(duì)于信號(hào)的干擾。光纖記錄實(shí)驗(yàn)的耗材選擇可以參考以下文對(duì)于不同顏色的熒光指示劑,探測(cè)器通過軟件控制激發(fā)光以及探測(cè)器的特定開放時(shí)間,或者選擇增加探測(cè)器,將兩種信號(hào)進(jìn)行獨(dú)立采集,以區(qū)分兩種不同的信號(hào)。從上圖中可看出,410nmLED470nmLED560nmLED激發(fā)光源在特定幀率下(可通過軟件設(shè)置)交替輸出。而兩個(gè)探測(cè)器,cameral只在410&470nmLED輸出的時(shí)候進(jìn)行同步采集信號(hào)(對(duì)應(yīng)收集綠色熒光信號(hào)),camera2只在560nmLED輸出的時(shí)候進(jìn)行同步采集信號(hào)(對(duì)應(yīng)收集紅色熒光信號(hào))。在瑞沃德光纖記錄系統(tǒng)中,采用了雙檢測(cè)器、分時(shí)序采集的設(shè)計(jì)。雖然較多的文擾。但是單探測(cè)器使用的是雙波段濾光片(可對(duì)綠色和紅色同時(shí)通過),有可能會(huì)有深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司非常少的串?dāng)_影響。這是因?yàn)?70nmLED存在一定可能性激發(fā)紅色熒光探針,從而讓紅色熒光增強(qiáng),造成串?dāng)_。鈣離子指示劑在405-420nm波長(zhǎng)光激發(fā)時(shí),其熒光強(qiáng)度隨細(xì)胞內(nèi)ca2+濃度變化維持一個(gè)恒定的狀態(tài)。因此,可以從一定程度上認(rèn)為410nm激發(fā)所對(duì)應(yīng)的熒光信中,可以針對(duì)性將背景信號(hào)去除,從而獲取真實(shí)信號(hào)。2.嗅覺行為訓(xùn)練原理嗅覺行為訓(xùn)練原理是基于嗅覺刺激關(guān)聯(lián)飲水獎(jiǎng)勵(lì)反饋,建立認(rèn)知學(xué)習(xí)范式,通過獎(jiǎng)勵(lì)強(qiáng)化小鼠學(xué)習(xí)識(shí)別不同氣味,快速幫助用戶開展基于嗅覺刺激的認(rèn)知評(píng)估實(shí)驗(yàn)。可兼容光遺傳、光纖記錄、電生理等系統(tǒng)拓展實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景,推動(dòng)課題進(jìn)展。也可專用于穩(wěn)定傳遞實(shí)驗(yàn)氣味,結(jié)合下游場(chǎng)景進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.1經(jīng)典實(shí)驗(yàn)范式400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司為生命品質(zhì)的提升貢獻(xiàn)智慧和力量,成為世界級(jí)領(lǐng)先企業(yè)。嘴獲得飲水獎(jiǎng)勵(lì);聞到氣味B時(shí),舔珉水嘴不會(huì)有飲水獎(jiǎng)勵(lì),且要求小鼠拒絕舔珉水2.1.2延遲非匹配樣本任務(wù)DNMS在該任務(wù)中,訓(xùn)練小鼠根據(jù)氣味的不匹配關(guān)系做出正確響應(yīng)以獲得飲水獎(jiǎng)勵(lì)。給小鼠先后聞兩個(gè)氣味,若兩個(gè)氣味不同,則舔珉水嘴獲得飲水獎(jiǎng)勵(lì);反之,若為同種氣味,舔珉水嘴不會(huì)有飲水獎(jiǎng)勵(lì),且要求小鼠拒絕舔珉水嘴。2.1.3延遲配對(duì)偶聯(lián)任務(wù)DPA(DelayedpairedAssoc在該任務(wù)中,訓(xùn)練小鼠根據(jù)氣味的配對(duì)偶聯(lián)關(guān)系做出正確響應(yīng)以獲得飲水獎(jiǎng)勵(lì)。給小鼠先后聞兩種不同的氣味,固定氣味組合是有獎(jiǎng)勵(lì)試驗(yàn)組(例如氣味A&D,氣味B&C),小鼠舔珉水嘴獲得飲水獎(jiǎng)勵(lì);另外氣味組合是無獎(jiǎng)勵(lì)試驗(yàn)組(例如氣味A&C,氣味B&D),小鼠舔珉水嘴不會(huì)有飲水獎(jiǎng)勵(lì),且要求小鼠拒絕舔珉水嘴。2.2常用實(shí)驗(yàn)氣味酯類甲酸丙酯甲酸丁酯乙酸乙酯乙酸丙酯乙酸異戊酯異戊烯醇1-丁醇1-戊醇叔戊醇正己醇酮類2-己酮環(huán)己酮2-庚酮苯類醛類苯乙醛其他檸檬醛丁香油醋酸選擇一款合適的系統(tǒng)將有助于你的實(shí)驗(yàn)。如果你想深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966s-9516lrwd@IW為生命品質(zhì)的提升貢獻(xiàn)智慧和力量,成為世界級(jí)領(lǐng)先企業(yè)。練系統(tǒng)有更多的了解,歡迎聯(lián)系我們!3.光纖記錄的優(yōu)點(diǎn)研究清醒和自由活動(dòng)動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)是當(dāng)代神經(jīng)科學(xué)研究的一個(gè)關(guān)鍵檢測(cè)與神經(jīng)元活動(dòng)相關(guān)的鈣信號(hào),我們能夠更好地理解復(fù)雜的神經(jīng)回路。近年來,包括雙光子顯微鏡、單光子顯微鏡和光纖記錄在內(nèi)的技術(shù)發(fā)展使我們能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)動(dòng)物過去,大多數(shù)體內(nèi)鈣成像都是在雙光子顯微鏡下進(jìn)行的。雙光子顯微鏡是一種熒光成像技術(shù),其中兩束相干激光通過顯微鏡的目鏡聚焦到由點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)定義的點(diǎn),類似于選擇性激發(fā)類熒光分子的共焦顯微鏡。在雙光子顯微鏡中,激發(fā)光的波長(zhǎng)接近700-1000nm,接近紅外光譜。在體雙光子成像的第一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是更長(zhǎng)波長(zhǎng)的光在組織中散射更少,穿透更深;第二個(gè)是良好的分辨率,不僅可以顯示單個(gè)神經(jīng)元,還可以雙光子顯微鏡中的激光掃描技術(shù)也用于在體內(nèi)成像過程中檢測(cè)神經(jīng)元?jiǎng)恿W(xué),但區(qū)分信號(hào)和噪聲的激發(fā)功率通常需要足夠高,從而導(dǎo)致一定程度的漂白,雙光子顯微鏡在成像深度方面受到許多因素深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司(GRIN)晶狀體,可以看到更深的大腦區(qū)域,但由于物鏡的大小,大多數(shù)皮層或其他大腦結(jié)構(gòu)通常需要完全移除,為晶狀體植入騰出空間,這會(huì)對(duì)動(dòng)物造成較大的手術(shù)損傷。