生物技術(shù)制藥實(shí)驗(yàn)講義資料

第一篇生物技術(shù)制藥實(shí)驗(yàn)室規(guī)則及基本要求

一'實(shí)驗(yàn)室規(guī)則

(1)每位同學(xué)應(yīng)自覺遵守課堂紀(jì)律，維護(hù)課堂秩序，不遲到，不早退，不大聲談笑。

(2)實(shí)驗(yàn)前須認(rèn)真預(yù)習(xí)，熟悉實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、原理、操作步驟，懂得每一操作步驟的意義，

并了解所用儀器的使用方法，否則不能開始實(shí)驗(yàn)。

(3)實(shí)驗(yàn)過程中要聽從教師的指導(dǎo)，嚴(yán)肅認(rèn)真地按照操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并把實(shí)驗(yàn)結(jié)果

和數(shù)據(jù)及時(shí)、如實(shí)記錄在實(shí)驗(yàn)記錄本上，文字要簡練、準(zhǔn)確。完成實(shí)驗(yàn)后經(jīng)教師檢查同

意，方可離開實(shí)驗(yàn)室。

(4)實(shí)驗(yàn)臺面應(yīng)隨時(shí)保持整潔，儀器、藥品擺放整齊。公用試劑用完后，應(yīng)立即蓋嚴(yán)放

回原處。勿使試劑、藥品灑在實(shí)驗(yàn)臺面和地上。實(shí)驗(yàn)完畢，儀器洗凈放好，將實(shí)驗(yàn)臺面

抹拭干凈，才能離開實(shí)驗(yàn)室。

(5)使用儀器、藥品、試劑和各物品必須注意節(jié)約；洗滌和使用儀器時(shí)，應(yīng)小心仔細(xì)，

防止損壞儀器；使用貴重精密儀器時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，發(fā)現(xiàn)故障須立即報(bào)告教師,

不得擅自動手檢修。

(6)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙！加熱用的電爐應(yīng)隨用隨關(guān)，嚴(yán)格做到：人在爐火在，人走爐火

關(guān)。乙醇、丙酮、乙醛等易燃品不能直接加熱，并要遠(yuǎn)離火源操作和放置。實(shí)驗(yàn)完畢后

應(yīng)立即拔去電爐開關(guān)，關(guān)好水籠頭并拉下電閘。離開實(shí)驗(yàn)室以前應(yīng)認(rèn)真、負(fù)責(zé)地進(jìn)行檢

查水電，嚴(yán)防發(fā)生安全事故。

(7)廢液體可倒入水槽內(nèi)，同時(shí)放水沖走。強(qiáng)酸、強(qiáng)堿溶液必須先用水稀釋。廢紙屑及

其他固體廢物和帶渣滓的廢物倒入廢品缸內(nèi)，不可倒入水槽或到處亂扔。

(8)要精心使用和愛護(hù)儀器，如使用分光光度計(jì)時(shí)，不能將比色杯直接置于分光光度計(jì)

上，并注意拿放比色杯時(shí)，不要打碎。儀器損壞時(shí)，應(yīng)如實(shí)向教師報(bào)告，并填寫損壞儀

器登記表，然后補(bǔ)領(lǐng)。

(9)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一切物品，未經(jīng)本室負(fù)責(zé)教師批準(zhǔn)，嚴(yán)禁帶出室外，借物必須辦理登記手

續(xù)。

(10)每次實(shí)驗(yàn)課由班長或課代表負(fù)責(zé)安排值日生。值日生的職責(zé)是負(fù)責(zé)當(dāng)天實(shí)驗(yàn)室的衛(wèi)

生、安全、組織同學(xué)填寫實(shí)驗(yàn)室登記本等一切服務(wù)性的工作。

二'實(shí)驗(yàn)基本要求

1.預(yù)習(xí)報(bào)告要求

做好預(yù)習(xí)報(bào)告，有助于學(xué)生實(shí)驗(yàn)前對實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容、目的要求、基本原理、具體操作

方法、數(shù)據(jù)記錄格式及實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)等有一定了解，減少盲目性，增強(qiáng)教學(xué)效果。實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

教師應(yīng)檢查學(xué)生的預(yù)習(xí)情況，進(jìn)行必要的提問，解答疑難。預(yù)習(xí)報(bào)告應(yīng)包括實(shí)驗(yàn)原理、

詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)操作步驟及做好實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)，并擬定好實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表格等。

2.實(shí)驗(yàn)記錄要求

詳細(xì)、準(zhǔn)確、如實(shí)地作好實(shí)驗(yàn)記錄是極為重要的，記錄如果有誤，會使整個(gè)實(shí)驗(yàn)失

敗，這也是培養(yǎng)學(xué)生實(shí)驗(yàn)?zāi)芰蛧?yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)作風(fēng)的一個(gè)重要方面。

(1)每位同學(xué)須準(zhǔn)備一個(gè)實(shí)驗(yàn)記錄本，記錄本上要編好頁數(shù)，不得撕頁和涂改，寫錯時(shí)

