中國(guó)柑桔黃龍病研究三十年

PAGEPAGE10PAGEPAGE10 中國(guó)柑桔黃龍病研究三十年30-yearResearchesofCitrusHuanglongbinginChina目錄因時(shí)間緊迫，未對(duì)全文進(jìn)行排版，故目錄頁(yè)碼和正文對(duì)不上。第一章中國(guó)柑桔黃龍病研究三十年 11柑桔黃龍病發(fā)生與分布 11.1國(guó)外發(fā)生概況 11.2國(guó)內(nèi)發(fā)生概況 22柑桔黃龍病寄主 73柑桔黃龍病的危害 113.1典型癥狀 113.2危害嚴(yán)重性 114柑桔黃龍病病原研究 124.1黃龍病病原問(wèn)題 124.2病原提純與抗體制備 154.3病原的分離培養(yǎng) 154.4診斷與檢測(cè) 154.4.1田間診斷 154.4.2指示植物鑒定 164.4.3電鏡觀察 164.4.4血清學(xué)檢測(cè) 164.4.5組織化學(xué)診斷 174.4.6生理生化指標(biāo)診斷 204.4.7PCR檢測(cè) 174.5柑桔黃龍病病原分化 205柑桔黃龍病傳播途徑與病害流行 215.1柑桔黃龍病傳播途徑 215.2柑桔黃龍病流行與蔓延 216柑桔黃龍病防控技術(shù) 226.1防控策略 226.2防控措施 236.2.1強(qiáng)化檢疫 236.2.2適地建園 246.2.3培育和推廣使用無(wú)病苗木 286.2.4及時(shí)挖除病株 286.2.5嚴(yán)格防除柑桔木虱 346.2.6加強(qiáng)果園管理 367結(jié)尾語(yǔ) 36第二章柑桔黃龍病研究文摘 371.12008年 371.22007年 431.32006年 671.42005年 911.52004年 1061.62003年 1141.72002年 1191.82001年 1211.92000年 1221.101999年 1251.111998年 1281.121997年 1311.131996年 1331.141995年 1351.151994年 1371.161993年 1371.171992年 1391.181991年 1401.191990年 1411.201989年 142第三章柑桔黃龍病研究參考文獻(xiàn) 145第一章中國(guó)柑桔黃龍病研究三十年摘要文章綜述了我國(guó)自1978年以來(lái)有關(guān)柑桔黃龍病的研究概況，其中包括柑桔黃龍病在我國(guó)的發(fā)生和分布，柑桔黃龍病寄主，柑桔黃龍病的危害，柑桔黃龍病病原研究，柑桔黃龍病傳播途徑與病害流行，柑桔黃龍病防控技術(shù)等。文章共引述了144篇參考資料。30-YearResearchesofCitrusHuanglongbinginChinaAbstract：Thepresentpaperdealswithageneralreviewoftheresearchesofcitrushuanglongbing(HLB)whichhavebeendoneinChinasince1978.Topicsincludedaretheoccurrenceandgeographicaldistribution,hostplant,destruction,studiesofpathogen,transmissionrouteanddiseaseepidemic,andcontrolofHLB.144literaturesarecited.我國(guó)為柑桔黃龍病(Huanglongbing,HLB)的老病區(qū)，自文字記載世界第一例柑桔黃龍病在我國(guó)發(fā)生以來(lái)已近百年，盡管期間有許多的爭(zhēng)議和起伏，對(duì)柑桔黃龍病及其危害的研究還是日漸深入。尤其是1978年柯沖首次報(bào)道了電鏡下觀察到我國(guó)黃龍病病原的形態(tài)以后，經(jīng)廣大科研工作者不懈地努力和探索，我國(guó)柑桔黃龍病的研究取得了顯著進(jìn)展。本文主要是對(duì)我國(guó)三十年來(lái)有關(guān)柑桔黃龍病的研究作一個(gè)綜述性的簡(jiǎn)明報(bào)道。1柑桔黃龍病發(fā)生與分布1.1國(guó)外發(fā)生概況柑桔黃龍病是世界柑桔生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一。自20世紀(jì)初在華南地區(qū)首次報(bào)道以來(lái)（Reinking,1919），除地中海盆地、西亞、澳洲和太平洋島嶼等尚未有柑桔黃龍病發(fā)生的報(bào)道外，已在亞洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的40多個(gè)國(guó)家相繼發(fā)生（Bové,2006）。柑桔黃龍病在各地有各種不同的病名，在南非被稱(chēng)為青果病（greeningdisease），菲律賓、印度和印度尼西亞又分別被稱(chēng)為葉片斑駁?。╩ottleleaf）、梢枯?。╠ieback）和韌皮部衰退病（veinphloemdegeneration）（Bové,2006）。2004年和2005年，世界最重要的兩個(gè)柑桔主產(chǎn)區(qū)——巴西圣保羅州（Texeiraetal.,2004）和美國(guó)佛羅里達(dá)州（Halbert,2005）相繼發(fā)生黃龍病，造成了世界柑桔從業(yè)者的恐慌，巴西和美國(guó)均加強(qiáng)了對(duì)該病害的研究力度。美國(guó)農(nóng)業(yè)部已投入大量研究經(jīng)費(fèi)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院也介入柑桔黃龍病的研究行列（夏竹,2008a,2008b），國(guó)際合作廣泛開(kāi)展。1.2國(guó)內(nèi)發(fā)生概況我國(guó)是世界主要柑桔的原產(chǎn)地，品種資源豐富，栽培歷史悠久。自1990年以來(lái)，我國(guó)柑桔產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展。迄今，柑桔栽培面積已達(dá)171.7萬(wàn)hm2以上，居世界第一位；其產(chǎn)量超過(guò)1591.9萬(wàn)t（中國(guó)農(nóng)業(yè)年鑒編輯委員會(huì),2006），居世界第二位，僅次于巴西。柑桔黃龍病是我國(guó)柑桔生產(chǎn)上最具毀滅性的病害，其發(fā)生的歷史長(zhǎng)，分布廣，危害大。半個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，嚴(yán)重地危害著廣東、廣西和福建三省區(qū)柑桔事業(yè)的發(fā)展。70年代末，四川省西昌地區(qū)及江西贛州地區(qū)也先后發(fā)現(xiàn)柑桔黃龍?。聸_等,1980b），到80年代中期，柑桔黃龍病已在我國(guó)廣東，廣西，福建，海南和臺(tái)灣的產(chǎn)區(qū)廣泛蔓延，并在浙江，云南，貴州，湖南相繼發(fā)生（吳世盤(pán)和李劍書(shū),1986），我國(guó)有柑桔栽培的19個(gè)省、區(qū)已有11個(gè)遭受危害，其面積占柑桔總栽培面積的80%以上，產(chǎn)量占總產(chǎn)量的85%左右。更令人擔(dān)憂的是，由于柑桔黃龍病病原能侵染各種柑桔類(lèi)植物，將對(duì)我國(guó)柑桔種質(zhì)資源的保護(hù)構(gòu)成嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。圖1中國(guó)柑桔黃龍病的分布：表病區(qū),表無(wú)病區(qū).2柑桔黃龍病寄主黃龍病是高度專(zhuān)化性病害，能侵染各種柑桔類(lèi)植物，主要為害柑桔屬（Citrusspp.）、枳屬（Poncirustrifoliata）和金柑屬（Fortunellaspp.）。包括寬皮桔類(lèi)，橙類(lèi)，宜昌橙類(lèi)，柚類(lèi)，枸櫞類(lèi)，金柑類(lèi)和枳類(lèi)等的品種和栽培種。品種間的抗病性有差別，其中寬皮桔類(lèi)，橙類(lèi)，宜昌橙類(lèi)最感病，柚類(lèi)次之，其他各類(lèi)較抗病，而枳類(lèi)最抗病，感染后多不表現(xiàn)病狀，尚未發(fā)現(xiàn)免疫品種。酒餅簕屬（Severiniabuxifolia）（Hungetal.,2001）和蕓香科九里香屬（Murrayakoenig）的九里香也是黃龍病的寄主（李韜和柯沖,2002;李韜等,2007;婁兵海和周常勇,2007）。黃龍病菌還可以在假黃皮（Clausenaexcavata）和象桔屬（FeronialimoniaSwingle）的木蘋(píng)果存活一段時(shí)間，為黃龍病暫時(shí)性寄主（楊建榕和李健,2007）。3柑桔黃龍病的危害3.1典型癥狀柑桔受黃龍病侵染后，產(chǎn)生一系列典型癥狀。初發(fā)病時(shí)，或是樹(shù)冠上少數(shù)嫩梢新葉尚未完全轉(zhuǎn)綠成熟便發(fā)病黃化，形成均勻黃化型黃梢；或是葉片已完全轉(zhuǎn)綠成熟后發(fā)病，葉片退綠黃化，產(chǎn)生黃綠相間的斑駁，形成斑駁型黃梢。