在大多數(shù)情況下,選擇大腦表層作為研究區(qū)域最合適,因?yàn)閾p傷最小,分辨率更高。雙光子顯微鏡體內(nèi)鈣成像的另一個(gè)缺點(diǎn)是由于物鏡的大小,動(dòng)物必須被頭部固定。目前實(shí)驗(yàn)者通過使用圓柱形或球形跑步機(jī)使得動(dòng)物能夠稍微自由移動(dòng),或者通過一個(gè)虛擬現(xiàn)實(shí)場(chǎng)景進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)動(dòng)物自由移動(dòng)。然而,這種虛擬現(xiàn)實(shí)加頭部固定成像的方法,已經(jīng)遭到許多科學(xué)家的質(zhì)疑。一部分研究者認(rèn)為,頭部固定的動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)期間一直處在物理約束和情緒壓力下,因此無法證明神經(jīng)元對(duì)外界的響應(yīng)在虛擬現(xiàn)實(shí)和自由探索下是等價(jià)的。更重要的是,許多社會(huì)行為,比如母嬰分離、交配和攻擊防御行為,都不能用頭部固定的實(shí)驗(yàn)來研究。基于微型顯微鏡的單光子活體鈣成像,研究人員可以記錄自由活動(dòng)動(dòng)物的鈣信號(hào)。該微型顯微鏡通過與梯度折射率(GRIN)的透鏡連接,可完成長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)群體神經(jīng)元活動(dòng)的觀察。這種裝置體積小,可以固定在動(dòng)物頭上,不會(huì)嚴(yán)重阻礙其運(yùn)動(dòng)。這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展使得微型顯微鏡成為研究發(fā)育、神經(jīng)可塑性和神經(jīng)退化性疾病的一種非常有用的工具。盡管使用微型顯微鏡在自由活動(dòng)的動(dòng)物中進(jìn)行鈣成像有很強(qiáng)的實(shí)用性,但這種方法仍存在一定局限性。與雙光子相比,單光子成像背景熒光更高,并且更容易發(fā)生光散射。并且在某些行為學(xué)實(shí)驗(yàn)在應(yīng)用受限,比如水迷宮和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。此外,由于GRIN透鏡植入物的直徑范圍為0.5mm~1mm,不可避免地會(huì)造成一定范圍的組織損傷,這可能會(huì)影響研究的關(guān)鍵回路。光纖記錄系統(tǒng)原理上主要分為熒光激發(fā)系統(tǒng)和收集系統(tǒng),即向?qū)嶒?yàn)動(dòng)物大腦特定腦區(qū)注射一定量的鈣染料或遺傳編碼的鈣指示劑,并在相同位置植入一根直徑200-深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l光經(jīng)PMT或CMOS傳感器轉(zhuǎn)換為電信號(hào),隨后經(jīng)數(shù)據(jù)采集卡被傳送至記錄系統(tǒng),以達(dá)到實(shí)時(shí)觀察所研究腦區(qū)群體神經(jīng)細(xì)胞鈣熒光活動(dòng)的目的。并且由于光纖探頭的體積小和質(zhì)量輕,研究人員可以同時(shí)對(duì)多個(gè)大腦區(qū)域進(jìn)行記錄。參考文獻(xiàn):advancesininvivocalciummeasurementstrategies[J].AcschemNeurosci.4.使用光纖記錄技術(shù)應(yīng)用至嗅覺研究4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)備和材料異氟烷麻醉系統(tǒng)、立體定位儀、數(shù)碼顯微鏡或雙目體視鏡、玻璃微電拉制儀、微量注射泵、剃毛工具、手術(shù)刀、眼科攝、眼科剪、棉簽、碘伏、AA毒、陶瓷插針、陶瓷插針夾持器、小鼠頭部固定桿、顱鉆、鉆頭(0.8mm)、顱釘 (M1.0XL2.0mm)、螺絲刀(45*1mm)、生理鹽水、牙托粉水(義齒基托聚合物,自凝型)、紅霉素眼膏、抗生素等。4.2術(shù)前準(zhǔn)備4.2.1確定目標(biāo)腦區(qū)坐標(biāo)確定目標(biāo)腦區(qū)位點(diǎn)通常有兩種策略:①通過使用立體定位圖譜,尋找目標(biāo)腦區(qū)具體位置,讀取目標(biāo)腦區(qū)深度、矢狀、冠狀坐標(biāo),最終確定目標(biāo)腦區(qū)的三維坐標(biāo)?!鹜ㄟ^閱讀參考文獻(xiàn),獲取方法中涉及目標(biāo)腦區(qū)的坐標(biāo)。400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司文獻(xiàn)中坐標(biāo)常用標(biāo)注:AP:anteroposterior,前購前后;ML:mediolateral,中縫左右;DV:dorsoventral,顱骨(硬腦膜)平面向下。注意事項(xiàng):文獻(xiàn)中坐標(biāo)選取的z軸參考點(diǎn)包括:面的Z軸讀值等。由于病毒表達(dá)時(shí)間較久,建議先用普通染料做預(yù)實(shí)驗(yàn),確定目標(biāo)腦4.2.2器具消毒、儀器檢查實(shí)驗(yàn)前使用酒精擦拭手術(shù)器械,檢查各種實(shí)驗(yàn)耗材是否準(zhǔn)備完整;檢查立體定位4.2.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備選取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢查其健康狀況,并進(jìn)行體重稱量。4.3動(dòng)物手術(shù)4.3.1動(dòng)物麻醉及固定400-966-9516l5)用適配器將小鼠固定在腦立體定位儀上,并將異氟烷濃度調(diào)整為1.5-2%。小鼠固定在腦立體定位儀上)麻醉深度可通過對(duì)腳趾捏合無反應(yīng)(監(jiān)測(cè)腳趾捏合反應(yīng))來確認(rèn),手術(shù)期間每20min一次。