可以劃去重寫。不得用鉛筆記錄，只能用鋼筆或園珠筆記錄。記錄本的左頁作計(jì)算和草

稿用，右頁用作實(shí)驗(yàn)記錄。同組的兩位同學(xué)合做同一實(shí)驗(yàn)時(shí)，兩人必須都有相同、完整

的記錄。

(2)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)及時(shí)準(zhǔn)確地記錄所觀察到的現(xiàn)象和測量的數(shù)據(jù)，條理清楚，字跡端正，切

不可潦草，以致日后無法辨認(rèn)。實(shí)驗(yàn)記錄必須公正客觀，不可夾雜主觀因素。

(3)實(shí)驗(yàn)中要記錄的各種數(shù)據(jù)，都應(yīng)事先在記錄本上設(shè)計(jì)好各種記錄格式和表格，以免

實(shí)驗(yàn)中由于忙亂而遺漏測量和記錄，造成不可挽回的損失。

(4)實(shí)驗(yàn)記錄要注意有效數(shù)字，如吸光度值應(yīng)為“0.050”，而不能記成“0.05”。每個(gè)結(jié)果

都要盡可能重復(fù)觀測二次以上，即使觀測的數(shù)據(jù)相同或偏差很大，也都應(yīng)如實(shí)記錄，不

得涂改。

(5)實(shí)驗(yàn)中要詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)條件，如使用的儀器型號、編號、生產(chǎn)廠等；生物材料的來

源、形態(tài)特征、健康狀況、選用的組織及其重量等；試劑的規(guī)格、化學(xué)式、分子量、試

劑的濃度等都應(yīng)記錄清楚。二人一組的實(shí)驗(yàn)，必須每人都作記錄。

3.實(shí)驗(yàn)報(bào)告書寫要求及參考格式

實(shí)驗(yàn)報(bào)告是實(shí)驗(yàn)的總結(jié)和匯報(bào)，通過實(shí)驗(yàn)報(bào)告的寫作可以分析總結(jié)實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)和問

題，學(xué)會處理各種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的方法，加深對有關(guān)生物化學(xué)與分子生物學(xué)原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)

的理解和掌握，同時(shí)也是學(xué)習(xí)撰寫科學(xué)研究論文的過程。

3.1實(shí)驗(yàn)報(bào)告的格式

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

二、實(shí)驗(yàn)原理

三、儀器、實(shí)驗(yàn)材料和試劑

四、操作步驟

五、結(jié)果處理

一份滿意的實(shí)驗(yàn)報(bào)告必須具備準(zhǔn)確、客觀、簡潔、明了四個(gè)特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)報(bào)告的寫作

水平也是衡量學(xué)生實(shí)驗(yàn)成績的一個(gè)重要方面。實(shí)驗(yàn)報(bào)告必須獨(dú)立完成，嚴(yán)禁抄襲。

3.2實(shí)驗(yàn)報(bào)告的內(nèi)容

實(shí)驗(yàn)報(bào)告使用的語言要簡明清楚，抓住關(guān)鍵，各種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都要盡可能整理成表格

并作圖表示，以便比較，一目了然。實(shí)驗(yàn)作圖尤其要嚴(yán)格要求，必須使用坐標(biāo)紙，每個(gè)

圖都要有明顯的標(biāo)題，坐標(biāo)軸的名稱要清楚完整，要注明合適的單位，坐標(biāo)軸的分度數(shù)

字要與有效數(shù)字相符，并盡可能簡明，若數(shù)字太大，可以化簡，并在坐標(biāo)軸的單位上乘

以10的方次。實(shí)驗(yàn)點(diǎn)要使用專門設(shè)計(jì)的符號，如：。、?、口、?、△、▲等，符號的大

小要與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的誤差相符。不要用“x、+”和“?”小園點(diǎn)。有時(shí)也可用兩端有小橫線的

垂直線段來表示實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其線段的長度與實(shí)驗(yàn)誤差相符。通常橫軸是自變量，往往知道

的很準(zhǔn)確，縱軸是應(yīng)變量，是測量的數(shù)據(jù)。曲線要用曲線板或曲線尺畫成光滑連續(xù)的曲

線，各實(shí)驗(yàn)點(diǎn)均勻分布在曲線上和曲線兩邊，且曲線不可超越最后一個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。兩條以

上的曲線和符號應(yīng)有說明。

3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果的討論要充分，盡可能多查閱一些有關(guān)的文獻(xiàn)和教科書，充分運(yùn)用已學(xué)過