其后在病梢上再長(zhǎng)的新梢，葉片榨小，多呈缺鋅狀花葉，病樹(shù)上原來(lái)未發(fā)病的梢上葉片也陸續(xù)呈現(xiàn)斑駁，黃化脫落，樹(shù)勢(shì)衰退，產(chǎn)量大減（范懷忠等,1986）。黃龍病的病狀十分復(fù)雜，易與缺素等生理性病害的病狀相混淆。但在柑桔特定的生長(zhǎng)期（新梢期）和氣溫由高轉(zhuǎn)低的季節(jié)（10月份至翌年春梢前），表現(xiàn)出特異性的黃梢和斑駁病狀，可以作為田間診斷的依據(jù)。最初，在廣東潮汕地區(qū)的蘆柑和蕉柑病樹(shù)上常見(jiàn)的病狀是黃梢，二十世紀(jì)60年代，在福建地區(qū)的福桔病樹(shù)上最先發(fā)現(xiàn)斑駁病狀。此后，在各地病樹(shù)上表現(xiàn)的斑駁病狀比黃梢更突出，成為最常用的田間診斷依據(jù)。最近，各地黃龍病樹(shù)上表現(xiàn)紅鼻果的病狀十分明顯，經(jīng)常在福桔病樹(shù)上只表現(xiàn)紅鼻果病狀。引起病狀變化的原因值得探討。3.2危害嚴(yán)重性柑桔黃龍病能侵染各種柑桔類(lèi)植物，病樹(shù)主要表現(xiàn)為經(jīng)濟(jì)壽命短，產(chǎn)量低，果品質(zhì)劣，引起巨大的經(jīng)濟(jì)損失。柑桔樹(shù)的經(jīng)濟(jì)壽命原來(lái)可達(dá)幾十年，乃至上百年，可是受黃龍病危害之后，柑桔樹(shù)的壽命大大縮短，僅有10年左右（吳如健和柯沖,2007）。柑桔黃龍病曾給廣東、廣西和福建三省區(qū)的柑桔產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重影響，近年來(lái)該病害又有卷土重來(lái)之勢(shì)。廣東楊村柑桔場(chǎng)，1978年開(kāi)始，黃龍病嚴(yán)重為害，每年清除病樹(shù)兩三百公頃，1972年以前種植的96萬(wàn)株大樹(shù)幾乎全部被毀，1972年以后種植的植株損失20萬(wàn)株，總產(chǎn)量由1977年的2.15萬(wàn)t降為1982年的0.53萬(wàn)t（趙學(xué)源,2008）；作為國(guó)內(nèi)外獨(dú)一無(wú)二的特產(chǎn)，廣東廉江市的紅橙種植面積如今發(fā)展到近8萬(wàn)畝。然而，令當(dāng)?shù)毓r(nóng)至今仍心有余悸的黃龍病，目前仍然繼續(xù)蔓延。據(jù)了解，現(xiàn)在紅橙果園的發(fā)病率達(dá)10％～20％，其中部分果園發(fā)病率達(dá)30％～40％，對(duì)紅橙生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響。廣西自治區(qū)的柳州市，1977年柑桔產(chǎn)量達(dá)到0.57萬(wàn)t，因受柑桔黃龍病的危害，產(chǎn)量逐年下降，至1982年僅有0.14萬(wàn)t（范懷忠等,1986）；梧州市20世紀(jì)60年代就查出有柑桔黃龍病發(fā)生，1982年全區(qū)柑桔黃龍病普查時(shí)發(fā)現(xiàn)，該市的黃龍病普遍比較嚴(yán)重，梧州市郊及藤縣、岑溪和蒙山等地均有不少桔園因柑桔黃龍病的嚴(yán)重危害而被迫淘汰(邱柱石等,2007)。20世紀(jì)60年代在桂林地區(qū)荔浦縣只有零星分布，70年代末由于該縣被國(guó)家外貿(mào)部認(rèn)定為全國(guó)夏橙出口生產(chǎn)基地縣，柑桔種植面積尤其是夏橙面積迅速增加，曾達(dá)3300hm2。但在夏橙生產(chǎn)的發(fā)展過(guò)程中，柑桔黃龍病也在不同程度地蔓延擴(kuò)散，每年毀于該病的果樹(shù)數(shù)以萬(wàn)計(jì)，給全縣夏橙生產(chǎn)帶來(lái)極大損失(韋宗便，2006)。福建為我國(guó)柑桔的主產(chǎn)區(qū)之一，2006年栽培面積為17.0萬(wàn)hm2，產(chǎn)量達(dá)226.7萬(wàn)t，產(chǎn)量、人均占有量和鮮果出口量均居全國(guó)第一位（龔守棟和陳建,2007），柑桔生產(chǎn)已成為福建省農(nóng)民增收致富的一條重要途徑。然而，自2003年以來(lái)，福建柑桔主產(chǎn)區(qū)普遍反饋柑桔黃龍病呈爆發(fā)態(tài)勢(shì)，危機(jī)產(chǎn)業(yè)安全。永春縣引種柑桔已達(dá)50年之久，一直以來(lái)，黃龍病發(fā)病率均控制在1％以下，在全國(guó)南亞熱帶柑桔產(chǎn)區(qū)中屬發(fā)病率最低的地區(qū)，但近年來(lái)黃龍病為害日益嚴(yán)重，3年時(shí)間內(nèi)發(fā)病率由不到1％上升至5％，一些果園達(dá)20％～30％以上，并有成片果園被毀(張生才，2005)；著名蘆柑產(chǎn)地漳州市受黃龍病的危害嚴(yán)重，每年柑桔死亡面積達(dá)5％，曾因“柑中之冠”而聞名的長(zhǎng)泰縣已成為柑桔返銷(xiāo)地（謝鐘琛等,2007）。因此，柑桔黃龍病已成為我國(guó)柑桔產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大威脅。柑桔受黃龍病感染后，不僅產(chǎn)生黃梢、葉片斑駁及缺素等癥狀，也引起一系列的細(xì)胞生理和病理變化。通過(guò)草地菟絲子將長(zhǎng)春花中的黃龍病病原回接柑桔的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)其回接成功率低的原因主要在于滲透壓的區(qū)別，因?yàn)闊o(wú)論是病、健株，柑桔滲透壓均比長(zhǎng)春花的高一倍（柯穗等,1988a）。更為有趣的是，寄主植物的病株葉脈壓榨液的滲透濃度都比健株的高出1/3至1/2（柯穗等,1989），其中的病生理問(wèn)題值得探討。黃龍病病原主要局限于柑桔韌皮部的篩管細(xì)胞內(nèi)，嚴(yán)重破壞韌皮部組織，其細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)也有明顯的變化。病葉中葉綠體受到嚴(yán)重破壞，淀粉粒異常膨大，基粒片層被膨大的淀粉粒所擠壓，排列松散，不規(guī)則，有些切片中還可看到葉綠體中的嗜鋨體亦有變大的現(xiàn)象；在染病的韌皮部和木質(zhì)部中，細(xì)胞質(zhì)膜凹入形成質(zhì)膜體，內(nèi)含多數(shù)形態(tài)不一的空泡；線粒體內(nèi)嵴斷裂不完整或消失（吳世盤(pán)和章潛才,1985），引起原生質(zhì)和線粒體逐漸消失。隨著菌體數(shù)量的增多，導(dǎo)致韌皮部的崩壞，這與黃龍病葉片的黃化、變硬、有草質(zhì)感以及病樹(shù)的多花現(xiàn)象是相一致的。所以在葉片表現(xiàn)明顯病狀時(shí)，其篩管細(xì)胞內(nèi)菌體含量最高。病原體有通過(guò)篩板中的篩孔進(jìn)入相鄰的篩管細(xì)胞的現(xiàn)象（吳世盤(pán)和李劍書(shū),1986）。菌體還會(huì)侵蝕篩管細(xì)胞的胞壁形成許多侵蝕孔，成為菌體除了篩孔以外向鄰近篩管細(xì)胞移動(dòng)的另一個(gè)通道（柯沖等,1991）。4柑桔黃龍病病原研究4.1黃龍病病原問(wèn)題我國(guó)黃龍病的病原問(wèn)題，經(jīng)歷長(zhǎng)期的研究與激烈的爭(zhēng)論后，科學(xué)地統(tǒng)一了認(rèn)識(shí)。1956年前，對(duì)黃龍病的病原有種種推測(cè)，但都缺乏有說(shuō)服力的實(shí)驗(yàn)根據(jù)（柯沖,1979）。1956年，林孔湘發(fā)表病芽接種能傳病的研究成果后，認(rèn)為是病毒病害（林孔湘,1956）。七十年代發(fā)現(xiàn)傳病昆蟲(chóng)是柑桔木虱（華南農(nóng)學(xué)院植保系植病教研組,1977），而且當(dāng)病樹(shù)注入鹽酸四環(huán)素后，病情受到明顯抑制（廣西柑桔黃龍病小組,1978），斑駁葉片中的淀粉積累現(xiàn)象消失（陳乃榮等,1981），篩管細(xì)胞內(nèi)多型性、雙層膜厚度為20nm左右的病原物也出現(xiàn)萎縮、變形、聚集崩壞現(xiàn)象，曾設(shè)想病原是類(lèi)菌質(zhì)體（Mycoplasma-likeorganism,MLO）（陳作義等,1979a,1979b;陳乃榮等,1981）。1978年，在中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)陽(yáng)朔會(huì)議上，福建省農(nóng)科院柑桔黃龍病研究組報(bào)告了采用超薄切片和電鏡技術(shù)的研究結(jié)果，首次報(bào)道了電鏡下觀察的我國(guó)黃龍病病原的形態(tài)。由于菌體界限膜厚17～33nm，呈波浪狀外形，稱(chēng)之為類(lèi)立克次體（Rickettsia-likeorganisms,RLO）（柯沖等,1979）。