400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司8)在頭皮表面下注入0.1ml利多卡因,以提供局部鎮(zhèn)痛作用。9)涂抹紅霉素眼膏,避光以保護(hù)眼睛。4.3.2暴露顱骨1)將小鼠麻醉及固定在適配器上后,從前到后(眼睛之間到顱骨后部)做切2)用蘸有生理鹽水的棉簽擦拭切口,將頭骨表面清理干凈,確保頭骨干凈(沒有血液,毛皮或組織)并且干燥(使用干燥的棉簽吸生理鹽水或血液)。小鼠暴露顱骨4)將連接好玻璃電極的微量注射泵夾持到定位儀深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l量Bregma點(diǎn)左右兩側(cè)旁開2.3mm處顱骨的高度差,小于0.03mm則認(rèn)為左右顱骨水平,大于0.03mm則需要調(diào)節(jié)耳桿的高度來調(diào)整水平;前后方向測(cè)量Bregma點(diǎn)和Lambda點(diǎn)的高度差,也需小于0.03mm,若大于0.03mm則上7)在目標(biāo)標(biāo)記點(diǎn)處用顱鉆進(jìn)行開顱并挑開硬腦膜。此外還需鉆兩個(gè)預(yù)留孔,用于埋植顱釘。如果鉆孔過程發(fā)生出血,使用棉簽清潔血液,再使用一塊可吸收的顱骨鉆孔4.3.3病毒注射深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司1)從冰箱中取出病毒。4)將玻璃電極針移動(dòng)至目標(biāo)位點(diǎn)上方,然后下針至目標(biāo)位點(diǎn)后(下針過程保持5)注射完成后靜置10min10min后將微量注射器抬起(拔針過程保持勻速4.3.4埋植顱釘顱釘(小螺絲)植入深度約0.5mm左右,避免過深壓迫大腦,過淺固定不牢小,導(dǎo)致光纖不好埋植;也防止太靠近目標(biāo)腦區(qū),對(duì)目標(biāo)腦區(qū)損傷過大,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。顱骨鉆孔完成后,還需清理顱骨表面的顱骨碎屑,并用生理鹽水清洗并吸干水分或血液,保證顱骨表面干凈干燥。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司4.3.5埋植陶瓷插針及固定嗅覺頭桿(插針應(yīng)位于鉆頭產(chǎn)生的窗口上方)。纖維的底部周圍,避免涂到夾持器上。成牙科水泥小心滴涂于頭桿和頭骨連接處以固定頭桿。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司4.4光纖記錄與嗅覺行為實(shí)驗(yàn)光纖記錄系統(tǒng)與嗅覺訓(xùn)練系統(tǒng)聯(lián)用場(chǎng)景一般分為:①在小鼠接收氣味刺激時(shí)記錄神經(jīng)元鈣信號(hào)變化,則可在2-3周鈣熒光病毒表達(dá),同步開啟嗅覺實(shí)驗(yàn)及光纖記錄實(shí)病毒表達(dá)后,先進(jìn)行嗅覺記憶認(rèn)知行為前期訓(xùn)練,再結(jié)合光纖記錄系統(tǒng)同步進(jìn)行氣味4.4.1嗅覺行為訓(xùn)練①小鼠適應(yīng)頭桿及訓(xùn)練環(huán)境:將小鼠固定于軀體固定器,放入嗅覺行為訓(xùn)練箱中適應(yīng),訓(xùn)練前3天,每天適應(yīng)5分鐘。2小鼠飲水剝奪:訓(xùn)練前24小時(shí),取走小鼠飼養(yǎng)籠水瓶以進(jìn)行飲水剝奪。①舔水訓(xùn)練:訓(xùn)練小鼠建立舔珉水嘴獲得飲水獎(jiǎng)勵(lì)的初步認(rèn)知,以小鼠能夠主動(dòng)連續(xù)舔珉水嘴獲得飲水獎(jiǎng)勵(lì)為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn),通常訓(xùn)練1-2天即可。實(shí)驗(yàn)參數(shù)見下深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司2氣味相關(guān)舔水訓(xùn)練:小鼠建立氣味為線索時(shí)舔珉水嘴獲得飲水獎(jiǎng)勵(lì)的進(jìn)一步認(rèn)知,以小鼠在氣味釋放后主動(dòng)舔珉水嘴獲得飲水獎(jiǎng)勵(lì)的行為正確率達(dá)到70%為評(píng)估指標(biāo),通常訓(xùn)練2-3天即可。實(shí)驗(yàn)參數(shù)見下圖。氣味相關(guān)舔水訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)參數(shù)1氣味相關(guān)舔水訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)參數(shù)2深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司味B時(shí),舔珉水嘴不會(huì)有飲水獎(jiǎng)勵(lì),且要求小鼠拒絕舔珉水嘴。以小鼠在GO氣味釋為的綜合正確表現(xiàn)比率達(dá)到85%為評(píng)估指標(biāo),通常訓(xùn)練3-5天即可。實(shí)驗(yàn)參數(shù)見下圖。GO-Nogo范式實(shí)驗(yàn)參數(shù)1深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司等待時(shí)長(zhǎng)-ns兩次舔水間隔≤ns才視為連續(xù)sccm(standardcubiccentimeterperminutes)氣流量單位:標(biāo)況下每分鐘1立方厘米(1ml/min)稀釋氣流-sccm空氣氣路的氣流量Hit總數(shù)正確舔水次數(shù)odor實(shí)驗(yàn)氣味動(dòng)作延遲期偽隨機(jī)次數(shù)每4次Trial執(zhí)行偽隨機(jī)規(guī)則分配Trial出現(xiàn)順序及次數(shù)主動(dòng)獎(jiǎng)勵(lì)的Trial次數(shù)-n前n次Trial系統(tǒng)自動(dòng)給水誘導(dǎo)小鼠舔水4.4.2光纖記錄結(jié)合嗅覺行為實(shí)驗(yàn)使用光纖記錄系統(tǒng)采集動(dòng)物在嗅覺行為實(shí)驗(yàn)中大腦的鈣熒光信號(hào),通過分析軟件處理鈣熒光信號(hào)數(shù)據(jù),并結(jié)合嗅覺行為實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物的行為進(jìn)行分析。