重組克隆的單元操作

關(guān)于重組克隆的單元操作本章節(jié)內(nèi)容DNA重組的載體(裝載DNA的工具）DNA的體外重組（切、連）重組DNA分子的轉(zhuǎn)化與擴增（轉(zhuǎn)、增）轉(zhuǎn)化子的篩選與重組子的鑒定（檢測）目的基因的克隆（供體中的目標(biāo)DNA的克?。┑?頁,共145頁，星期六，2024年，5月第一節(jié)DNA重組的載體質(zhì)粒載體λ雙鏈?zhǔn)删wDNA載體M13單鏈?zhǔn)删wDNA載體噬菌體-質(zhì)粒雜合載體第3頁,共145頁，星期六，2024年，5月載體的功能為外源基因提供進入受體細胞的轉(zhuǎn)移能力為外源基因提供在受體細胞中的復(fù)制、擴增或整合能力（指DNA拷貝數(shù)的增加）（所有載體必須具備的能力）為外源基因提供在受體細胞中的表達能力（指基因的表達，使外源基因通過mRNA和蛋白質(zhì)在受體細胞中發(fā)揮功能，進而可發(fā)現(xiàn)基因在生物體內(nèi)發(fā)揮的作用）。第4頁,共145頁，星期六，2024年，5月載體必須具備的三個條件具有復(fù)制原點或整合位點，能使外源基因在受體細胞中穩(wěn)定遺傳。既有多種單一的核酸內(nèi)切酶的識別切割位點（多克隆位點，multi-clonesite,MCS)。具有合適的選擇性標(biāo)記，便于重組DNA分子的檢測。第5頁,共145頁，星期六，2024年，5月一、質(zhì)粒載體（一）質(zhì)粒的基本性質(zhì)存在于細菌或真菌的細胞質(zhì)粒是染色體外穩(wěn)定遺傳的復(fù)制體，其特點共價、閉環(huán)，雙鏈DNA分子（covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)。大多數(shù)質(zhì)粒具有復(fù)制原點，能獨立進行復(fù)制，不依賴寄主的細胞復(fù)制周期質(zhì)粒第6頁,共145頁，星期六，2024年，5月（一）質(zhì)粒的基本性質(zhì)質(zhì)粒通常賦予寄主一些表型特征，如抗生素抗性等。選擇性標(biāo)記(selectablemarker):由于質(zhì)粒攜帶的基因，可供實驗室條件下進行選擇的一些標(biāo)記。如抗性，營養(yǎng)元素的利用等。顯性質(zhì)粒與隱性質(zhì)粒.一、質(zhì)粒載體第7頁,共145頁，星期六，2024年，5月（一）質(zhì)粒的基本性質(zhì)1、質(zhì)粒的自主復(fù)制性：含有Ori或replicon質(zhì)粒在特定的宿主細胞中維持恒定的拷貝數(shù)。A、反義RNA進行調(diào)控的機制B、關(guān)鍵蛋白與重復(fù)區(qū)域結(jié)合進行調(diào)控的機理一、質(zhì)粒載體第8頁,共145頁，星期六，2024年，5月A、反義RNA進行調(diào)控的機制（plasmidColE1）RopdimerPRNAIIRNAIIa、在復(fù)制起點處，RNAII（長555個堿基）與質(zhì)粒DNA形成RNA-DNA復(fù)合物，RNA酶H可降解RNAII，露出3’自由羥基，質(zhì)粒復(fù)制起始。在該區(qū)域還能反向轉(zhuǎn)錄形成RNAI，I和II為互補的RNA。第9頁,共145頁，星期六，2024年，5月B、如果RNAI和RNAII形成雙鏈RNA螺旋，RNA酶H不能降解RNAII，復(fù)制不能進行。RopdimerPRNAIIRNAII第10頁,共145頁，星期六，2024年，5月c、當(dāng)質(zhì)粒的濃度比較高的時，Rop蛋白促進RNAI和RNAII形成雙鏈RNA螺旋，使質(zhì)粒的復(fù)制不能起始。d、當(dāng)質(zhì)粒的比較低時，RNAII與質(zhì)粒DNA形成RNA-DNA復(fù)合物，RNA酶H降解RNAII質(zhì)粒復(fù)制起始。e、突變RNAI或去除Rop基因?qū)е沦|(zhì)粒的拷貝數(shù)增加。第11頁,共145頁，星期六，2024年，5月B、關(guān)鍵蛋白與重復(fù)區(qū)域結(jié)合進行調(diào)控的機理（pS101質(zhì)粒）a)

復(fù)制原點區(qū)域含有3～7拷貝的長度為17～22bp的重復(fù)區(qū)域，R1、R2、R3等。第12頁,共145頁，星期六，2024年，5月B、關(guān)鍵蛋白與重復(fù)區(qū)域結(jié)合進行調(diào)控的機理

b)復(fù)制原點附近有一個編碼基因repA,編碼RepA蛋白。RepA是雙功能的蛋白：與復(fù)制原點區(qū)域的重復(fù)序列結(jié)合，起始DNA的合成；與自身基因的啟動子結(jié)合，抑制自身的轉(zhuǎn)錄。第13頁,共145頁，星期六，2024年，5月質(zhì)?？截悢?shù)由RepA蛋白濃度和質(zhì)粒自身的濃度進行調(diào)節(jié)。

如果質(zhì)粒拷貝數(shù)高，RepA蛋白與自身的啟動子區(qū)域結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄，RepA蛋白合成受阻，DNA的復(fù)制受到抑制。RepA蛋白通過結(jié)合到兩個質(zhì)粒的重復(fù)序列把它們連接起來，避免復(fù)制起始。細胞分裂后，拷貝數(shù)和RepA蛋白的濃度降低，RepA蛋白自身合成增加，結(jié)合到重復(fù)區(qū)域起始DNA的合成。B、關(guān)鍵蛋白與重復(fù)區(qū)域結(jié)合進行調(diào)控的機理