隨后通過(guò)指示植物、電鏡觀察和抗生素反應(yīng)（尤其是青霉素）實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)黃龍病的病原既不是真正的病毒（趙學(xué)源等,1979b），也不是類(lèi)菌質(zhì)體，而是一種類(lèi)細(xì)菌的原核生物（趙學(xué)源等,1981），其界限膜似有細(xì)胞壁的性質(zhì)（陳乃榮等,1981）。有稱(chēng)之為類(lèi)立克次體或類(lèi)細(xì)菌（Bacteriumlikeorganism,BLO），也有稱(chēng)之為類(lèi)薄壁菌型細(xì)菌（Gracilicutelikebacterium）（吳世盤(pán)和李劍書(shū),1986;范懷忠等,1986）?？聸_等（1991）應(yīng)用超薄切片與細(xì)胞化學(xué)的方法，對(duì)黃龍病病原形態(tài)和病原細(xì)胞壁進(jìn)行研究，認(rèn)為我國(guó)柑桔黃龍病和印度青果病病原是相同的，同屬于一種革蘭氏陰性細(xì)菌，但它們之間具有不同的血清型。從此，我國(guó)植物病理界統(tǒng)一了對(duì)黃龍病病原性質(zhì)的認(rèn)識(shí)。黃龍病也是國(guó)際柑桔上最重要的一種病害。長(zhǎng)期以來(lái)國(guó)外多稱(chēng)之青果?。℅reeningdisease）。最初認(rèn)為黃龍病的病原是類(lèi)菌原體。后來(lái)，法國(guó)學(xué)者進(jìn)一步對(duì)病原菌體的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及DNA的研究，確認(rèn)黃龍病的病原是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，屬于候選的韌皮部桿菌屬（Candidatusliberibacter）。1995年，在福建省福州市召開(kāi)的第十三屆國(guó)際柑桔病毒學(xué)會(huì)（IOCV）的工作會(huì)議上，全體代表鑒于我國(guó)林孔湘教授證明黃龍病的傳染性比南非的青果病早十年，一致通過(guò)決議，將這一類(lèi)柑桔病害正式稱(chēng)為柑桔黃龍病（Huanglongbing,HLB），國(guó)際上統(tǒng)一了柑桔黃龍病的病名。4.2病原提純與抗體制備在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，利用菟絲子成功地將黃龍病菌從柑桔轉(zhuǎn)到草本植物長(zhǎng)春花上，黃龍病菌能夠得到比在柑桔樹(shù)體內(nèi)更好的生長(zhǎng)與繁殖，菌體濃度較高，為直接從長(zhǎng)春花病株中提純黃龍病病原奠定了基礎(chǔ)（柯穗等,1986;唐偉文和范懷忠,1987）。采用草地菟絲子(CuscutacampestrisYunck)為橋梁，將黃龍病病原從柑桔傳到長(zhǎng)春花（Catharanthusreseus），起初引起長(zhǎng)春花葉脈局部黃斑，后漸擴(kuò)展為全葉黃化，其潛育期為3～6個(gè)月（柯穗等,1986）。通過(guò)草地菟絲子也可將長(zhǎng)春花上的病原回接到柑桔（唐偉文和范懷忠,1987;柯穗等,1988a），但回接成功率低（柯穗等,1988a）。雖然日本菟絲子（CuscutajaponicaChois）在毒源柑桔植株和長(zhǎng)春花上生長(zhǎng)良好，但并不能把黃龍病病原傳到長(zhǎng)春花上，說(shuō)明不同種的菟絲子作為黃龍病病原的傳染媒介具有選擇性（柯穗等,長(zhǎng)春花是草本植物，不僅容易種植，而且其篩管細(xì)胞受黃龍病病原侵染的比例和篩管細(xì)胞內(nèi)所含病原的數(shù)量都比柑桔多，所以長(zhǎng)春花是柑桔黃龍病病原最適宜的草本寄主，是研究黃龍病病原的良好材料（柯穗等,1986）。圖2．健、病長(zhǎng)春花圖3.長(zhǎng)春花病株篩管細(xì)胞內(nèi)病原體（31000X）以發(fā)病長(zhǎng)春花的葉片為材料，黃龍病病原獲得了粗提純（柯穗等,1988b），并制備了小鼠抗腹水，由于所提取病原的濃度和純度較低，該鼠抗腹水效價(jià)低，并伴有非特異反應(yīng)（柯穗等,1989）。李德望等（1992）也以類(lèi)似的方法制備了小鼠抗體IgG，建立了間接ELISA法和間接免疫熒光法，因效價(jià)和靈敏度問(wèn)題難以推廣應(yīng)用。用BLO粗提純物為抗原，篩選到二個(gè)雜交瘤細(xì)胞株(CF1和CF2)能分泌抗黃龍病BLO的單克隆抗體。采用免疫熒光法檢測(cè)，抗體能識(shí)別長(zhǎng)春花和柑桔病株，前者產(chǎn)生強(qiáng)熒光反應(yīng)，后者產(chǎn)生弱熒光反應(yīng)，而長(zhǎng)春花和柑桔健株以及長(zhǎng)春花感染類(lèi)菌原體的病株均不產(chǎn)生熒光反應(yīng)（田亞南等,1998）。4.3病原的分離培養(yǎng)在國(guó)外，柑桔黃龍病病原最早于1985年有人工培養(yǎng)成功的報(bào)道（Garnett,1985），但并未獲得認(rèn)可。中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)分別報(bào)道了柑桔黃龍病菌體外培養(yǎng)獲得成功。趙鴻燕等（1989,1990）將患柑桔黃龍病的柑桔樹(shù)葉片，消毒、勻漿，并經(jīng)細(xì)菌過(guò)濾器抽濾，接種于修改后的培養(yǎng)柑桔青果病病原的培養(yǎng)基，置30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以超薄切片驗(yàn)證培養(yǎng)物，并進(jìn)行抗菌素敏感性試驗(yàn)和生物感染試驗(yàn)。胡勤學(xué)等（1991）采用感染柑桔黃龍病菌的長(zhǎng)春花嫩葉作為外植體，誘導(dǎo)形成愈傷組織，建立類(lèi)細(xì)菌離體培養(yǎng)系統(tǒng)，并認(rèn)為切片觀察到的類(lèi)細(xì)菌不是外植體中有限量的類(lèi)細(xì)菌，而可能是通過(guò)愈傷組織擴(kuò)增后產(chǎn)生的類(lèi)細(xì)菌，還發(fā)現(xiàn)了類(lèi)細(xì)菌類(lèi)似出芽的一種增殖方式。但以上分離培養(yǎng)試驗(yàn)都未經(jīng)柯赫法則（Koch′sPostulate）驗(yàn)證。張景寧等（1994）報(bào)道了以感病柑桔葉脈浸出液，在自配的半合成復(fù)合培養(yǎng)基培養(yǎng)柑桔黃龍病菌獲得成功。分離培養(yǎng)的類(lèi)細(xì)菌以蟲(chóng)傳、針注、剝皮、浸根等方法接種健康的柑桔幼苗，表現(xiàn)出典型的黃龍病癥狀，經(jīng)組織超薄切片的電鏡觀察，證明篩管細(xì)胞存在著病原類(lèi)細(xì)菌。接種發(fā)病的植株再次分離到同樣的類(lèi)細(xì)菌，所得分離物的菌體和菌柄形態(tài)與原分離物完全一致。盡管該分離培養(yǎng)方法一定程度上驗(yàn)證了柯赫法則，也制備了免疫抗血清并用于檢測(cè)診斷（劉仲健等,1993,1999;何平等,1997;張景寧等,1997;廖俊杰等,2005），但存在很大爭(zhēng)議，沒(méi)有獲得廣泛的認(rèn)同。4.4診斷與檢測(cè)柑桔黃龍病的檢測(cè)是一個(gè)從傳統(tǒng)生物學(xué)向分子生物學(xué)、從定性檢測(cè)到定量檢測(cè)的發(fā)展過(guò)程。從觀察病狀，生物鑒定，電鏡與超薄切片技術(shù)，血清反應(yīng)，到PCR（polymerasechainreaction,PCR）反應(yīng)等技術(shù)，對(duì)黃龍病診斷和檢測(cè)的研究，經(jīng)歷了很長(zhǎng)時(shí)間，取得很大的進(jìn)步。目前，使用PCR技術(shù)診斷黃龍病，已達(dá)到快速、準(zhǔn)確的定性與定量的要求。4.4.1田間診斷研究柑桔黃龍病的困難，在于它的病原無(wú)法人工培養(yǎng)?因此，長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)黃龍病的診斷，主要依據(jù)典型的黃梢和葉斑駁癥狀?柑桔感染黃龍病后，全年均可表現(xiàn)癥狀，在田間以夏梢、秋梢發(fā)病最多，其次是春梢。新抽出的病梢，其葉片不能正常轉(zhuǎn)綠，表現(xiàn)均勻黃化或呈斑駁癥狀。這樣癥狀是十分明顯和較為特異的，具有診斷的價(jià)值。目前，主要選擇各個(gè)新梢的成熟期，特別是在每年的10～12月秋梢成熟以后，癥狀表現(xiàn)的最適期間，根據(jù)當(dāng)年秋梢葉片的斑駁癥狀來(lái)診斷田間的黃龍病病樹(shù)，可以達(dá)到相當(dāng)可靠的程度。但是，癥狀的發(fā)展過(guò)程會(huì)受到環(huán)境條件的影響。例如在果園管理不良、營(yíng)養(yǎng)缺乏或其他病蟲(chóng)危害嚴(yán)重的情況下，病樹(shù)若不表現(xiàn)典型癥狀則難以診斷。這也是造成對(duì)黃龍病病原種種混淆看法的一個(gè)主要原因。因此，癥狀診斷必要時(shí)要與鑒別寄主(蘆柑)的生物學(xué)測(cè)定相結(jié)合（田亞南等,1998）。