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司1)用BNC線將光纖記錄系統(tǒng)和嗅覺行為訓(xùn)練系統(tǒng)連接起來,以在小鼠接收氣味刺激和獲得飲水獎(jiǎng)勵(lì)時(shí)輸出TTL信號(hào)給光纖記錄系統(tǒng)打標(biāo)。嗅覺訓(xùn)練系統(tǒng)設(shè)置TTL信號(hào)端口2)將小鼠固定于嗅覺行為箱中,利用套管將光纖與小鼠頭部陶瓷插針進(jìn)行連3)開啟嗅覺行為訓(xùn)練系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)程序及光纖記錄系統(tǒng)同步采集熒光信號(hào)。5.光纖記錄實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)根據(jù)光纖記錄的實(shí)驗(yàn)程序,當(dāng)信號(hào)記錄不好時(shí),可以考慮以下因素。5.1儀器連接及參數(shù)設(shè)置深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l助于采集到熒光信號(hào)。調(diào)節(jié)幀率及曝光時(shí)長(zhǎng)注意事項(xiàng):深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司①若未記錄到信號(hào),可適當(dāng)調(diào)高光源功率;②動(dòng)物腦區(qū)較大,病毒注射量可適量增加;③病毒注射后也可先不埋植插針,待2-3周后病毒表達(dá),陶瓷插針連接光纖一起植入,邊植入插針邊檢測(cè)鈣信號(hào)。5.2病毒病毒應(yīng)即拿即用,避免反復(fù)凍融?;钚缘?表達(dá)效率低,轉(zhuǎn)染效果差,甚至未表達(dá)。建議選擇轉(zhuǎn)染效率更高的病毒工具。神經(jīng)元在相應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件下,沒有被激活,檢測(cè)不到信號(hào)。5.3病毒注射1)手術(shù)前定位:在病毒注射前,我們可以先注射臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行練習(xí),通過預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)腦區(qū)精準(zhǔn)定位,提高后面實(shí)驗(yàn)的成功率。腦區(qū)坐標(biāo)定位參考:調(diào)平時(shí)注意左右高度差小于0.03mmo深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司2)病毒注射:選擇較細(xì)直徑的玻璃電極可以減少注射損傷,對(duì)于淺層腦區(qū)注射實(shí)驗(yàn),還可以減少病毒泄露。建議病毒注射后留針10mino3)病毒注射檢測(cè):切腦片看熒光表達(dá)。熒光染色實(shí)驗(yàn)拍不出帶有熒光的細(xì)胞,可能原因是顯微鏡聚焦未在神經(jīng)細(xì)胞這一層上(如上圖出現(xiàn)模糊團(tuán)狀,可能會(huì)是細(xì)胞)、注射的腦區(qū)與病毒反應(yīng)的特異深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司注意事項(xiàng):如果沒有明顯的陽性信號(hào),可能原因有手術(shù)中腦區(qū)定位有偏差導(dǎo)致病毒注射位置不對(duì)(目標(biāo)腦區(qū)很小的話會(huì)常存在這個(gè)問題)、病毒注射后順著腦室流走、病毒注射5.4陶瓷插針埋植位置1)病毒注射與陶瓷插針植入可以在同一個(gè)手術(shù)進(jìn)行,避免二次手術(shù)對(duì)小鼠造成3)定期查看定位儀操作臂與夾持器的固定情況,防止角度偏差。4)病毒注射表達(dá)區(qū)域與陶瓷插針的植入位置需要保持接近,二者位置超過100深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司5.5耗材參數(shù)搭配1)光纖記錄實(shí)驗(yàn)對(duì)環(huán)境光比較敏感,建議實(shí)驗(yàn)在光線相對(duì)穩(wěn)定、昏暗的環(huán)境下進(jìn)行。光纖記錄更適合選擇黑色陶瓷插針與黑色陶瓷套管,可避免環(huán)境光對(duì)熒光信號(hào)的影響。2)較大數(shù)值孔徑的耗材有助于熒光信號(hào)的傳輸,所有的配件耗材保持相同的芯3)使用高強(qiáng)度的激光器對(duì)光纖進(jìn)行漂白,使得光纖等耗材的自發(fā)熒光降低,減4)檢查光纖是否有被小鼠咬破,造成損壞等。5.6儀器問題1)未連接光纖情況下,用燈光如手機(jī)手電筒等照射儀器出光口,在軟件上觀察物鏡是否有大量灰塵等臟污,如有,可能平時(shí)做完實(shí)驗(yàn)沒給設(shè)備接口帶防塵帽,光纖接口鏡頭里的灰太多,信號(hào)檢測(cè)能力大幅下降。2)以上均沒問題,考慮設(shè)備故障,用熒光片試一試,看看信號(hào)有沒有變化。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司6.嗅覺行為實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)估,實(shí)驗(yàn)周期約為7-10天,是認(rèn)知評(píng)估的復(fù)雜實(shí)驗(yàn)中相對(duì)高效的行為學(xué)訓(xùn)練。實(shí)驗(yàn)氣味傳遞的精準(zhǔn)度、飲水獎(jiǎng)勵(lì)的穩(wěn)定性、信號(hào)傳輸?shù)耐叫缘仁菦Q定訓(xùn)練成關(guān)鍵因素,為更高效的達(dá)標(biāo)記憶訓(xùn)練,我們從以下幾個(gè)方向小結(jié)了實(shí)驗(yàn)過程中的注意事項(xiàng),供大家快速定位解決問題。6.1儀器連接及系統(tǒng)設(shè)置1)儀器連接開啟后,軟件顯示如下系統(tǒng)報(bào)錯(cuò):應(yīng)注意軟件-幫助-產(chǎn)品規(guī)格的選擇與實(shí)際儀器規(guī)格是否匹配,此處報(bào)錯(cuò)為常規(guī)款儀器錯(cuò)誤選擇了"電生理兼容款"產(chǎn)品規(guī)格,切換正確即可。