第14頁,共145頁，星期六，2024年，5月問題：在寄主復(fù)制后，質(zhì)粒是如何分配到子細胞中？

Par原件會附著在細胞膜上，隨著細胞的分裂，質(zhì)粒正確分配到子細胞中，維持相對穩(wěn)定的質(zhì)?？截悢?shù)。第15頁,共145頁，星期六，2024年，5月（一）質(zhì)粒的基本性質(zhì)2、質(zhì)粒的可擴增性（質(zhì)粒的拷貝數(shù)）拷貝數(shù)：細胞中質(zhì)粒的數(shù)量（摩爾數(shù)）與染色體DNA數(shù)量之比

嚴(yán)謹型:少數(shù)拷貝存在于細胞中（1~幾個）

松弛型:多個拷貝存在于細胞中（≥10）嚴(yán)謹型與松弛型是相對的。第16頁,共145頁，星期六，2024年，5月（一）質(zhì)粒的基本性質(zhì)3、不相容性在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象，稱為質(zhì)粒的不相容性，或稱為不親和性（Plasmidincom-patibility)。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒第17頁,共145頁，星期六，2024年，5月（一）質(zhì)粒的基本性質(zhì)引起質(zhì)粒的不相容的機理

A具有相同的復(fù)制調(diào)控機制

B控制質(zhì)粒分配的par元件相同,也會引起質(zhì)粒的不相容不相容群：指那些具有不相容性的質(zhì)粒組成的一個群體，一般具有相同的復(fù)制子ColE1/pMB1第18頁,共145頁，星期六，2024年，5月（一）質(zhì)粒的基本性質(zhì)4、質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性（p13)第19頁,共145頁，星期六，2024年，5月（二）、質(zhì)粒的改造和構(gòu)建天然的野生質(zhì)粒一般不能直接用作克隆載體，需要改造1、刪除不必要的DNA序列，縮小質(zhì)粒相對分子量，提高外源DNA片段的裝載量。2、滅活一些質(zhì)粒的基因（如可轉(zhuǎn)移基因），保證重組實驗的安全；滅活質(zhì)粒拷貝數(shù)的負控制基因，提高質(zhì)粒的拷貝數(shù)。3、加入選擇性標(biāo)記，便于重組子的檢測4、加入多克隆位點，便于外源基因的插入5、根據(jù)克隆的目的，加裝特殊的表達元件或便于蛋白純化的元件（GST標(biāo)簽）第20頁,共145頁，星期六，2024年，5月R7268ApRR1drd19ApRCmRSmRSuRKmRpMB3ApRpSF2124ApRpBR312ApRTcRpSC101TcR12pM88pMB9TcR34ColE1566pBR313ApRTcRpBR322ApRTcR78pMB1(b)例:第一個人工構(gòu)建的遺傳載體pBR322第21頁,共145頁，星期六，2024年，5月（三）、質(zhì)粒的分類及用途1、克隆質(zhì)粒：能在宿主細胞中高拷貝存在（含有氯霉素可擴增的松弛型復(fù)制子或解除了對質(zhì)?？截悢?shù)的負控制作用）。2、測序質(zhì)粒:能高拷貝復(fù)制，含有MCS，含有通用的引物序列（如SP6，T7），能形成單鏈模板，便于測序反應(yīng)的進行。3、整合質(zhì)粒：含有整合酶編碼基因以及整合特異性位點序列，克隆在這種質(zhì)粒上的外援基因進入受體細胞后，能準(zhǔn)確重新整合在染色體DNA的特點位點上（如動物植物細胞中用于目的基因敲除的載體，見第五章、第六章）。第22頁,共145頁，星期六，2024年，5月第23頁,共145頁，星期六，2024年，5月（三）、質(zhì)粒的分類及用途4、穿梭載體（shuttlevector）質(zhì)粒分子上含有兩個親緣關(guān)系不同的復(fù)制子以及相應(yīng)的選擇性標(biāo)記，能在兩種不同的受體細胞中復(fù)制并檢測。如大腸桿菌-酵母穿梭質(zhì)粒。特點：克隆在這類載體上的外源基因不需要更換載體直接從一種受體菌轉(zhuǎn)入另一種受體菌復(fù)制并且遺傳。第24頁,共145頁，星期六，2024年，5月三、質(zhì)粒的分類及用途5、探針質(zhì)粒：用來篩選克隆基因的表達調(diào)控元件。通常含有報告基因，但缺少相應(yīng)的調(diào)控序列（如啟動子或終止子），只有含有啟動子或終止子的調(diào)控序列被克隆進入載體后，報告基因才能別表達，表達量的大小直接反應(yīng)了克隆進入的調(diào)控元件的強弱。第25頁,共145頁，星期六，2024年，5月無啟動子序列報告基因第26頁,共145頁，星期六，2024年，5月（三）、質(zhì)粒的分類及用途6、表達質(zhì)粒在多克隆位點的上下游分別裝有兩套轉(zhuǎn)錄效率較高的啟動子、合適的核糖體結(jié)合位點序列（SD）序列以及強有力的終止子結(jié)構(gòu)，使得克隆在合適位點上的任何外源基因均能在受體細胞中高效表達。如pET載體。常用的載體見表格2-1（p16)第27頁,共145頁，星期六，2024年，5月MCS復(fù)制原點選擇標(biāo)記高效啟動子終止子序列核糖體結(jié)合位點第28頁,共145頁，星期六，2024年，5月pGEM載體—克隆DNA的體外轉(zhuǎn)錄加入了兩個短片段，這兩個片段在限制性酶切位點的兩側(cè)，可被T7噬菌體的RNA聚合酶或SP6T7噬菌體的RNA聚合酶的識別方便了克隆DNA的體外轉(zhuǎn)錄，便于研究RNA加工，合成蛋白質(zhì)等的研究等6、表達質(zhì)粒第29頁,共145頁，星期六，2024年，5月pGEM-3Z多拷貝裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標(biāo)記lacZ’裝有兩個噬菌體的強啟動子用于外源基因的高效表達注意：T7和SP6啟動子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶所識別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達噬菌體RNA聚合酶，如E.coliBL21（DE3）等AproripGEM-3Z2743bplacZ’PT7MCSPSP6第30頁,共145頁，星期六，2024年，5月（四）、質(zhì)粒DNA的制備1基于分子大小的分離2基于構(gòu)象的分離質(zhì)粒有三種構(gòu)型cccDNA(共價閉環(huán)DNA)：DNA的兩條鏈都是完整的。ocDNA(開環(huán)DNA)：只有一條鏈?zhǔn)峭暾摹＞€性DNA：DNA的兩條鏈均被打開。多種細菌中存在線性的質(zhì)粒DNA。但末端或是通過重復(fù)序列形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)或通過共價結(jié)合蛋白進行保護，避免核酸酶的降解。第31頁,共145頁，星期六，2024年，5月超螺旋DNA松弛cccDNA開環(huán)DNA核酸內(nèi)切酶DNA連接酶核酸內(nèi)切酶DNA促旋酶拓撲異構(gòu)酶第32頁,共145頁，星期六，2024年，5月堿變性用CsCl-EB等密度離心UpperbandcontainingchromosomalDNAandopenplasmidcirclesLowerbandofcovalentlyclosedcirclesplasmidDNAEthidiumbromide(EB)電泳方向cccDNAL-DNAOC-DNACKRZ第33頁,共145頁，星期六，2024年，5月總結(jié)質(zhì)粒載體1、質(zhì)粒載體的基本性質(zhì)：自我復(fù)制能力、拷貝數(shù)的控制、嚴(yán)謹型和松弛型質(zhì)粒、質(zhì)粒的不相容性及機理2、質(zhì)粒載體具備的特點3、質(zhì)粒載體的分類：克隆載體、測序載體、穿梭載體、表達載體和探針載體等的特點第34頁,共145頁，星期六，2024年，5月（一）、噬菌體的生物學(xué)特征λ噬菌體顆粒中的DNA是一線性雙鏈DNA分子，長48502bp?；虼丶帕芯€λ噬菌體上有些基因可被取代而不影響其生活周期線性λ噬菌體兩端各有12個堿基的5’凸出黏性末端是互補的,該互補序列相互作用形成cos位點。