4.4.2指示植物鑒定指示植物鑒定因不需要許多設(shè)備和技術(shù)、方法簡(jiǎn)易可行，是柑桔黃龍病早期主要的鑒定方法。雖然現(xiàn)有的栽培品種對(duì)黃龍病都是高度敏感的，本身就是一種良好的指示植物，但考慮到不同品種發(fā)病癥狀的多樣性和不穩(wěn)定性，對(duì)于一些柑桔新區(qū)來(lái)說(shuō)，為了弄清黃龍病是否確已侵入本區(qū)，對(duì)一些懷疑樹(shù)可用指示植物加以鑒定。常用的指示植物有蘆柑、蕉柑、甜橙等（吳世盤(pán)和錢(qián)菊梅,1988）。蘆柑因顯癥快、癥狀穩(wěn)定被我國(guó)作為柑桔黃龍病的指示植物（張?zhí)祉?2000）。作為鑒定用的指示植物必須采用實(shí)生苗，砧木種子事先用55～56℃溫水處理50min，整個(gè)鑒定過(guò)程都必須在防蟲(chóng)設(shè)備中進(jìn)行。過(guò)去用單個(gè)病芽腹接傳病，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，用含2～3個(gè)（甚至多個(gè)）病芽的枝段嫁接可提高其傳病率（趙學(xué)源等,1982;王芝生和柯沖,1985），潛育期4~12個(gè)月。嫁接接種后，如將指示植物重修剪，每株只剩下2~3片葉，并加強(qiáng)肥水管理，促使新梢發(fā)生，可以大大縮短潛育期，二個(gè)月左右即可發(fā)?。▍鞘辣P(pán)和錢(qián)菊梅,1988）。4.4.3電鏡觀察自1977～1978年間利用電鏡與超薄切片技術(shù)，在柑桔黃龍病病樹(shù)葉片的篩管細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)病原類(lèi)細(xì)菌以來(lái)（柯沖等,1979a,1980b;陳作義等,1979a,1979b,1980），電鏡便成為診斷黃龍病的一個(gè)重要手段。在電鏡下，病原BLO的形態(tài)、大小及菌體的壁膜結(jié)構(gòu)等特征都能觀察得清楚，可以做出正確的診斷。但是，由于柑桔病樹(shù)體內(nèi)BLO濃度較低，分布不均勻以及電鏡制樣采用的葉脈較小等因素的影響，電鏡對(duì)BLO的檢出率偏低，多在60～70％之間。近來(lái)，采用癥狀明顯、老熟的葉片為材料，采用側(cè)脈代替中脈和縱切代替橫切韌皮部制樣，能夠有效地提高電鏡對(duì)BLO的檢出率（田4.4.4血清學(xué)檢測(cè)柑桔黃龍病病原屬于難培菌，僅限于感病柑桔韌皮部篩管細(xì)胞，含量低、分布不均勻，導(dǎo)致抗血清制備艱難。從發(fā)病長(zhǎng)春花粗提純黃龍病病原（柯穗等,1988b），以粗提純黃龍病病原為抗原制備了小鼠抗腹水，由于所提取病原的濃度和純度較低，該鼠抗腹水效價(jià)低，并伴有非特異反應(yīng)，難以推廣應(yīng)用（柯穗等,1989）。隨后的研究表明，以類(lèi)似方法制備的小鼠抗腹水盡管其效價(jià)有了較大提高，能夠比較準(zhǔn)確的檢測(cè)發(fā)病長(zhǎng)春花中的黃龍病病原，但是對(duì)未顯癥或初顯癥柑桔植株，以及部分具典型病狀的柑桔葉片的檢測(cè)并無(wú)血清學(xué)反應(yīng)（李德望等,1992）。有利用國(guó)外機(jī)構(gòu)提供的多克隆抗體成功檢測(cè)柑桔黃龍病病原的報(bào)道（張?zhí)盏?1993）。國(guó)內(nèi)對(duì)柑桔黃龍病單克隆抗體的研制并未獲得滿意的結(jié)果。福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所柑桔黃龍病組曾以柑桔黃龍病菌粗提純物為抗原，篩選到二個(gè)雜交瘤細(xì)胞株(CF1和CF2)能分泌抗黃龍病病原的單克隆抗體。采用免疫熒光法檢測(cè)，抗體能識(shí)別長(zhǎng)春花和柑桔病株，前者產(chǎn)生強(qiáng)熒光反應(yīng)，后者產(chǎn)生弱熒光反應(yīng)，長(zhǎng)春花和柑桔健株以及長(zhǎng)春花感染MLO（植原體）的病株均不產(chǎn)生熒光反應(yīng)（田亞南等,1998）。柑桔黃龍病的單克隆抗體多僅適用于免疫熒光檢測(cè)，尚難用于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA），所以單抗的應(yīng)用受到很大的限制。4.4.5組織化學(xué)診斷主要基于兩個(gè)原理，一是感染黃龍病菌的寄主植物，其韌皮部壞死細(xì)胞群或經(jīng)化學(xué)染色后的愈傷組織，在熒光的激發(fā)下會(huì)形成特殊的熒光而加以診斷。如以透射式熒光顯微鏡觀察，健葉和病葉葉柄切片在熒光的激發(fā)下，木質(zhì)部導(dǎo)管胞壁發(fā)黃色熒光，韌皮纖維發(fā)綠色熒光，但感染黃龍病的病組織切片，在韌皮部中則可看到一到多個(gè)鮮明的黃色或黃綠色熒光團(tuán)塊（壞死細(xì)胞群），但取樣必須是完全老熟的黃化葉片，而且以病秋梢的結(jié)果最穩(wěn)定，嫩梢、嫩葉以及感染黃龍病但尚未表現(xiàn)癥狀的葉片，因未產(chǎn)生壞死細(xì)胞無(wú)法檢測(cè)（吳世盤(pán),1987）；苯胺蘭作為熒光色素染色后，熒光顯微鏡下，病葉切片韌皮部愈傷組織會(huì)發(fā)出明亮的、不正常的黃綠色熒光，其強(qiáng)弱與癥狀有關(guān)，斑駁葉熒光最強(qiáng)，其次為黃化后期缺素狀葉，健葉沒(méi)有或只有稀疏的幾點(diǎn)黃綠色熒光。其準(zhǔn)確性同樣受取樣時(shí)間和取樣部位的影響，以夏梢和秋梢葉片轉(zhuǎn)綠而尚未充分老熟時(shí)取中脈切片染色觀察，準(zhǔn)確性最高（吳世盤(pán)和范懷忠,1988）。二是韌皮部壞死細(xì)胞群或病原菌經(jīng)化學(xué)染色后，能夠使壞死細(xì)胞群或病原菌與柑桔韌皮部篩管細(xì)胞分色，達(dá)到在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行區(qū)分診斷的目的。如番紅染色感染黃龍病的柑桔葉柄切片，顯微鏡下可觀察到韌皮部出現(xiàn)特有的紅色團(tuán)塊，這種特征性紅色團(tuán)塊可以作為鑒定黃龍病的依據(jù)（吳世盤(pán)和范懷忠,1987）；以FBA法浸染新梢主脈或嫩莖切片，能使病原體與柑桔韌皮部篩管細(xì)胞分色，光學(xué)顯微鏡下可觀察到病原的形態(tài)（林尤劍和高日霞,1990）。顯微鏡觀察法方便直觀，但易受取樣部位、取樣時(shí)期和制樣方法(切片厚度等)的限制，容易造成漏檢，實(shí)際生產(chǎn)中少有采用。4.4.6生化指標(biāo)診斷用聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）分析柑桔蛋白質(zhì)種類(lèi)上的差異，感染黃龍病的病株中，存在一種健株所沒(méi)有的特異性蛋白質(zhì)，這種差異蛋白質(zhì)與供試柑桔種類(lèi)和癥狀嚴(yán)重度無(wú)關(guān)，也不存在于類(lèi)似黃龍病癥狀的生理性病株中（陳肇春和李德葆,1987）。因此，可憑借特異性蛋白的有無(wú)加以診斷。貢柑的黃龍病病株果實(shí)同工酶缺少Rf=0.24的主酶帶，可能是貢柑感染黃龍病早期檢測(cè)的生化指標(biāo)(吉前華等,2007)。4.4.7PCR檢測(cè)1991年Weisburg等首次成功擴(kuò)增并測(cè)定了柑桔黃龍病菌的16SrDNA（16SribosomalDNAs,16SrDNA）序列，DNA雜交和PCR方法檢測(cè)柑桔黃龍病菌的分子生物學(xué)技術(shù)得以迅速發(fā)展。由于PCR檢測(cè)具有靈敏、快速、便捷等特點(diǎn)，已成為柑桔黃龍病菌檢測(cè)的主流技術(shù)。黃龍病亞洲種分布最廣，我國(guó)至今尚未有黃龍病非洲種或美洲種的報(bào)道，所以檢測(cè)的靶標(biāo)是黃龍病亞洲種，其PCR引物也就以黃龍病亞洲種細(xì)菌的已知序列為模板加以設(shè)計(jì)，主要是16SrDNA和操縱子序列。因檢測(cè)的要求不同，研究者建立了一系列的PCR檢測(cè)方法，如常規(guī)PCR、巢式（或半巢式）PCR、多重PCR、以及能對(duì)黃龍病病菌進(jìn)行定量的Q-PCR（競(jìng)爭(zhēng)性定量PCR）和實(shí)時(shí)熒光PCR（Real-timeFluorescentPCR）等。對(duì)于癥狀典型的黃龍病病株，用常規(guī)PCR就能加以檢測(cè)。因其對(duì)設(shè)備和技術(shù)要求不高，一般的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室都可開(kāi)展，應(yīng)用也最為普遍（田亞南等,2000;孔維文等,2000;賀紅,2005;孟幼青等,2006a,2006b;孟祥春等,2006,2007;劉柏玲等,2006;廖祥六等,2007;王紅等,2007;Dengetal.,2007）。由于黃龍病菌在柑桔病株中含量低、分布不均勻，以及柑桔中含有大量的PCR抑制物，導(dǎo)致常規(guī)PCR的檢測(cè)靈敏度不高而出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。