2)軟件安裝后無法打開或打開后出現(xiàn)持續(xù)卡頓時(shí),請(qǐng)檢查PC系統(tǒng)版本,olfactometer軟件對(duì)pc系統(tǒng)要求最低為windows10深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司6.2訓(xùn)練過程注意事項(xiàng)1)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)盡可能輕柔操作,建議于實(shí)驗(yàn)開始前三天對(duì)小鼠實(shí)施撫摸陪同玩耍行為,如使用棉麻手套則訓(xùn)練全過2)小鼠禁水時(shí)長(zhǎng)應(yīng)適度,時(shí)長(zhǎng)過短會(huì)導(dǎo)致禁水程度不夠小鼠不配合訓(xùn)練,時(shí)長(zhǎng)過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致小鼠脫水嚴(yán)重小鼠狀態(tài)不佳無法配合訓(xùn)練,更重要的是有損小鼠健康,不符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理原則。3)實(shí)驗(yàn)需在安靜環(huán)境下進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)保持安靜,不可高聲談?wù)?不可用力關(guān)門發(fā)出尖銳噪聲等。4)在結(jié)束每天的訓(xùn)練后給小鼠提供自由飲水0.5-1.0小時(shí)很重要,有利于維持小鼠健康狀態(tài)及保持小鼠每次訓(xùn)練禁水狀態(tài)的一致性。5)建議在每次訓(xùn)練開始啟動(dòng)程序測(cè)試水嘴出水,確保小鼠放入行為箱后即順利6)訓(xùn)練全過程應(yīng)保持水嘴獎(jiǎng)勵(lì)側(cè)選擇的一致性,始終使用雙側(cè)水嘴或始終使用6.3實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置至8ul,以使得小鼠在當(dāng)次訓(xùn)練過程中得保持好的狀態(tài)完成全部訓(xùn)練;session和trial參數(shù)的設(shè)置應(yīng)相互協(xié)調(diào),結(jié)合單次獎(jiǎng)勵(lì)量計(jì)算出當(dāng)次實(shí)驗(yàn)的合適session400-966-9516lrwd400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司7.嗅覺研究數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)范式的訓(xùn)練和測(cè)試,不同階段的數(shù)據(jù)形式略有不同,但核心參數(shù)始終一致,例如Hit、Miss、Falsechoice、correctrejection,用于判斷小鼠學(xué)習(xí)行為的達(dá)標(biāo)程度,7.1數(shù)據(jù)采集量,實(shí)時(shí)計(jì)算小鼠舔水行為表現(xiàn)值,以Hit、Miss、Falsechoicecorrectrejection的次數(shù)和百分比兩種形式體現(xiàn),并計(jì)算給出performancecorrectRat(正確表現(xiàn)比率)。同時(shí),在訓(xùn)練詳情界面的下方會(huì)實(shí)時(shí)顯示系統(tǒng)氣路狀態(tài),方便實(shí)驗(yàn)人員獲取氣味釋放信息。如下圖所示:深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司在嗅覺行為訓(xùn)練過程中軟件已實(shí)時(shí)采集統(tǒng)計(jì)各項(xiàng)結(jié)果參數(shù),在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,Results和Events數(shù)據(jù)以.csv格式文件進(jìn)行存儲(chǔ)。Results.csv文件統(tǒng)計(jì)給出了嗅覺行為訓(xùn)練的關(guān)鍵結(jié)果參數(shù),包括Hit、Miss、Falsechoice、correctrejection的次數(shù)和百分比兩種形式,以及performancorrectRate(正確表現(xiàn)比率)。如我們?cè)谛嵊X行為訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)方法提到的,以小鼠在拒絕行為的綜合正確表現(xiàn)比率達(dá)到85%為評(píng)估指標(biāo),performancecorrectRate85%,小鼠訓(xùn)練達(dá)標(biāo)視為學(xué)會(huì)了氣味區(qū)分,performancecorrectRate<85%,小Events.csv數(shù)據(jù)文件以時(shí)間軸線記錄了該實(shí)驗(yàn)程序全過程事件,相當(dāng)于原始數(shù)據(jù),可抓取數(shù)據(jù)用第三方軟件進(jìn)一步作圖分析。但通常而言,在Results.csv文件給出的關(guān)鍵結(jié)果參數(shù)已能滿足嗅覺行為訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)作圖需求。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司8.光纖記錄數(shù)據(jù)分析光纖記錄的原始數(shù)據(jù)包含時(shí)間軸、不同通道對(duì)應(yīng)的熒光值、事件標(biāo)記信息。通過分析相對(duì)于初始基線熒光(F)的熒光變化()并觀察與鈣瞬變相對(duì)應(yīng)反應(yīng)。考慮到GcaMP只有在與鈣離子結(jié)合時(shí)才會(huì)引發(fā)熒光增強(qiáng),和jrGECO1a,同時(shí)使用獨(dú)特的410nmLED來獲取對(duì)照信號(hào)并排除噪聲。數(shù)據(jù)分析可以使用不同的軟件進(jìn)行,如MATLAB、python或您選擇的其他分析8.1數(shù)據(jù)預(yù)處理400-966-9516lR821三色光纖記錄系統(tǒng)軟件集信號(hào)采集與數(shù)據(jù)分析于一體,在數(shù)據(jù)分析中,數(shù)據(jù)預(yù)處理過程包含平滑處理,基線矯正,運(yùn)動(dòng)矯正等功能正多數(shù)針對(duì)的是熒光信號(hào)因長(zhǎng)時(shí)間記錄導(dǎo)致漂白信號(hào)逐步下降,或者光纖的自發(fā)熒光在長(zhǎng)期記錄下逐步被漂白、基線逐步下降等情況。