作用：進入細胞的λDNA通過兩端的黏性末端環(huán)化。

二、λ雙鏈?zhǔn)删wDNA載體第35頁,共145頁，星期六，2024年，5月第36頁,共145頁，星期六，2024年，5月第37頁,共145頁，星期六，2024年，5月第38頁,共145頁，星期六，2024年，5月1、對野生λ噬菌體的改進

A、刪除多余的限制性內(nèi)切酶的位點。

B、切除一些非必需序列，增加載體的容量。

C、設(shè)計陽性選擇重組子的方法。

D、發(fā)展可以使插入的真核cDNA與β－半乳糖苷酶形成融合蛋白的載體。

（二）、基于λ噬菌體的克隆載體第39頁,共145頁，星期六，2024年，5月2、λ噬菌體基因組可刪除的部分不影響生存能力λ噬菌體基因組中可以刪除的序列與噬菌體進入從裂解狀態(tài)進入溶源狀態(tài)以及從溶源狀態(tài)進入裂解狀態(tài)有關(guān)，即與噬菌體整合和脫離大腸桿菌的染色體相關(guān)刪除了這部分序列的噬菌體只能進行裂解循環(huán)（二）、基于λ噬菌體的克隆載體第40頁,共145頁，星期六，2024年，5月3、重組噬菌體的鑒別（1）lacZ′基因功能選擇方法類似于質(zhì)粒中的藍白斑篩選（2）cI基因功能選擇法cI插入失活的噬菌斑是“清澈”的，而野生型正常的噬菌斑是“渾濁”的渾濁清亮第41頁,共145頁，星期六，2024年，5月3、重組噬菌體的鑒別（3）Spi-（sensitivetoP2inhibition）正選擇

A野生型λ噬菌體，不能在P2噬菌體溶源性細菌中生長，為Spi+，即對在P2噬菌體的抑制呈敏感反應(yīng)。Bλ噬菌體載體中的red和gam區(qū)段被外源片段取代后，λ噬菌體就能在P2噬菌體溶源性細菌中生長。第42頁,共145頁，星期六，2024年，5月3、重組噬菌體的鑒別（4）、基于λ基因組大小的篩選包裝體系只能將大小37~52Kb的DNA分子插入到噬菌體的頭部結(jié)構(gòu)中插入型載體通常刪除了噬菌體的中非必須的基因部分，因此中有重組后介于37~52Kb的分子才能被包裝。第43頁,共145頁，星期六，2024年，5月（左右臂連接）（三段自身連接）（插入片段）第44頁,共145頁，星期六，2024年，5月根據(jù)噬菌斑的透明度或顏色來進行重組子的篩選第45頁,共145頁，星期六，2024年，5月插入型載體：只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點。失去了非必需區(qū)切點又位于報告基因上，故在切開DNA并插入外源基因后，報告基因失活，即可依此進行重組體的篩選可插入長度為10kb的外源DNA

（三）、λ噬菌體載體分類第46頁,共145頁，星期六，2024年，5月兩種報告基因的插入型載體cI基因內(nèi)保留HindIII和EcoRI單酶切位點，當(dāng)有外源DNA在這酶切位點插入時，使cI基因失活，感染hfⅠ-大腸桿菌后可形成空斑（如λgt10）。在噬菌體DNA插入的lacZ基因末端設(shè)有單一的EcoRⅠ酶切位點。在此處插入外源基因，可表達β-半乳糖苷酶的融合蛋白，利用特異性抗體或DNA測序方法可篩選重組DNA。這類載體適宜構(gòu)建cDNA文庫(如λZAPII)（三）、λ噬菌體載體分類第47頁,共145頁，星期六，2024年，5月

cIEcoRI

LA32.7RA10.6λgt10

lacZLA19.9RA21.9EcoRICharon16A第48頁,共145頁，星期六，2024年，5月取代型載體：具有成對的克隆位點，在這兩個位點之間的λDNA區(qū)段可以被外源插入的DNA所取代。可克隆的片段大，最大可達25kb，而質(zhì)粒最大僅10kb左右；λDNA的長度介于野生型λ噬菌體DNA長度的75％而不超過其105％時，才能被包裝成噬菌體顆粒，當(dāng)DNA的長度短于野生型的75%或超過105%時，噬菌體的活性就急劇下降，因此要求λ載體DNA和外源DNA長度之和在39～53kb之間。（三）、λ噬菌體載體分類第49頁,共145頁，星期六，2024年，5月LacZ