甚至在同樣的反應(yīng)體系下，因所用PCR引物的差異，其檢測(cè)靈敏度也有很大差別，有的可達(dá)近千倍。因此，按照不同目的選擇合適的檢測(cè)引物非常重要，特別是當(dāng)待測(cè)樣品中的黃龍病菌濃度極低時(shí)，應(yīng)選擇高靈敏度的小片段特異性引物（丁芳等,2007）。巢式（或半巢式）PCR檢測(cè)靈敏度比常規(guī)PCR有明顯的提高(鄧曉玲等,1996,1998;丁芳等,2004;Dingetal.,2005)，能檢出單頭葉蟬和尚未顯癥植株中的黃龍病菌（李韜和柯沖,2002;Hungetal.,2004）。當(dāng)然，通過(guò)提高引物的特異性和優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系，也有采用常規(guī)PCR技術(shù)檢測(cè)已帶病但尚未顯癥的柑桔黃龍病病株的報(bào)道（(鄧曉玲等,1999）。柑桔經(jīng)常受黃龍病菌、柑桔裂皮類(lèi)病毒（Citrusexocortisviroid，CEVd）、柑桔衰退病病毒（Citrustristezavirus，CTV）等2種或3種病原的復(fù)合侵染（吳如健和柯沖,2000），利用多重(RT-)PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)可大大提高檢測(cè)速度（鄒敏等,2005;丁芳等,2006）。由于PCR反應(yīng)的特殊性，多重PCR反應(yīng)要優(yōu)先考慮退火溫度高的引物，其所需濃度要大于相應(yīng)退火溫度低的引物（肖遠(yuǎn)輝等,2006）。Q-PCR技術(shù)檢測(cè)柑桔黃龍病菌國(guó)內(nèi)報(bào)道不多。在系列試管中，已知濃度的競(jìng)爭(zhēng)物和等量病原DNA在同一試管內(nèi)進(jìn)行PCR，彼此競(jìng)爭(zhēng)PCR引物和其他反應(yīng)底物。結(jié)果競(jìng)爭(zhēng)物和病原DNA的PCR產(chǎn)物比值與競(jìng)爭(zhēng)物初始濃度呈反向線性相關(guān)。當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)物初始濃度已知時(shí)，通過(guò)反向線性相關(guān)曲線，可以推算出每一試管中相對(duì)病原DNA濃度，結(jié)果表明蟲(chóng)媒柑桔木虱含量最高，長(zhǎng)春花次之，而柑桔最少（田亞南等,1996,1998）。該法操作相對(duì)復(fù)雜，已被實(shí)時(shí)熒光PCR方法所取代。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)具有快速、特異、敏感、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用（廖曉蘭等,2004;胡浩等,2006;Wangetal.,2006）。4.5柑桔黃龍病病原分化柑桔黃龍病病原是一種限于韌皮部?jī)?nèi)寄生的革蘭氏陰性細(xì)菌。由于它尚無(wú)法人工培養(yǎng)，其營(yíng)養(yǎng)需求、胞壁成分和基因組成等方面的資訊甚為缺乏，造成分類(lèi)研究上的困難。柑桔黃龍病的病原屬于變形菌門(mén)（Proteobacteria），α-變形菌綱（Alphaproteobacterial），根瘤菌目（Rhizobiales），根瘤菌科（Rhizobiaceae），候選的韌皮部桿菌屬（Candidatusliberibacter）（Jagoueixetal.,1994）。根據(jù)病原16SrDNA和β-操縱子基因的序列特征，以及傳病媒介和病原性質(zhì)，柑桔黃龍病菌分為亞洲種、非洲種和美洲種（Texeiraetal.,2005）。其中，黃龍病亞洲種分布最廣，危害最大。A．黃龍病亞洲種主要分布于亞洲（西起阿拉伯半島，南亞，東南亞，東亞至日本南部島嶼），非洲大陸東南印度洋島嶼，南美洲（巴西）和北美洲（美國(guó)）以及大洋洲（巴布亞新幾內(nèi)亞）的廣大地區(qū)。本病屬耐熱型，在25～35℃氣溫下病狀明顯。傳病昆蟲(chóng)是柑桔木虱（Diaphorinacitri），病原稱(chēng)CandidatusLiberibacterasiaticus。B．黃龍病非洲種主要分布于非洲的撒哈拉沙漠以南地區(qū)、東南印度洋島嶼及亞洲的阿拉伯半島等地。本病屬于熱敏感型,在20～25℃氣溫下病狀明顯。傳病昆蟲(chóng)是非洲木虱（Triozaerytreae），病原稱(chēng)Ca.L.africanusC．黃龍病美洲種是2004年3月由巴西與法國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)的。它僅分布于南美洲巴西圣保羅州柑桔產(chǎn)區(qū)，病原被鑒定為Ca.L.americanus。傳病昆蟲(chóng)是柑桔木虱（Diaphorinacitri），已存在于巴西地區(qū)多年。他們?cè)谠摰貐^(qū)同時(shí)發(fā)現(xiàn)少數(shù)柑桔樹(shù)感染亞洲種黃龍病，并有極少數(shù)兩種病原混合感染的現(xiàn)象。圖4.世界柑桔黃龍病的分布我國(guó)為黃龍病亞洲種的發(fā)源地，受其危害亦最為嚴(yán)重，迄今尚未有受非洲種和美洲種危害的報(bào)道。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)我國(guó)柑桔黃龍病菌的分化問(wèn)題進(jìn)行了初步研究，總體上并沒(méi)有突破黃龍病亞洲種“種”的屬性，但部分已存在種內(nèi)分化。廖曉蘭等（2004）克隆并測(cè)定了福建廈門(mén)柑桔黃龍病菌16SrDNA基因全序列（1167bp），經(jīng)同源性比較，與日本沖繩（GenBank登錄號(hào)AB008366）、印度浦那（L22532）和非洲種（L22533）柑桔黃龍病菌相應(yīng)序列同源性分別為99.8%、98.7%和97.3%，表明福建廈門(mén)柑桔黃龍病菌屬于亞洲種。將我國(guó)柑桔主產(chǎn)區(qū)、泰國(guó)和法國(guó)留尼灣等8個(gè)地方的柑桔黃龍病亞洲種病原進(jìn)行PCR-SSCP分析，所擴(kuò)增的16SrDNA部分基因片段泳動(dòng)速率一致，揭示所分析的柑桔黃龍病亞洲種病原擴(kuò)增的DNA片段之間沒(méi)有差異（劉利華等,2005）。擴(kuò)增引起沙田柚斑駁癥狀的黃龍病病菌部分β-操縱子和16SrDNA基因，經(jīng)序列測(cè)定與多重比對(duì)，其與亞洲柑桔黃龍病菌相應(yīng)序列的同源性均為99％，無(wú)明顯變異(單振菊等,2005;馮震等,2006)。分析引起文旦柚斑駁癥狀的黃龍病菌16SrDNA、β-操縱子以及外膜蛋白（outermembraneprotein）基因的結(jié)果也顯示，文旦柚上的黃龍病菌仍為柑桔黃龍病亞洲種（Dengetal.,2008）。對(duì)來(lái)自7省區(qū)不同寄主上的黃龍病病原16SrDNA基因區(qū)PCR-RFLP-SSCP分析顯示，7省區(qū)不同寄主上9個(gè)黃龍病病原菌分離物的16SrDNA無(wú)可見(jiàn)變異，序列測(cè)定與多重比對(duì)結(jié)果也表明在不同的地域?寄主內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)分子變異(丁芳等,2008)?引起琯溪蜜油葉片斑駁的柑桔黃龍病，其病原與亞洲柑桔黃龍病病原相應(yīng)序列同源率僅為94.2%，而從柑桔病樹(shù)分離的病原與亞洲柑桔黃龍病病原間的序列同源性更高，均在98%以上（田亞南等,2002），說(shuō)明已存在種內(nèi)分化。對(duì)采集于廣東、廣西、貴州、福建、云南5省區(qū)的8個(gè)柑桔黃龍病樣品，經(jīng)序列同源性分析和聚類(lèi)分析，我國(guó)南方5省區(qū)的柑桔黃龍病病原16SrDNA的序列與亞洲種（L22532）的同源性為96.9％～98.6％，與非洲種（L22533）的同源性為94.5％～97.1％，與美洲種（AY742824）的同源性為92.5％～94.2％，表明我國(guó)南方5省區(qū)柑桔黃龍病菌均屬于亞洲種，但在亞洲種內(nèi)部不同地區(qū)的黃龍病病原也發(fā)生了微小的變異(單振菊等,2008)。5柑桔黃龍病傳播途徑與病害流行5.1柑桔黃龍病傳播途徑黃龍病可通過(guò)嫁接傳病，病接穗和病苗的傳運(yùn)是該病遠(yuǎn)距離傳播的主要途徑（趙學(xué)源,2004）。不同時(shí)期、不同組織嫁接傳病的效率存在差異。5～7月份嫁接的苗木基本不發(fā)病，單芽枝段傳病率最高，其次是無(wú)芽枝段，葉碎片可以傳病，而枝皮的傳病率很低，甚至不傳?。ㄚw學(xué)源等,1982）。隨后的研究還表明，多芽枝段的傳病率又比單芽枝段更高（王芝生和柯沖,1985）。