此情形的數(shù)據(jù)因?yàn)檎w呈勢(shì),不利于后續(xù)數(shù)據(jù)作圖分析,所以需要進(jìn)行基線矯正。運(yùn)動(dòng)矯正采用410nm對(duì)照通道的數(shù)據(jù),410nm數(shù)據(jù)可以用于反應(yīng)背景噪音信號(hào),運(yùn)動(dòng)矯正即將410nm數(shù)據(jù)與470nm數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,通過算法從470nm數(shù)據(jù)中去除410nm數(shù)據(jù)的波動(dòng),得到真實(shí)的熒光數(shù)據(jù)。8.2分析作圖將熒光數(shù)據(jù)與動(dòng)物行為數(shù)據(jù)同步對(duì)比,選擇事件標(biāo)記或者增加事件標(biāo)記,對(duì)事件相關(guān)信號(hào)分析作圖。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司事件分析8.3組間對(duì)比將不同組的數(shù)據(jù)進(jìn)行組間對(duì)比,即可分析不同處理因素下熒光數(shù)據(jù)的差異。此外,還可結(jié)合行為學(xué)視頻同步分析動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)軌跡。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司通過以上步驟,原始的熒光數(shù)據(jù)就可以直接出圖。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司第三章光纖記錄與嗅覺研究應(yīng)用在本章中,我們將簡(jiǎn)單介紹一下光纖記錄系統(tǒng)和嗅覺行為訓(xùn)練系統(tǒng),并展示一些真實(shí)的實(shí)驗(yàn)示例,這些示例將有助于啟發(fā)您的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。410nm可以用來反射背景噪聲信號(hào),從而確保獲得真實(shí)的熒光數(shù)據(jù)。R821三色多通道光纖記錄系統(tǒng)有三個(gè)激發(fā)光源(410nm、470nm和560nm)。該系統(tǒng)可以記錄綠色熒光指示劑如GcaMP和dlight或神經(jīng)遞質(zhì)探針的信號(hào),以及紅色熒光指示劑如RcaMP、jrGECO1a或神經(jīng)遞質(zhì)探針的信號(hào)。瑞沃德嗅覺行為訓(xùn)練系統(tǒng)有16氣瓶常規(guī)款(OM-16)、8氣瓶常規(guī)款(OM-8)、16氣瓶電生理兼容款(OM-16E)可供選擇,可用于小鼠學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練,基于嗅覺刺激關(guān)聯(lián)飲水獎(jiǎng)勵(lì)反饋,建立認(rèn)知學(xué)習(xí)范式,幫助用戶快速開展記憶認(rèn)知相關(guān)實(shí)嗅覺行為訓(xùn)練系統(tǒng)支持多只動(dòng)物進(jìn)行多種氣味訓(xùn)練,包氣味控制、信號(hào)傳輸、行為相機(jī)、隔音箱、桌面軟件等模塊,可拓展與光遺傳、光纖記錄、電生理等第三方設(shè)備聯(lián)用。配有專用軟件操控系統(tǒng)運(yùn)行,精確控制氣味釋放,新程序。400-966-9516l嗅覺行為訓(xùn)練系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)氣味刺激、嗅覺分辨、認(rèn)知訓(xùn)練等實(shí)驗(yàn)任務(wù),助力開展嗅覺功能、學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等機(jī)制的研究,大大提瑞沃德嗅覺行為訓(xùn)練系統(tǒng)3.光纖記錄與嗅覺研究應(yīng)用案例5.嗅覺行為訓(xùn)練系統(tǒng)應(yīng)用案例1.光纖記錄系統(tǒng)主要功能特點(diǎn)1.1軟件功能強(qiáng)大1.1.1一鍵出圖熒光熱圖、曲線圖、動(dòng)物軌跡圖等,支持一鍵分析出圖,省時(shí)省力。1.1.2一體化采集多種事件打標(biāo)方式,包括:①外部信號(hào)輸入自動(dòng)標(biāo)記實(shí)時(shí)顯示,自由修改顏色;②手動(dòng)標(biāo)記實(shí)時(shí)顯示,自由修改事件名稱、顏色及快捷鍵;③行為學(xué)Rol標(biāo)記實(shí)時(shí)顯示,自由修改事件名稱及顏色等,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求自由選擇。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lRol事件輸出,實(shí)現(xiàn)閉環(huán)研究;②熒光信號(hào)實(shí)時(shí)輸出:采集數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)傳輸至MATLAB,實(shí)時(shí)分析及閉環(huán)調(diào)控,進(jìn)行個(gè)性化1.1.3全方位數(shù)據(jù)分析據(jù)處理功能。2)多維度結(jié)果輸出。可輸出deltaF/F、Z-score、peak統(tǒng)計(jì)、組間對(duì)比、事件步播放,行為學(xué)視頻可逐幀查看及處理。1.2系統(tǒng)集成高效1.2.1高集成化析,無需分開使用。兼容光遺傳。內(nèi)置光遺傳接口,實(shí)現(xiàn)同位點(diǎn)刺激和記錄。1.2.2強(qiáng)拓展性深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司1.3性能穩(wěn)定1.3.1超100小時(shí)穩(wěn)定采集1)高穩(wěn)定LED光源OLED激發(fā)光源功率穩(wěn)定,8小時(shí)連續(xù)輸出功率不穩(wěn)定度小于0.5%;壽命>10000小時(shí),為穩(wěn)定采集保駕護(hù)航。2)低丟幀率相機(jī)。采集丟幀率低,小于0.02%,保證數(shù)據(jù)信號(hào)的真實(shí)性。3)獨(dú)特軟件控制系統(tǒng)。