EcoRIEcoRIEcoRIBanHISalISalIBamHIEcoRI

MCSMCSCharon4AEMBL3/4Charon40第50頁,共145頁，星期六，2024年，5月（四）λ克隆載體的體外包裝

（補充知識）體外包裝：模擬λ噬菌體DNA分子在宿主細胞內(nèi)發(fā)生的包裝過程，將重組的λ噬菌體DNA分子包裝成成熟的具有感染能力的λ噬菌體顆粒必要性：

λ噬菌體重組分子直接感染大腸桿菌的效率較低，而在試驗過程中，因內(nèi)切酶的處理，DNA的連接產(chǎn)生的有效分子等原因，使得轉(zhuǎn)染效率更低第51頁,共145頁，星期六，2024年，5月（四）λ克隆載體的體外包裝第52頁,共145頁，星期六，2024年，5月（四）λ克隆載體的體外包裝單菌株體系缺陷型λ噬菌體在cos位點有突變，λ噬菌體的DNA復(fù)制不能完成，但可形成外殼蛋白，可以制備包裝所必須的各種外殼蛋白。第53頁,共145頁，星期六，2024年，5月（四）λ克隆載體的體外包裝雙菌株的體外包裝原理Aλ噬菌體的頭部和尾部的包裝是分開進行B頭部基因發(fā)生突變的噬菌體只能形成尾部C尾部基因發(fā)生突變的噬菌體只能形成頭部D兩種不同突變的噬菌體混合起來，能在體外裝備形成有活性的噬菌體顆粒第54頁,共145頁，星期六，2024年，5月Lyse,mixAddATPandconcatemerizedλDNAMaturephageparticles第55頁,共145頁，星期六，2024年，5月（五）λ-DNA分離與純化1、含有乳糖和MgCl2的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌2、加入合適滴度的重組λ噬菌體懸浮液3、用LB繼續(xù)培養(yǎng)，至溶液從渾濁變?yōu)榍辶?、加入固體NaCl和PEG8000,離心獲得噬菌體顆粒5、蛋白酶K處理噬菌體懸浮液，去除蛋白質(zhì)6、乙醇或異丙醇沉淀λ噬菌體DNA第56頁,共145頁，星期六，2024年，5月總結(jié)有關(guān)λ噬菌體改造的載體λ噬菌體的生物學(xué)特點改造野生型λ噬菌體稱為載體需要去除和加入的功能元件有哪些？λ噬菌體重組體的篩選有哪些方法？λ噬菌體載體的類型和特點。第57頁,共145頁，星期六，2024年，5月三、M13單鏈?zhǔn)删wDNA載體（一）M13噬菌體一般特點僅6407個核苷酸，10個基因有雙鏈環(huán)狀，單鏈環(huán)狀存在形式基因組采取滾環(huán)復(fù)制形式適合做載體具有比λ噬菌體更大的裝載能力單鏈形式在某些實驗過程很重要，如測序、體外突變等第58頁,共145頁，星期六，2024年，5月RFDNA第59頁,共145頁，星期六，2024年，5月第60頁,共145頁，星期六，2024年，5月（二）M13-DNA的改造1、定點誘變的方法封閉重復(fù)的酶切位點2、引入合適的選擇標(biāo)記基因，如抗生素抗性基因，LacZ’3、引入多克隆位點4、在多克隆位點兩側(cè)引入測序引物第61頁,共145頁，星期六，2024年，5月野生型M13RF-DNAM13mp系列載體polylinkerlacZ'IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII第62頁,共145頁，星期六，2024年，5月宿主菌缺陷型缺失N端第11－41位氨基酸：β-半乳糖苷酶沒有生物活性未插入外源基因的M13mp1與該缺陷型基因可以產(chǎn)生互補插入外源基因的M13mp1與宿主不互補編碼β-半乳糖苷酶N端146氨基酸的基因序列M13mp系列載體polylinkerlacZ‘第63頁,共145頁，星期六，2024年，5月Blue-whiteselection第64頁,共145頁，星期六，2024年，5月四、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體（一）粘粒載體（柯斯質(zhì)粒載體，cosmidvector

）

1、定義人工構(gòu)建的含有λDNA的cos（cohesive-endsite)位點序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。第65頁,共145頁，星期六，2024年，5月pHC796.4kb柯斯質(zhì)粒載體pHC79圖由pBR322質(zhì)粒DNA與λ噬菌體DNA的cos位點及其控制包裝作用的序列構(gòu)成第66頁,共145頁，星期六，2024年，5月2、柯斯質(zhì)粒載體的特點（1）只具有λ噬菌體的包裝特性，重組分子導(dǎo)入受體細胞按λ噬菌體的方式進行。（2）具有質(zhì)粒的特性（有質(zhì)粒復(fù)制子、抗生素基因和相應(yīng)的多克隆位點）；（3）具有高容量的克隆能力（本身僅5-7kb,克隆極限可達45kb左右）廣泛應(yīng)用于基因組DNA文庫的構(gòu)建。（一）粘粒載體（柯斯質(zhì)粒）第67頁,共145頁，星期六，2024年，5月（二）噬菌粒載體1、一般特點由絲狀噬菌體DNA復(fù)制起始位點序列與質(zhì)粒組合形成的雜合分子。將M13噬菌體基因II和IV之間的DNA復(fù)制起始、終止和包裝識別序列克隆進入質(zhì)粒載體，形成噬菌粒。第68頁,共145頁，星期六，2024年，5月（二）噬菌粒載體2、優(yōu)點A、具有質(zhì)粒的基本性質(zhì)，便于外源DNA的克隆和重組子的選擇B、具有更高的裝載容量C、比M13-DNA重組分子更具有遺傳穩(wěn)定性，在復(fù)制時不會發(fā)生DNA缺失第69頁,共145頁，星期六，2024年，5月五、人工染色體載體1、BAC（bacterialartificialchromosome）A、以大腸桿菌（E.coli）F性因子為基礎(chǔ)構(gòu)建的載體。B、特點：容納大約200Kb的片段可以像大腸桿菌的質(zhì)粒一樣繁殖（低拷貝，嚴(yán)謹型）在宿主細胞中不會發(fā)生重組第70頁,共145頁，星期六，2024年，5月五、人工染色體載體2、P1以及PAC載體（Pl-derivedArtificialChromosome）組件：