除韌皮部外，柑桔木質(zhì)部也可傳播黃龍病病原，盡管其傳病率極低，潛育期很長(zhǎng)（吳世盤(pán)和李劍書(shū),1986;柯沖等,1989），有時(shí)在木質(zhì)部細(xì)胞（吳世盤(pán)和李劍書(shū),1986）和髓部組織細(xì)胞還發(fā)現(xiàn)病原菌（林尤劍和高日霞,1990）。未獲得柑桔種子傳病的證據(jù)（柯沖等,1989）。柑桔黃龍病除通過(guò)嫁接傳染外，還可以通過(guò)柑桔木虱（Diaphorinacitri）進(jìn)行傳播（華南農(nóng)學(xué)院植保系植病教研組,1977），以致在病區(qū)新植的果園往往8～10年內(nèi)全園果樹(shù)感病毀滅。汕頭地區(qū)柑農(nóng)稱(chēng)柑桔一代為10年便由此而來(lái)。電鏡觀察帶“毒”木虱的結(jié)果表明，木虱唾液腺細(xì)胞中可見(jiàn)圓形或橢圓形的類(lèi)細(xì)菌體（戴月明等,1982），證實(shí)柑桔木虱傳播黃龍病的蟲(chóng)媒性質(zhì)（陳乃榮等,1981）。后續(xù)的研究還發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌體在木虱體內(nèi)分布較廣，蟲(chóng)體主唾腺和消化道濾室（黃炳超等,1985）、以及唾液腺周?chē)闹倔w、中腸和后腸的細(xì)胞內(nèi)均能觀察到病原，尤以唾液腺外皮層和中腸細(xì)胞病原密度最大（許長(zhǎng)藩等,1985），推測(cè)病原有可能在這些地方增殖（許長(zhǎng)藩等,1988b）。木虱的口器吸取柑桔病樹(shù)葉片的液汁時(shí)，病原體隨食物流經(jīng)消化道、體液到唾液腺。獲“毒”飼育后3天的木虱唾液腺內(nèi)可以找到病原體，說(shuō)明3天內(nèi)病原便可從成蟲(chóng)的口器經(jīng)消化道和血腔循回到唾液腺內(nèi)（許長(zhǎng)藩等,1990）。由于黃龍病病原體能在木虱體內(nèi)繁殖，所以木虱一旦茯得病原體后能終身傳病，屬于持久性傳染的機(jī)制。病原在蟲(chóng)體內(nèi)循回期的長(zhǎng)短及其持續(xù)傳染時(shí)間是木虱傳病效率高低的重要標(biāo)志。黃龍病病原在木虱成蟲(chóng)體內(nèi)的循回期長(zhǎng)短不一，短的為3天或少于3天，長(zhǎng)的26～27天（許長(zhǎng)藩等,1990）。木虱傳病潛育期一般為2～8個(gè)月（陳循淵等,1986），甚至5年（許長(zhǎng)藩等,1985）。集團(tuán)或單個(gè)木虱成蟲(chóng)均能傳病。用一年生苗木進(jìn)行帶菌木虱接種，每苗每次接蟲(chóng)20～30只或多次重接，其發(fā)病率是很低的，但用一個(gè)月苗齡（三片葉）的小苗，進(jìn)行單蟲(chóng)接種能茯得十分高的發(fā)病率。4～5齡若蟲(chóng)會(huì)傳病，高齡若蟲(chóng)攜帶的病原會(huì)傳到成蟲(chóng)并終身攜帶病原，能間斷傳染多株實(shí)驗(yàn)苗，但不經(jīng)卵傳播（許長(zhǎng)藩等,1990）。帶“毒”成蟲(chóng)在柑桔苗上取食5小時(shí)以上會(huì)傳?。ㄔS長(zhǎng)藩等,1988b）。獲毒飼育成蟲(chóng)和從帶毒若蟲(chóng)羽化的成蟲(chóng)均能在短時(shí)間內(nèi)獲毒傳病，說(shuō)明木虱成蟲(chóng)在田間自然傳播黃龍病病原的效率相當(dāng)高（許長(zhǎng)藩等,1990）。圖5.木虱傳病示意圖5.2柑桔黃龍病流行與蔓延病害的蔓延與流行，取決于傳染源的多寡與重復(fù)侵染頻率的高低。這與侵染源密度，帶菌木虱密度，木虱活動(dòng)力，木虱天敵以及氣象等因素有密切關(guān)系。黃龍病的傳染源主要是病株，病苗木，病接穗，帶菌木虱和野生寄主病株。研究表明，有傳染源存在的情況下，黃龍病的流行區(qū)和柑桔木虱分布大體上是一致的（趙學(xué)源等,1979a），蟲(chóng)口密度與發(fā)病多少呈正相關(guān)（吳定堯,柑桔木虱在自然界的寄主植物有柑桔類(lèi)和九里香(Murrayapaniculata)、黃皮(Clausenalansium)等十多種蕓香科植物。在浙南和福州地區(qū)，木虱在柑桔上1年發(fā)生6～7代（謝佩華等,1989;許長(zhǎng)藩等,1994），九里香上為9～11代（許長(zhǎng)藩等,1994），華南地區(qū)柑桔上1年發(fā)生8～10代（戴月明等,1982），主要以成蟲(chóng)越冬（陳循淵和廖長(zhǎng)青,1982），在冬季溫暖地區(qū)也會(huì)以卵越冬。木虱雌成蟲(chóng)具有選擇寄主嫩梢產(chǎn)卵的習(xí)性，若蟲(chóng)聚集新梢為害。感染黃龍病的病樹(shù)梢次多而亂，會(huì)引誘大量木虱前來(lái)取食、產(chǎn)卵繁殖，形成大量的帶菌木虱。幼年柑桔樹(shù)梢次多、梢勢(shì)旺，極易吸引木虱前來(lái)取食，增加了被感染的幾率。所以，外來(lái)帶菌木虱的侵入時(shí)空，是威脅新果園發(fā)病遲早與經(jīng)濟(jì)壽命長(zhǎng)短的最重要因素，卻是一個(gè)最不確定的變數(shù)。在一般情況下，果園的黃龍病發(fā)病率達(dá)到5%以上時(shí)，往往在3～5年內(nèi)會(huì)迅速蔓延，造成果園被毀，經(jīng)濟(jì)壽命僅8～11年。此外，還可能造成鄰近新植果園早期感染，產(chǎn)生“后種先死，先種后死”的惡性傳染與流行現(xiàn)象。黃龍病主要集中在秋季的原因，一方面是秋季氣溫比較適合黃龍病亞洲種發(fā)病，另一方面可能是由于柑桔木虱在仲夏大發(fā)生，田間擴(kuò)散傳病，使被感染的柑桔樹(shù)經(jīng)過(guò)半年左右的潛育期，到秋季大發(fā)病的結(jié)果（許長(zhǎng)藩等,1992）。6柑桔黃龍病防控技術(shù)治理黃龍病是我國(guó)柑桔產(chǎn)業(yè)發(fā)展中最重要的問(wèn)題。在我國(guó)廣泛存在黃龍病和木虱的柑桔產(chǎn)區(qū)，特別南方產(chǎn)區(qū)，在尚無(wú)理想的殺病原農(nóng)藥和抗病良種的情況下，治理黃龍病成為一個(gè)最需要大力探索的難題。6.1防控策略柑桔為多年生木本植物，對(duì)柑桔黃龍病目前尚無(wú)抗性品種的報(bào)道。柑桔一旦被黃龍病菌感染不僅無(wú)法治愈，而且將成為新的傳染源，在田間柑桔木虱的取食傳播下，使其它健樹(shù)受到感染，導(dǎo)致黃龍病的大爆發(fā)。因此，林孔湘教授提出“隔離、消毒、防疫”的觀點(diǎn)，對(duì)柑桔黃龍病采用健康栽培的“綜合防治”措施加以防控。柑桔黃龍病是一種傳染性病害，種苗和柑桔木虱是其主要的傳染途徑。在種苗帶病和田間存在病株的情況下，如果治蟲(chóng)不力，田間發(fā)生木虱，就有可能引起黃龍病流行。反之，種苗無(wú)病，田間不殘留病株和治蟲(chóng)得力，田間基本無(wú)木虱危害，或者在田間無(wú)病株和無(wú)木虱危害兩項(xiàng)中做到其中一項(xiàng)，就有可能控制住黃龍病的危害。這就是實(shí)施“綜合防治”計(jì)劃的主要依據(jù)（許長(zhǎng)藩等,1993）。對(duì)疫區(qū)病果園，首先進(jìn)行經(jīng)濟(jì)與病情評(píng)估。有經(jīng)濟(jì)效益的、黃龍病發(fā)病率在10%以下的病園，嚴(yán)格挖除全部病樹(shù)，同時(shí)加強(qiáng)化學(xué)防治木虱；發(fā)病率10%以上的病園，對(duì)有生產(chǎn)價(jià)值的病樹(shù)采取不挖掉，只修剪病枝，爭(zhēng)取在病園改造中增多些收入。對(duì)于非疫區(qū)新果園，按照健康栽培的觀點(diǎn)嚴(yán)格實(shí)施。做到園地選擇要注重“隔離”原則，果苗選擇要注重“無(wú)病”原則，果園健康情況要定期檢查，果園管理措施要嚴(yán)格執(zhí)行（柯沖,2001）。6.2防控措施6.2.1強(qiáng)化檢疫對(duì)于尚未發(fā)生柑桔黃龍病的地區(qū)，采用檢疫手段防止病害的傳入最為經(jīng)濟(jì)有效。柑桔種苗是除柑桔木虱之外傳染黃龍病的另一個(gè)重要途徑。大力推廣種植無(wú)病苗，不僅可以保護(hù)新區(qū)不發(fā)生黃龍病，而且可以降低或消滅舊病區(qū)新果園的發(fā)病中心，減輕危害，是綜合防治中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)（林先沾等,1985）。因此，對(duì)于內(nèi)檢部門(mén)，應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行檢疫制度，加強(qiáng)產(chǎn)地檢疫，清理不符合實(shí)際標(biāo)準(zhǔn)的苗圃、嚴(yán)禁病苗或帶病接穗的流通，對(duì)非疫區(qū)實(shí)行保護(hù)，防止“病從苗入”。目前柑桔商品苗木生產(chǎn)問(wèn)題十分突出，品種混雜，帶黃龍病等危險(xiǎn)性病害率高。所以對(duì)苗木商品生產(chǎn)要立“法”，保證苗木按規(guī)定的操作技術(shù)繁育和保證質(zhì)量。