獨(dú)特的數(shù)據(jù)采集控制及存儲(chǔ)算法,保障了系統(tǒng)不卡頓、1.4采集靈敏擾,獲得準(zhǔn)確信號(hào)。弱信號(hào)檢測(cè)需求;250FPS高幀率,滿足微弱且快速變化的信號(hào)需求。深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司干擾,信號(hào)采集更精準(zhǔn)。2.嗅覺行為訓(xùn)練系統(tǒng)主要功能特點(diǎn)2.1高通量單個(gè)電腦工作站可控制8通道箱體,實(shí)現(xiàn)8只小鼠同步訓(xùn)練。2.2高靈敏度氣味切換迅速毫秒級(jí)別響應(yīng),舔水傳感模塊靈敏精準(zhǔn)計(jì)數(shù)。2.3一體化氣味刺激模塊與舔水獎(jiǎng)勵(lì)模塊關(guān)聯(lián),一體化實(shí)現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練。2.4自動(dòng)化2.5強(qiáng)兼容性2.6視頻監(jiān)控3.光纖記錄與嗅覺研究應(yīng)用案例由于光纖記錄實(shí)驗(yàn)的高效簡(jiǎn)便,從該技術(shù)發(fā)明以來,已有近千篇文章發(fā)表;近年來嗅覺方向的研究也漸漸為研究人員所關(guān)注,嗅覺行為訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)中結(jié)合光纖記錄系統(tǒng)深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l對(duì)鈣信號(hào)進(jìn)行記錄,分析神經(jīng)元信號(hào)的變化,已成為研究人員探究嗅覺功能及認(rèn)知活動(dòng)中的重要技術(shù)手段。下面為大家舉例光纖記錄與嗅覺研究應(yīng)用的幾個(gè)案例,幫助大3.1外側(cè)內(nèi)嗅皮層直接編碼獎(jiǎng)賞關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí)記憶越來越多的證據(jù)表明紋狀體多巴胺與獎(jiǎng)賞關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí)密切相關(guān),研究也發(fā)現(xiàn)內(nèi)嗅皮層-海馬通路是編碼關(guān)聯(lián)學(xué)習(xí)的關(guān)鍵環(huán)路。內(nèi)側(cè)內(nèi)嗅 (LEC)在編碼記憶信息上的差異也廣泛被研究人員關(guān)注,外側(cè)內(nèi)嗅皮層在編碼與物體氣味,形狀等特征信息相關(guān)的記憶時(shí),與多巴胺獎(jiǎng)賞信號(hào)的神經(jīng)環(huán)路連接尚未闡光纖記錄系統(tǒng)、單細(xì)胞電生理記錄等技術(shù)手段,發(fā)現(xiàn)外側(cè)內(nèi)嗅皮層海馬通路是編碼獎(jiǎng)賞相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵環(huán)路,這一過程依賴于多巴胺和扇形細(xì)胞。研究團(tuán)隊(duì)利用正確的次數(shù)在80%以上,就認(rèn)為小鼠成功獲得習(xí)得性關(guān)聯(lián)記憶。400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司LEC扇形細(xì)胞在獎(jiǎng)賞關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí)中起關(guān)鍵作用深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司參考文獻(xiàn):Natur2021,598(7880),321-326.3.2眶額皮層-紋狀體回路中細(xì)胞類型特異性影響強(qiáng)迫癥認(rèn)知僵化許多精神疾病表現(xiàn)出認(rèn)知僵化性功能障礙,無法靈活調(diào)整行為以適應(yīng)不斷變化的環(huán)境的要求,這是強(qiáng)迫癥(OCD)的主要癥狀,通常表現(xiàn)為逆轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)受損。在強(qiáng)迫癥的研究中,已經(jīng)知道眼眶額葉皮層(OFC)轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)缺陷有關(guān)。首都醫(yī)科大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)利用經(jīng)典的氣味刺激關(guān)聯(lián)舔水獎(jiǎng)勵(lì)實(shí)驗(yàn)范式設(shè)計(jì)了逆轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)任務(wù),同時(shí)聯(lián)用光遺傳學(xué)及光纖記錄系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)眶額皮層活動(dòng)是正常逆轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)和細(xì)胞類型特異性功能障礙的基礎(chǔ)。當(dāng)發(fā)生細(xì)胞類型特異性功能性增加減少,這導(dǎo)致對(duì)OFC興奮性神經(jīng)元的抑制不足,進(jìn)而影響對(duì)獎(jiǎng)勵(lì)與非獎(jiǎng)勵(lì)線索的響應(yīng)偏好,最終導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)變慢。該研究結(jié)果為探究強(qiáng)迫癥認(rèn)知僵化的潛在治400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司參考文獻(xiàn):yang,z.;wu,G.;Liu,M.;sun,x.;xu,Q.;zhang,c.,etal.DysfunctionofMouseModelofobsessive-compulsiveDisorder.currBiol2021,31(2),381-393e4.400-966-9516l4.