包裝位點（pac）：體外包裝重組子成為噬菌體粒子所必需。

兩個loxP位點：能被噬菌體重組酶（cre基因的產(chǎn)物）所識別具有P1和F-因子的特性能插入100-300Kb片段第71頁,共145頁，星期六，2024年，5月補充知識點Cre重組酶：于1981年從P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)，屬于λInt酶超基因家族。Cre重組酶基因編碼區(qū)序列全長1029bp（EMBL數(shù)據(jù)庫登錄號X03453），編碼38kDa蛋白質(zhì)。是一種位點特異性重組酶，能介導(dǎo)兩個LoxP位點（序列）之間的特異性重組，使LoxP位點間的基因序列被刪除或重組。LoxP（locusofX-overP1）序列：來源于P1噬菌體，是有兩個13bp反向重復(fù)序列和中間間隔的8bp序列共同組成，8bp的間隔序列同時也確定了LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過程中與DNA共價結(jié)合，13bp的反向重復(fù)序列是Cre酶的結(jié)合域。其序列如下：

ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT第72頁,共145頁，星期六，2024年，5月+CrerecombinaseproteincircularizesinjectedDNAattheloxPsites.DNA-replicatesusingplasmidreplicon,PlasmidcopynumberisincreasedbyinductionofP1lyticreplicon.PacextractcleavesatpacsiteandinsertsDNAintop1heads.TailsareattachedAllowphagetoadsorbtohoststrainandinjectDNAintocre+hostcell.第73頁,共145頁，星期六，2024年，5月正常酵母人工染色體含有：*四膜蟲端粒（tel)*酵母自主復(fù)制序列（ARS)*酵母著絲點(CEN)*酵母的選擇標(biāo)記(TRP1、URA1)YAC載體第74頁,共145頁，星期六，2024年，5月第二節(jié)DNA的體外重組目標(biāo)DNA與載體在體外連接，形成新的DNA分子。涉及到各種工具酶第75頁,共145頁，星期六，2024年，5月一、序列特異的DNA限制性內(nèi)切核酸酶

λ

噬菌體E.coli菌株λKλCλB

K

110-410-4B10-4110-4C

11

1（一）限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)第76頁,共145頁，星期六，2024年，5月（一）限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

—宿主細胞的限制和修飾作用1、宿主細胞的限制和修飾作用：兩種不同來源的入-噬菌體λK；λB，能高頻感染各自大腸桿菌宿主細胞（K株，B株）。當(dāng)它們分別與其它宿主菌交叉混合培養(yǎng)時，感染下降數(shù)千倍。一但λK噬菌體在B株成功，由B株繁殖出λK后代，能感染B株,不能感染原來K株.第77頁,共145頁，星期六，2024年，5月(二)限制和修飾作用的分子機制1．大腸桿菌宿主細胞K株，B株，有各自的限制和修飾系統(tǒng)。

1）

它們均有三個連續(xù)的基因位點控制，hsdR;hsdM;hsdS.2）

hsdR編碼限制性核酸內(nèi)切酶---識別DNA分子特定位點，將雙鏈DNA切斷。

3）

hsdM編碼產(chǎn)物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位點的堿基甲基化反應(yīng)。

4）

hsdS表達產(chǎn)物的功能是---協(xié)助限制性核酸內(nèi)切酶和甲基化酶，識別特殊的作用位點。第78頁,共145頁，星期六，2024年，5月(二)、限制和修飾作用的分子機制

2.入噬菌體長期生長在大腸桿菌宿主細胞K株，B株中，

1）宿主細胞甲基化酶，將染色體DNA和噬菌體DNA特異性保護.2）封閉自身所產(chǎn)生的核酸內(nèi)切酶的識別位點（修飾）

3．當(dāng)外來DNA入侵時，遭到宿主限制性內(nèi)切酶的特異降解（限制）

4.由于降解不完全，外來少數(shù)DNA分子在宿主細胞中繁殖過程中被宿主細胞的甲基化酶修飾，雖然是外來卻不被降解。第79頁,共145頁，星期六，2024年，5月5．但喪失在原宿主細胞中的存活能力，因為接受了新宿主菌甲基化修飾的同時喪失了原宿主菌修飾的標(biāo)記(一但λK噬菌體在B株成功，由B株繁殖出λK后代，能感染B株,不能感染原來K株)6．細菌利用限制和修飾系統(tǒng)來區(qū)分自身DNA與外來DNA。

C株不能產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶，其它來源入-噬菌體可以感染C株，在C株繁殖，其產(chǎn)生噬菌體則在K株和B株受到嚴(yán)格的限制作用(二)限制和修飾作用的分子機制第80頁,共145頁，星期六，2024年，5月(三)限制性內(nèi)切酶的分類I類酶II類酶III類酶酶分子三亞基雙功能內(nèi)切酶與甲基化酶分離二亞基雙功能識別位點二分非對稱序列4-8bp序列，回文結(jié)構(gòu)5-7bp非對稱序列切割位點距識別位點1000bp在識別位點中或靠識別位點在識別位點下游24-26bp限制性反應(yīng)與甲基化反應(yīng)互斥分開反應(yīng)同時竟?fàn)幭拗谱饔眯枰枰恍枰?1頁,共145頁，星期六，2024年，5月酶的命名3.