各省根據(jù)柑桔區(qū)域計(jì)劃的要求，建立一個(gè)省級(jí)無(wú)病中心采穗母本園，幾個(gè)市、縣級(jí)無(wú)病采穗母本園和若干個(gè)注冊(cè)苗圃。省級(jí)無(wú)病中心采穗母本園負(fù)責(zé)向市、縣級(jí)無(wú)病采穗母本園提供建園的無(wú)病基礎(chǔ)苗。注冊(cè)苗圃必須經(jīng)過(guò)省級(jí)農(nóng)業(yè)主管部門(mén)審查批準(zhǔn)，接穗由無(wú)病母本園供應(yīng)，在技術(shù)部門(mén)監(jiān)督下進(jìn)行育苗，才能保證苗木的純度、質(zhì)量和無(wú)病（林先沾等,1986）。對(duì)于外檢部門(mén)，應(yīng)加強(qiáng)口岸檢疫，防止黃龍病非洲種、美洲種及其變異株系以及相應(yīng)的媒介昆蟲(chóng)傳入我國(guó)造成新的危害。農(nóng)業(yè)科研部門(mén)則需積極研制快速、靈敏、穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)體系供檢疫部門(mén)使用，密切合作，將可能的威脅拒之于國(guó)門(mén)之外。6.2.2園地選擇要注重“隔離”原則。無(wú)病苗在隔離環(huán)境條件下種植和嚴(yán)格防止傳染的措施是果園成敗的關(guān)鍵。園地既要遠(yuǎn)離病果園，最好還有天然屏障如高山、大洋能與病果園相隔離，又要清除園地內(nèi)可能攜帶病原及其蟲(chóng)媒的野生寄主。隔離條件好壞是嫁接性病害發(fā)生與否的關(guān)鍵。在種植無(wú)病苗的果園內(nèi)，病害的發(fā)生主要是由于蟲(chóng)媒的侵入。所以,只有無(wú)蟲(chóng)媒的環(huán)境，才是絕對(duì)可靠的隔離環(huán)境，才可保證無(wú)病苗不發(fā)生病害（柯沖,2001）。6.2.3培育和推廣使用無(wú)病苗木種植無(wú)病苗是綜合防治措施中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。苗木不僅要品種對(duì)路，品質(zhì)優(yōu)良，還要健壯，不帶黃龍病，衰退病，裂皮病和碎葉病等四種嫁接傳染性病原?！案綦x、消毒、防疫”的綜合性措施是培育柑桔無(wú)病良種苗木缺一不可的三個(gè)重要條件。砧木的選育在福建地區(qū)，柑桔的砧木主要是福桔和枳殼，福桔砧能抗裂皮病和碎葉病，但由于無(wú)病苗本身不帶裂皮病和碎葉病，又無(wú)傳病蟲(chóng)媒，而且枳殼砧又比福桔砧耐寒，所以在福建地區(qū)，特別是寒冷的北部和東部產(chǎn)區(qū)，無(wú)病苗的砧木應(yīng)采用枳殼最為適宜（柯沖,2001）。將選取的砧木種子經(jīng)55～56℃處理50min，不僅可消滅種子內(nèi)部和外部附著的病原，還可使苗木生長(zhǎng)整齊而健壯（周友智,1984），將處理后的種子播種于隔離地帶或防蟲(chóng)網(wǎng)室中供嫁接使用。因尚無(wú)獲得柑桔黃龍病菌能通過(guò)種子傳播的證據(jù)，如果僅從脫除黃龍病菌而言，育苗使用的砧木種子可以直接播種，不必要應(yīng)用熱水或其它方法的消“毒”處理（柯沖等,1989）。接穗的選擇與處理從外觀健康、優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)的母樹(shù)上采集接穗，經(jīng)濕熱空氣（47～49℃、50min）、四環(huán)素（1000ppm、2h）、濕熱空氣和四環(huán)素復(fù)合或莖尖微芽嫁接方法脫“毒”處理，供嫁接使用。經(jīng)上述處理的接穗嫁接在其種子經(jīng)熱水處理（55～56℃、50min）的砧木上育成的嫁接苗，可能獲得部分無(wú)黃龍病和衰退病的苗木（林先沾和柯沖,1985,1986）。因?yàn)?，四環(huán)素處理不能100％脫除黃龍病，濕熱空氣與四環(huán)素復(fù)合處理不能脫除衰退病和裂皮病。莖尖微芽嫁接的方法能100％脫除黃龍?。愸o等,1987,1988;宋瑞琳等,1990,1999），對(duì)衰退病、裂皮病都有較好效果。將預(yù)熱處理（40℃/30℃，晝16h/夜8h）和莖尖微芽嫁接相結(jié)合的方法脫除碎葉病毒，能獲得理想效果（宋瑞琳等,1999）。經(jīng)濕熱空氣處理的接穗，其嫁接成活率低。采用熱水間歇消毒（駱學(xué)海,1983）、熱四環(huán)素處理（羅志達(dá),1991）或通過(guò)接穗留葉柄和處理時(shí)接穗倒置可顯著提高成活率（周友智,1984）。通過(guò)嫁接前在接口處滴加一定濃度的激動(dòng)素或玉米素（宋瑞琳等,1990），或改進(jìn)切口的方法，可明顯提高嫁接成活率（姜玲等,1995）。隨后的研究還發(fā)現(xiàn)，利用50℃濕熱空氣、相對(duì)濕度95％處理苗木60min，促使其抽出新梢，再利用新梢莖尖進(jìn)行微芽嫁接，既能脫毒又可明顯提高嫁接成活率（譚祖國(guó)等,1996）。最近的研究表明，采用玻璃化冷凍法（vitrification-cryopreservation）可以高效脫除柑桔黃龍病菌，其脫除率可達(dá)98.1％以上（Dingetal.,2008）。無(wú)病苗木的培育與鑒定對(duì)于柑桔黃龍病的老病區(qū)，在無(wú)法獲得完全地理隔離條件育苗的情況下，也可采用防蟲(chóng)網(wǎng)棚培育柑桔無(wú)病苗，該方法已在廣西推廣(葉偉其等,2005)，有些主產(chǎn)區(qū)還建起了自己的無(wú)病苗圃(莫健生等,2007)。通過(guò)上述方法育成的苗木，還需經(jīng)生物學(xué)測(cè)定、血清學(xué)測(cè)定和電鏡檢查的鑒定證明是可靠無(wú)病的，方可作為無(wú)病基礎(chǔ)苗，用于建立無(wú)病母本園，再?gòu)臒o(wú)病母本樹(shù)采穗繁育無(wú)病苗，供新區(qū)種植。四環(huán)素1000ppm、2h處理直接育成的無(wú)病苗，可作為二級(jí)苗在老區(qū)推廣（林先沾和柯沖,1985,1986）。6.2.4果園健康情況要定期檢查，建立檢查制度。盡管通過(guò)使用鹽酸四環(huán)素或青霉素G高壓注射柑桔病樹(shù)有一定的治療效果，病樹(shù)的病狀會(huì)產(chǎn)生暫時(shí)的消失，但1～2年后又重新表現(xiàn)和加劇，不能根治（柯沖和王芝生,1988）。因此，對(duì)于田間病樹(shù)要及時(shí)挖除，以免成為新的傳染源。在快速檢測(cè)技術(shù)尚未在田間應(yīng)用之前，在每年病株表現(xiàn)最明顯的10～12月間，檢查果園，依據(jù)斑駁病狀進(jìn)行診斷，及時(shí)處理重病、放棄、失管果園以及病樹(shù)（柯沖,1996）。由于黃龍病的病樹(shù)既是傳染源，又是木虱茯得病原體的主要場(chǎng)所，所以果園一旦發(fā)現(xiàn)黃龍病，挖病樹(shù)和治木虱兩項(xiàng)重要措施必需密切結(jié)合進(jìn)行。病樹(shù)先噴藥，后挖除，防止木虱遷移傳染。缺株不宜補(bǔ)種，以防發(fā)生“后種先死，先種后死”的惡性傳染（但可考慮種植其他果樹(shù)）（柯沖,1979b）。6.2.5控制柑桔木虱是柑桔黃龍病綜合防治最重要的技術(shù)措施。利用寄生蜂防治木虱，在非洲法屬留尼旺島（Reunion）取得很好的結(jié)果（夏雨華1988）。木虱的寄生蜂主要為姬小蜂（Tamarixiaradiata,營(yíng)外寄生）和跳小蜂(Diaphorencyrtusaligarhensis,營(yíng)內(nèi)寄生)，但是在我國(guó)福建等地，由于木虱有多種重寄生蜂危害，應(yīng)用寄生蜂防治木虱的效果不大。柑桔木虱寄生菌在田間的發(fā)生不普遍，在自然界沒(méi)有抑制木虱繁殖的能力。謝佩華等（1988）從柑桔木虱的多種寄生菌中，分離出致病性較強(qiáng)的蠟蚧頭孢菌（CephalosphoriumlecaniiZimm）。室內(nèi)測(cè)驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌在相對(duì)濕度90～98％條件下，致病率可高達(dá)98％以上。在室外籠養(yǎng)試驗(yàn)，蠟蚧頭孢菌只有在陰雨季節(jié)，相對(duì)濕度90％以上時(shí)，對(duì)木虱成蟲(chóng)、若蟲(chóng)的致病率可達(dá)80～100％，但在晴天干旱的條件下則不發(fā)病。采用目測(cè)與黃板檢測(cè)，監(jiān)測(cè)木虱的種群變動(dòng)，指導(dǎo)和加強(qiáng)化學(xué)防治。每次新梢在新葉始見(jiàn)時(shí)噴藥一次，10天后再?lài)娨淮?，冬季清園要噴藥1～2次。防治其他害蟲(chóng)時(shí)，要兼治木虱。因柑桔木虱成蟲(chóng)的高效傳病性、近距離擴(kuò)散性、終生帶毒性和快速傳病性，決定了用來(lái)防治柑桔木虱成蟲(chóng)的農(nóng)藥要求速效性好、防效高（鄧明學(xué)和石曉雨,2007）。治蟲(chóng)要求在生態(tài)區(qū)內(nèi)實(shí)行聯(lián)防，統(tǒng)一噴藥計(jì)劃。