光纖記錄應(yīng)用案例為大家舉例光纖記錄應(yīng)用案例,幫助大家更好地了解光纖記錄在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用,本案例使用瑞沃德多通道光纖記錄系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)采集及分析工作。4.1記憶下丘腦環(huán)路調(diào)控海馬神經(jīng)發(fā)生促進(jìn)記憶提取對(duì)抗焦慮樣行為生、成熟并整合到現(xiàn)有環(huán)路中,并且這個(gè)過程由神經(jīng)環(huán)路的活動(dòng)進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。然Li等人聚焦于SUM-DG環(huán)路修飾的ABN發(fā)育的不同階段,通過光纖記錄、光遺傳、化學(xué)遺傳、膜片鉗和譜系示蹤等方法,揭示了SUM-DG環(huán)路修飾成年海馬新生神經(jīng)元,促進(jìn)記憶提取和對(duì)抗焦慮。在該研究中,Li等人使用光纖記錄方法檢測(cè)SUM-DG神經(jīng)元投射的活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在豐富環(huán)境(EE)中,小鼠SUM神經(jīng)元活性顯著增加,并且SUM消融后,EE誘導(dǎo)的神經(jīng)反應(yīng)和ABN介導(dǎo)的行為改善被消除,提示SUM-DG環(huán)路修飾的ABN能深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司參考文獻(xiàn):Liya-Dong,Luoyan-Jia,chenze-kaetal.Hypothalamicmodulationofadultmemoryandanxiety-likebehavior.[J].NatNeurosci,2022,25:630-645.5.嗅覺行為訓(xùn)練系統(tǒng)應(yīng)用案例在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中,嗅覺作為驅(qū)動(dòng)認(rèn)知行為的重要感覺模式,在嗅覺辨別、學(xué)習(xí)記憶、決策、沖動(dòng)等認(rèn)知行為中發(fā)揮重要作用。臨床研究也發(fā)現(xiàn),許多腦部病變的發(fā)生都伴隨著嗅覺障礙,例如頭部外傷、丘腦或前額葉皮質(zhì)病變、顱內(nèi)壓增高等病變,等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中也存在嗅覺障礙?;谛嵊X刺激的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)在相關(guān)研究中應(yīng)用廣泛,推動(dòng)了認(rèn)知及神經(jīng)系統(tǒng)疾病機(jī)制的研究進(jìn)展。下面將為大家舉例嗅覺行為訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)應(yīng)用案例,幫助大家更好地了解嗅覺行為訓(xùn)練系統(tǒng)在神經(jīng)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用。5.1延遲期間的內(nèi)側(cè)前額葉活動(dòng)有助于學(xué)習(xí)工作記憶任務(wù)工作記憶(WM)是認(rèn)知過程的重要部分,涉及一段短暫的記憶保留期,稱為延遲期。多項(xiàng)研究表明在延遲期內(nèi)側(cè)前額葉皮層(mpFC)活性升高,一篇發(fā)表在science上的研究進(jìn)一步揭示了其在工作記憶任務(wù)中的功能作用。研究人員利用氣味果發(fā)現(xiàn)嗅覺行為學(xué)習(xí)表現(xiàn)在學(xué)習(xí)階段會(huì)受到損害,但在小鼠接受良好訓(xùn)練后則不會(huì)。研究人員訓(xùn)練小鼠在氣味移除的短暫時(shí)間內(nèi)記住該氣味,在此延遲期間光遺傳學(xué)操縱小鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮層中的神經(jīng)細(xì)胞活動(dòng)會(huì)干擾小鼠在延遲期后聞到相同或不同氣味時(shí)的舔水行為表現(xiàn)。一旦小鼠成功學(xué)會(huì)DNMS任務(wù),光遺傳操縱就不會(huì)影響隨后的舔深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lmpFC)神經(jīng)元活動(dòng)對(duì)于學(xué)習(xí)工作記憶任務(wù)期間的400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司抑制延遲期mpFC活動(dòng)損害了工作記憶任務(wù)學(xué)習(xí)的表現(xiàn)參考文獻(xiàn):深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516lrwd@rwdls.comI深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司第四章光纖記錄應(yīng)用至嗅覺研究實(shí)驗(yàn)設(shè)備及耗材瑞沃德在進(jìn)行光纖記錄應(yīng)用至嗅覺研究實(shí)驗(yàn)的整體解決方案如下圖所示,包括麻1.麻醉定位3.結(jié)合嗅覺行為實(shí)驗(yàn)進(jìn)行熒光信號(hào)采集4.切片染色1.麻醉定位在給動(dòng)物做手術(shù)時(shí),動(dòng)物需要保持持續(xù)麻醉狀態(tài),且此時(shí)動(dòng)物頭部也處于固定狀態(tài)。所用設(shè)備:腦立體定位儀、麻醉機(jī)、呼吸機(jī)、數(shù)碼顯微鏡或雙目體視鏡、體溫維2.病毒注射、插針埋植及頭桿固定動(dòng)物固定及調(diào)平后,首先要定位到研究的目標(biāo)腦區(qū)位點(diǎn)并進(jìn)行開顱手術(shù),然后根深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司400-966-9516l據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),吸取對(duì)應(yīng)的熒光蛋白病毒并注射到目標(biāo)位點(diǎn)中,最后在相同位點(diǎn)植入陶瓷插針并通過牙托水泥固定。所用設(shè)備及耗材:

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