命名（1973年Smith原則、Ⅱ型酶）根據(jù)分離此酶微生物的學(xué)名，一般取3個字母。第一個字母大寫該微生物屬名前的第一個字母第二、三個字母小寫該微生物種名前的2個字母第四個字母大寫有變種或品系的第一個字母羅馬字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ從一種微生物中發(fā)現(xiàn)了幾種限制酶，按發(fā)現(xiàn)順序排列如EcoRⅠ是指從大腸桿菌（Escherichiacoli）R株分離得到的第一種限制酶。第82頁,共145頁，星期六，2024年，5月（四）限制性內(nèi)切酶Ⅱ切割特點1、識別位點一般為4-8個bp的回文序列大多數(shù)酶作用于底物DNA雙鏈，位點在識別序列中或靠近識別序列少數(shù)酶能作用于回文序列相應(yīng)DNA單鏈序列第83頁,共145頁，星期六，2024年，5月限制性內(nèi)切酶Ⅱ切割特異位點的機理第84頁,共145頁，星期六，2024年，5月（四）限制性內(nèi)切酶Ⅱ切割特點平末端：兩條鏈上的斷裂位置是處在一個對稱結(jié)構(gòu)的中心，形成的DNA片段具有平末端。黏性末端：指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過互補堿基間的配對而重新環(huán)化起來。

5’突出的黏性末端

3’突出的黏性末端第85頁,共145頁，星期六，2024年，5月平末端的DNA片段不易重新環(huán)化第86頁,共145頁，星期六，2024年，5月已知有兩種不同的限制酶都可產(chǎn)生粘性末端：5’-P端突出：3’-OH端突出：第87頁,共145頁，星期六，2024年，5月同尾酶一組來源不同識別序列各異的，但能夠切割形成相同粘性末端的核酸內(nèi)切限制酶。第88頁,共145頁，星期六，2024年，5月HindⅢ5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’HsuI5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’同裂酶（isoschizomers）有一些來源不同的限制性內(nèi)切酶能識別并切割相同的核苷酸靶序列，這類酶稱為同裂酶。第89頁,共145頁，星期六，2024年，5月限制酶識別與切割的靶點序列及其隨后的連接同DNA的來源無關(guān)，即不帶有種的特異性，對各種DNA普遍適用。根據(jù)這一特性，才能將不同來源的DNA片段重組成新的重組體分子或是新的基因。第90頁,共145頁，星期六，2024年，5月（五）甲基化酶對內(nèi)切酶識別的影響為限制性內(nèi)切酶的伙伴，其識別位點與相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶相同，并在識別序列內(nèi)使某位堿基甲基化，對基因組甲基化后，內(nèi)切酶識別發(fā)生的變化：1）封閉了內(nèi)切酶的切口。如M.EcoRⅠ2）一些依賴甲基化的限制性內(nèi)切酶的切口產(chǎn)生5′—TCGATCGA—3′5′—TCGA*TCGA*—3′5′—AGCTAGCT—3′5′—A*GCTA*GCT—3′TaqITaqIDpnI第91頁,共145頁，星期六，2024年，5月（五）甲基化酶對內(nèi)切酶識別的影響3）增加了部分酶的識別特異性。大腸桿菌基因組內(nèi)存在兩種甲基化酶,Dam和Dcm5′—ATCGAT—3′ClaI5′—GA*TCGAT—3′5′—ATCGA*TC—3′4）部分酶對其識別序列內(nèi)的堿基是否甲基化，不影響切割5′—(C/T/A)ATCGAT(T/A/G)—3′ClaI第92頁,共145頁，星期六，2024年，5月二、連接酶第93頁,共145頁，星期六，2024年，5月（一）DNA連接酶的作用模式1、連接酶：能夠催化兩條雙鏈DNA鏈之間形成3′

，5′磷酸二酯鍵的酶5’－末端形成DNA－腺苷酸復(fù)合物第94頁,共145頁，星期六，2024年，5月（二）DNA連接酶的兩種類型類型I：E.coliDNA連接酶（只連接粘末端）利用NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）作為能量供體，主要來源于原核生物類型II：T4DNA連接酶（粘末端和平末端）