由于獲“毒”飼育成蟲(chóng)和從帶毒若蟲(chóng)羽化的成蟲(chóng)均能在短時(shí)間內(nèi)獲毒傳病，說(shuō)明木虱成蟲(chóng)在田間自然傳播黃龍病病原的效率相當(dāng)高。而且卵及若蟲(chóng)比成蟲(chóng)更為群聚，更易于防治，因此治蟲(chóng)防病的重點(diǎn)應(yīng)放在防治木虱的卵和若蟲(chóng)上（許長(zhǎng)藩等,1990）。最近，有采用煙霧機(jī)防治柑桔木虱取得成功的報(bào)道（錢(qián)開(kāi)勝,2007）。由于我國(guó)柑桔栽培區(qū)冬季氣溫轉(zhuǎn)暖，木虱種群變大，其地理分布明顯北移（周啟明等,1989），發(fā)生范圍進(jìn)一步擴(kuò)大（林云彪和王映雪,1998;孟幼青等,2005），多數(shù)年份能在新的寄生地完成世代發(fā)育（王洪祥等,2001）。因此，對(duì)柑桔黃龍病的防控提出了更為嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。6.2.6加強(qiáng)果園管理在切實(shí)做好防止病害蔓延的前提下，加強(qiáng)果園管理。創(chuàng)造柑桔生長(zhǎng)的優(yōu)良農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，并綜合而巧妙地對(duì)各項(xiàng)措施加以運(yùn)用，可以做到新果園不發(fā)生或少發(fā)生黃龍病、老果園黃龍病發(fā)生率逐年下降的效果（柯沖,1996）。實(shí)踐證明，上述六項(xiàng)措施的綜合運(yùn)用，是目前防治柑桔黃龍病最有效而又切實(shí)可行的辦法（吳如健等,1994;許長(zhǎng)藩等,1998a），只有這樣才能控制病害的蔓延，達(dá)到保持果園健康和延長(zhǎng)果園經(jīng)濟(jì)壽命，把柑桔黃龍病的危害減少到最低限度。7結(jié)尾語(yǔ)從林孔湘教授證明柑桔黃龍病的傳染性以來(lái)，我國(guó)對(duì)柑桔黃龍病的研究已愈半個(gè)多世紀(jì)，雖然通過(guò)綜合防治技術(shù)措施能夠限制病害的傳播和蔓延，但在尚無(wú)理想的殺病原農(nóng)藥和抗病良種的情況下，治理黃龍病仍是一個(gè)最需要大力探索的難題。這也是我們研究柑桔黃龍病的出發(fā)點(diǎn)和歸宿。鑒于柑桔黃龍病菌的難培養(yǎng)特性，在以常規(guī)方式進(jìn)行藥劑篩選及防治研究已顯得舉步維艱的情形下，借助現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，探討柑桔樹(shù)體和黃龍病菌的互作機(jī)制，揭示黃龍病菌的致病機(jī)理，通過(guò)導(dǎo)入外源基因、培育和篩選抗病品種等方法，將有助于柑桔黃龍病問(wèn)題的最終解決。主要參考文獻(xiàn)Bové,JM.Invitedreview,huanglongbing:adestructive,newly-emerging,century-olddiseaseofcitrus.JournalofPlantPathology,2006,88(1),7-37.DengX,ChenJ,FengZ,ShanZ,GuoH,ZhuJ,LiH,CiveroloEL.IdentificationandCharacterizationoftheHuanglongbingBacteriuminPummelofromMultipleLocationsinGuangdong,P.R.China.PlantDisease,2008,92(1).DengX,ZhouG,LiH,ChenJ,CiveroloEL.DetectionofCandidatusLiberibacterasiaticusfromwampee(ClausenalansiumSkeels)bynestedPCR.Online.PlantHealthProgress,2007,doi:10.1094/PHP-2007-0419-01-BR.DingF,JinS,HongN,ZhongY,CaoQ,YiG,WangG.Vitrification–cryopreservation,anefficientmethodforeliminatingCandidatusLiberobacterasiaticus,thecitrusHuanglongbingpathogen,frominvitroadultshoottips.PlantCellReports,2008,27(2).DingF,WangG,YiG,ZhongY,ZengJ,ZhouB.Infectionofwampeeandlemonbythecitrushuanglongbingpathogen(candidatusliberibacterasiaticus)inchina.JournalofPlantPathology,2005,87(3),207-212.GarnettH.M.Isolationofthegreeningorganism.CitrusandSubtropicalFruitJournal,1985,611.HalbertSE.ThediscoveryofhuanglongbinginFlorida.Proceedingsof2ndinternationalcitruscankerandhuanglongbingresearchworkshop,FloridaCitrusMutual,Orlando,2005,H-3.HungTH,HungSC,ChenCN,HsuMH,SuHJ.DetectionbyPCRofCandidatusLiberibacterasiaticus,thebacteriumcausingcitrushuanglongbinginvectorpsyllids:applicationtothestudyofvector–pathogenrelationships.PlantPathology,2004,53,96–102.HungTH,WuML,SuHJ.IdentificationoftheChineseboxorange(Severiniabuxifolia)asanalternativehostofthebacteriumcausingcitrusHuanglongbing.EuropeanJournalofPlantPathology,2001,107:183–189.JagoueixS,Bove′JM,GarnierM.Thephloem-limitedbacteriumofgreeningdiseaseofcitrusisamemberoftheαsubdivisionoftheProteobacteria.InternationalJournalofSystematicBacteriology,1994,44:379–386.ReinkingOA.DiseasesofeconomicplantsinsouthernChina.PhilippineAgricultural,1919,8:109-135.TexeiraDC,AyresAJ,KitajimaEW,etal.,Firstreportofahuanglongbing-likediseaseofcitrusinSaoPauloState,Brazil,andassociationofanewLiberibacterspecies,“CandidatusLiberibacteramericanus”,withthedisease.PlantDisease,2005WangZ,YinY,HuH,YuanQ,PengG,XiaY.Developmentandapplicationofmolecular-baseddiagnosisfor‘CandidatusLiberibacterasiaticus’,thecausalpathogenofcitrushuanglongbing.PlantPathology,2006,55,630–638.WeisburgWG,BarnsSM,PelletierDA,etal.,16SribosomalDNAamplificationforphylogeneticstudy.JournalofBacteriology,1991,173:697-703.陳駉,宋瑞琳,柯沖.應(yīng)用莖尖嫁接脫除柑桔黃龍病病原初報(bào)[J].植物病理學(xué)報(bào),1988,(4).陳駉,宋瑞琳,柯沖.在試管中莖尖嫁接脫除柑桔黃龍病病原的研究[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),1987,(1).陳乃榮,戴月明,陳作義,沈菊英,吳泰旭,徐斌,陳啟磊,.柑桔黃龍病病原體及防治技術(shù)的研究[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué),1981,(6).陳乃榮,戴月明,吳泰旭,徐彬,.鹽酸四環(huán)素等藥物對(duì)柑桔黃龍病治療效應(yīng)[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào),1981,(3).陳循淵,.柑桔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