利用ATP作為能量供體，主要來源于真核生物，T4噬菌體也屬于此類在基因工程的實驗中主要用T4DNA連接酶第95頁,共145頁，星期六，2024年，5月（三）條件（1）連接所需的條件一條DNA鏈的3’末端具有一個游離的羥基（-OH），而在另一條DNA鏈的5’末端具有一個磷酸基團（-P）；（2）需要有一種能源分子存在以提供羥基與磷酸基團之間形成磷酸二酯鍵時所需的能量。大腸桿菌及其它細菌中：NAD+（氧化氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）動物細胞及噬菌體中：ATPOH3’5’P第96頁,共145頁，星期六，2024年，5月（四）注意被連接的兩條DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分，DNA連接酶并不能連接兩條單DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子。DNA連接酶只能連接并封閉雙螺旋DNA分子所出現(xiàn)的切口（Nick），即封閉雙鏈DNA上兩個相鄰核苷酸之間失去一個磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的斷裂第97頁,共145頁，星期六，2024年，5月GGTAC-OHP-CC-PHO-CATGG5’3’3’5’GG-OHP-CCCCATGG5’3’3’5’GGTACCCCATGG5’3’3’5’第98頁,共145頁，星期六，2024年，5月三、其他用于DNA重組的工具酶1、DNA聚合酶Ⅰ（來自大腸桿菌）功能：5’→3’的聚合酶活性。5’→3’外切核酸酶活性，3’→5’外切核酸酶利用：5’→3’的聚合酶活性以及5’→3’外切核酸酶活性，切口平移大片段（Klenow片段）：5’→3’的聚合酶活性，3’→5’外切核酸酶小片段DNA聚合酶Ⅰ第99頁,共145頁，星期六，2024年，5月第100頁,共145頁，星期六，2024年，5月TaqDNA聚合酶（來自耐熱細菌）具有5’→3’的聚合酶活性和3’→5’外切核酸酶，高度保真。耐高溫。T4DNA聚合酶：具極強3’→5’外切核酸酶活性，可修平非平頭的DNA分子。測序酶：具有5’→3’的聚合酶活性，但不具備3’→5’外切核酸酶的T7DNA聚合酶。反轉(zhuǎn)錄酶：以mRNA為模板合成DNA的聚合酶第101頁,共145頁，星期六，2024年，5月2、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶不需要模板的DNA聚合酶，底物為帶有游離3′端的羥基的雙鏈DNA分子。三、其他用于DNA重組的工具酶5′3′OH+Mg2++dATP+TdT5′3′AAAAAAAA5′3′OH5′3′AAAAAAAA+Co2++dATP+TdT5′3′OH+Co2++dATP+TdT5′3′AAAAAAAAA3′突出端平端3′凹端第102頁,共145頁，星期六，2024年，5月3、S1核酸酶以外切或內(nèi)切的方式降解單鏈RNA或DNA。4、Bal31核酸酶三、其他用于DNA重組的工具酶第103頁,共145頁，星期六，2024年，5月三、其他用于DNA重組的工具酶5、堿性磷酸酯酶：除去DNA5′磷酸的酶6、激酶：在DNA或RNA的5′羥基(OH)端進行磷酸化的酶（作用結(jié)果是添加磷酸，可用于核酸的末端標(biāo)記）第104頁,共145頁，星期六，2024年，5月四、DNA切接反應(yīng)的影響因素（一）、限制性內(nèi)切酶切割反應(yīng)合適的緩沖液（10~50mMTris-HCl,pH7.5);10mMMgCl2、1mMDTT對NaCl的濃度要求不同，可以分為低鹽組中鹽組高鹽組雙酶切反應(yīng)的原則A、鹽濃度要求相似的內(nèi)切酶可在一個反應(yīng)體系中做雙酶切反應(yīng)B、先做低鹽反應(yīng)酶切再做高鹽反應(yīng)的酶切C、考慮雙酶切位點的核苷酸排列第105頁,共145頁，星期六，2024年，5月四、DNA切接反應(yīng)的影響因素星號活性在非理想條件下，酶的專一性降低，導(dǎo)致內(nèi)切酶切割與其識別序列相似序列的現(xiàn)象，稱為限制性內(nèi)切酶的星號活性。如EcoRI5′—GAATTC—3′EcoRI低鹽、高pH值、過量甘油5′—AAATTC—3′5′—GAGTTC—3′第106頁,共145頁，星期六，2024年，5月四、DNA切接反應(yīng)的影響因素（二）、T4-DNA連接酶的連接反應(yīng)緩沖液體系：50~100mMTris-HCl（pH7.5）10mMMgCl2、1mMDTT，≤1mMATP過量的甘油抑制反應(yīng)溫度、離子濃度、DNA末端的性質(zhì)、DNA片段的大??；載體和外源基因的摩爾比因大多數(shù)內(nèi)切酶產(chǎn)生的黏性末端退火溫度在15度以下，故連接反應(yīng)一般在低溫下進行（16度以下）。第107頁,共145頁，星期六，2024年，5月（三）重組率及其影響因素1、由同一種酶切割的載體分子和目標(biāo)DNA片段在連接時會產(chǎn)生三種連接產(chǎn)物：載體自連外源DNA片段自連載體+外源DNA片段的連接產(chǎn)物（目標(biāo)重組產(chǎn)物）2、提高重組產(chǎn)物的方法：增加外源片段與載體片段的比值（3~8:1)載體DNA的5′去磷酸化用末端轉(zhuǎn)移酶分別處理載體和目標(biāo)片段，使它們帶有互補的末端四、DNA切接反應(yīng)的影響因素第108頁,共145頁，星期六，2024年，5月1、互補黏性末端之間的連接同一限制酶切割位點連接：

由同一限制性核酸內(nèi)切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割DNA后產(chǎn)生單鏈突出（5‘突出及3’突出）的粘性末端，同時酶切位點附近的DNA序列不影響連接，那么，當(dāng)這樣的兩個DNA片段一起退火時，粘性末端單鏈間進行堿基配對，然后在DNA連接酶催化作用下形成共價結(jié)合的重組DNA分子。具有兩個插入方向兩個限制性內(nèi)切酶切割位點連接：只可一種方向插入同尾酶切割位點連接：發(fā)生酶切口的焊死作用五、DNA分子重組的方法第109頁,共145頁，星期六，2024年，5月五、DNA分子重組的方法2、平末端之間的鏈接DNA連接酶可催化相同和不同限制性核酸內(nèi)切酶切割的平端之間的連接。原則上講，限制酶切割DNA后產(chǎn)生的平端也屬配伍末端，可彼此相互連接；若產(chǎn)生的粘性末端經(jīng)特殊酶處理，使單鏈突出處補齊或削平，變?yōu)槠蕉?，也可實行平端連接。操作方法同黏性末端之間的鏈接，增加酶的用量。提高連接反應(yīng)溫度；增加DNA平頭末端的濃度等。第110頁,共145頁，星期六，2024年，5月3、將粘末端加到平末端分子上DNA接頭同聚物加尾產(chǎn)生粘性末端PCR產(chǎn)物的克隆連接（特例）五、DNA分子重組的方法第111頁,共145頁，星期六，2024年，5月DNA接頭第112頁,共145頁，星期六，2024年，5月

同聚物加尾連接是利用同聚物序列，如多聚A與多聚T之間的退火作用完成連接。在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)作用下，在DNA片段端制造出粘性末端，而后進行粘性末端連接。這是一種人工提高連接效率的方法，也屬于粘性末端連接的一種特殊形式。dATPdTTP同聚物加尾產(chǎn)生粘性末端第113頁,共145頁，星期六，2024年，5月PCR產(chǎn)物的克隆連接PCR反應(yīng)中所使用的聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，通常在3’末端加上A。經(jīng)特使處理的載體具有3’突出T堿基，通過T/A互補，進行克隆。屬于黏性末端的連接，該克隆方式特稱TA克隆。第114頁,共145頁，星期六，2024年，5月從生物秀網(wǎng)站下載第115頁,共145頁，星期六，2024年，5月4、定向克隆將外源DNA按正確的方向插入載體。通常采用不同的內(nèi)切酶分別處理載體和片段，使線性載體和片段的兩段帶有不同的粘性末端，通過載體與片段之間的連接，實現(xiàn)定向克隆。第116頁,共145頁，星期六，2024年，5月第三節(jié)重組DNA分子的轉(zhuǎn)化與擴增第117頁,共145頁，星期六，2024年，5月一、概念將重組DNA分子，導(dǎo)入特定的受體細胞，使之無性繁殖并高效表達外源基因或直接改變其遺傳性狀，該導(dǎo)入過程及操作系統(tǒng)稱之為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。兩個條件：可轉(zhuǎn)化的DNA分子受體細胞第118頁,共145頁，星期六，2024年，5月細菌轉(zhuǎn)化的過程（革蘭氏陽性菌）1、感受態(tài)的形成細胞分泌激活蛋白→與細胞表面受體結(jié)合→誘導(dǎo)特征性蛋白質(zhì)（如細菌溶素）合成→細胞壁部分溶解→暴露細胞膜上的DNA結(jié)合蛋白和核酸酶2、轉(zhuǎn)化因子的結(jié)合：細胞膜上的DNA結(jié)合蛋白與雙鏈DNA特異結(jié)合。第119頁,共145頁，星期六，2024年，5月3、轉(zhuǎn)化因子吸收：DNA+蛋白質(zhì)→激活核酸酶→DNA一條鏈被降解，另一條鏈進入到受體細胞中4、整合復(fù)合物前體的形成：單鏈DNA+細胞中游離蛋白質(zhì)→形成整合復(fù)合物前體結(jié)構(gòu)（避免細胞內(nèi)各種核酸酶的攻擊）→引導(dǎo)進入受體細胞染色體DNA處。5、同源重組的方式置換受體DNA的同源區(qū)域細菌轉(zhuǎn)化的過程（革蘭氏陽性菌）第120頁,共145頁，星期六，2024年，5月二、受體細胞的選擇1、限制缺陷型的細胞：將相應(yīng)細胞中的內(nèi)切酶失活（如大腸桿菌中的hsdR，使之變成hsdR-

突變株系）2、重組缺陷型細胞轉(zhuǎn)入的外源DNA分子能夠自主復(fù)制，一般不需要將DNA重組到染色體DNA，因此受體細胞應(yīng)該是重組相關(guān)的酶的突變株系(如大腸桿菌中recA-,recB-,recC-第121頁,共145頁，星期六，2024年，5月二、受體細胞的選擇3、轉(zhuǎn)化親和型：使細胞壁的通透性增高，提高轉(zhuǎn)化效率；噬菌體受體菌細胞膜上需有特異性吸附的相關(guān)受體。4、遺傳互補型：受體細胞與載體上的選擇標(biāo)記具有互補的遺傳性狀。如載體上具有抗生素基因，細菌細胞中就應(yīng)該沒有該基因或該基因突變，這樣受體細胞接受外源DNA后，就會獲得載體上的選擇標(biāo)記的性狀，這樣可篩選外源基因表達的轉(zhuǎn)化細胞。第122頁,共145頁，星期六，2024年，5月二、受體細胞的選擇5、感染寄生缺陷型對于人體和牲畜有害的細菌，在作為受體時，需將其感染寄生能力突變，從而具有生物安全性。第123頁,共145頁，星期六，2024年，5月三、轉(zhuǎn)化方法動植物細胞通常應(yīng)病毒感染的方法，將外源DNA導(dǎo)入細胞。細菌細胞方法如下：1、Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化外膜與內(nèi)膜間的部分核酸酶離開細胞膨脹細胞膜磷酯層形成液晶感受態(tài)加入DNA羥基磷酸鈣-DNA復(fù)合物核酸酶不能降解42℃處理膜液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，通透性增加，DNA進入細胞低滲CaCl2溶液第124頁,共145頁，星期六，2024年，5月三、轉(zhuǎn)化方法2、PEG介導(dǎo)的細菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化對數(shù)生長期的細胞→適量溶菌酶等滲溶液→原生質(zhì)體（膜上DNase）→環(huán)狀DNA分子的吸收→DNA樣品+PEG→涂布在固體培養(yǎng)基上→細胞壁再生→通過選擇標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化細胞。3、電轉(zhuǎn)化電場脈沖作用下→細胞壁形成微孔通道→DNA與細胞膜結(jié)合，引發(fā)吸收。轉(zhuǎn)化分子量大的DNA比較有效。第125頁,共145頁，星期六，2024年，5月三、轉(zhuǎn)化方法4、接合轉(zhuǎn)化接合：細菌細胞間的直接接觸導(dǎo)致DNA從一個細胞轉(zhuǎn)移至另一個細胞的過程。接合質(zhì)粒介導(dǎo)：促進細胞有效接觸、誘導(dǎo)DNA分子傳遞轉(zhuǎn)移第126頁,共145頁，星期六，2024年，5月接合轉(zhuǎn)化過程供體菌(待轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒的菌株），不能在最小培養(yǎng)基中生長，但抗生素XR輔助菌(含輔助質(zhì)粒的菌株），不能在最小培養(yǎng)基中生長，但抗生素YR受體菌,能在最小培養(yǎng)基中生長在無抗生素的培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)一段時間后含有X+Y的最小培養(yǎng)基第127頁,共145頁，星期六，2024年，5月四、轉(zhuǎn)化率及其影響因素1、轉(zhuǎn)化率的定義定義1：待轉(zhuǎn)化的DNA分子遠大于受體細胞的條件下，轉(zhuǎn)化細胞與細胞總數(shù)之比。定義2：受體細胞相對于DNA分子大大過量時，每微克DNA轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生克隆數(shù)。（每微克DNA進入受體細胞的分子數(shù)）第128頁,共145頁，星期六，2024年，5月四、轉(zhuǎn)化率及其影響因素2、轉(zhuǎn)化率的用途參照已知轉(zhuǎn)化率和重組率可以幫助設(shè)計DNA重組實驗的規(guī)模，如平板的制備數(shù)量第129頁,共145頁，星期六，2024年，5月四、轉(zhuǎn)化率及其影響因素3、轉(zhuǎn)化率的影響因素載體DNA及重組DNA：構(gòu)象和大小受體細胞轉(zhuǎn)化操作：選擇適合轉(zhuǎn)化方法和優(yōu)化操作流程第130頁,共145頁，星期六，2024年，5月2.3.5轉(zhuǎn)化細胞的擴增轉(zhuǎn)化細胞的增殖載體攜帶標(biāo)記基因拷貝數(shù)擴增及表達克隆外源基因的表達第131頁,共145頁，星期六，2024年，5月2.4轉(zhuǎn)化子的篩選與重組子的鑒定非轉(zhuǎn)化子：未接納載體或重組子的非轉(zhuǎn)化細胞轉(zhuǎn)化子：接納載體或