的知識，進(jìn)行深入的探討，勇于提出自己獨(dú)到的分析和見解，并歡迎對實(shí)驗(yàn)提出改進(jìn)意

見。

三、自動取液器的使用方法

這種取液器在生化實(shí)驗(yàn)中大量地使用，它們主要用于多次重復(fù)的快速定量移液，可

以只用一只手操作，十分方便。移液的準(zhǔn)確度（即容量誤差）為±（0.5%?1.5%）,移液的

精密度（即重復(fù)性誤差）更小些，為0.5%。

取液器可分為二種：一種是固定容量的，常用的有100卜iL等多種規(guī)格。每種取液器

都有其專用的聚丙烯塑料吸頭，吸頭通常是一次性使用，當(dāng)然也可以超聲清洗后重復(fù)使

用，而且此種吸頭還可以進(jìn)行120℃高壓滅菌；另一種是可調(diào)容量的取液器，常用的有

20（HiL、500HL和lOOOpL等幾種。

可調(diào)式自動取液器的操作方法是用拇指和食指旋轉(zhuǎn)取液器上部的旋鈕，使數(shù)字窗口

出現(xiàn)所需容量體積的數(shù)字，在取液器下端插上一個(gè)塑料吸頭，并旋緊以保證氣密，然后

四指并攏握住取液器上部，用拇指按住柱塞桿頂端的按鈕，向下按到第一停點(diǎn)，將取液

器的吸頭插入待取的溶液中，緩慢松開按鈕，吸上液體，并停留1?2秒鐘（粘性大的溶

液可加長停留時(shí)間），將吸頭沿器壁滑出容器，用吸水紙擦去吸頭表面可能附著的液體,

排液時(shí)吸頭接觸傾斜的器壁，先將按鈕按到第一停點(diǎn)，停留一秒鐘（粘性大的液體要加

長停留時(shí)間），再按壓到第二停點(diǎn)，吹出吸頭尖部的剩余溶液，如果不便于用手取下吸

頭，可按下除吸頭推桿，將吸頭推入廢物缸，如圖1-1、1-2、1-3和圖1-4。

自動取液器的使用注意事項(xiàng)：

①吸取液體時(shí)一定要緩慢平穩(wěn)地松開拇指，絕不允許突然松開，以防將溶液吸入過快

而沖入取液器內(nèi)腐蝕柱塞而造成漏氣。

②為獲得較高的精度，吸頭需預(yù)先吸取一次樣品溶液，然后再正式移液，因?yàn)槲⊙?/p>

清蛋白質(zhì)溶液或有機(jī)溶劑時(shí)，吸頭內(nèi)壁會殘留一層“液膜”，造成排液量偏小而產(chǎn)生誤

差。

③濃度和粘度大的液體，會產(chǎn)生誤差，為消除其誤差的補(bǔ)償量，可由試驗(yàn)確定，補(bǔ)償

量可用調(diào)節(jié)旋鈕改變讀數(shù)窗的讀數(shù)來進(jìn)行設(shè)定。

④可用分析天平稱量所取純水的重量并進(jìn)行計(jì)算的方法來校正取液器，1mL蒸儲水

20℃時(shí)重0.9982g。

第二篇實(shí)驗(yàn)部分

實(shí)驗(yàn)一胸腺素的制備

一'實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.了解胸腺素的來源、性質(zhì)及應(yīng)用；

2.掌握胸腺素的制備工藝原理和注意事項(xiàng)；

3.熟悉胸腺素質(zhì)量控制的內(nèi)容及原理。

二'實(shí)驗(yàn)原理

胸腺素是由小牛胸腺或豬胸腺經(jīng)分離純化而得到的一組具有免疫活性的多肽類物

質(zhì)，其主要功能是增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力，促進(jìn)起免疫作用的T淋巴細(xì)胞的成熟。分子量

在lOKDa以下，胸腺素對熱穩(wěn)定，短時(shí)間加熱至80℃,其生物活性不變；易溶于生理

鹽水及緩沖液。生產(chǎn)工藝采用生理鹽水提取，通過加熱及鹽析的方法去除雜蛋白，并可

通過超濾等方法控制分子量大小，以防大分子蛋白質(zhì)混入產(chǎn)品。

三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑

儀器：500ml量杯，刻度離心管（10ml）,試管，試管架，抽濾瓶，真空泵，層析柱，

溫度計(jì)，分析天平，勻漿機(jī)，離心機(jī)，恒溫水浴，冰箱.

試劑：丙酮,硫酸鍍,磷酸二氫鈉，sephadexG-10。

四'實(shí)驗(yàn)步驟

1.提取稱取去脂肪及結(jié)締組織的豬胸腺100g,加3倍體積的生理鹽水，制成勻漿，

1500rpm離心15min,收集上清液，即得提取物。

2.去除雜蛋白將以上提取物加熱至80℃,保持15min,然后1500rpm離心5min,收

集上清液。

3.沉淀將上清液置4℃冰箱，預(yù)冷，加入5倍體積-10℃冷丙酮，攪勻，放置lOmin,

過濾，收集沉淀，干燥得到粗的胸腺素丙酮粉。

4.分級鹽析將丙酮粉溶解于pH7.0的磷酸鹽緩沖液中，加固體硫酸核至25%飽和

度，攪勻，離心；收集上清液并調(diào)pH4.6,加硫酸鍍到50%飽和度，攪勻，靜置，離心,

收集沉淀物。

5.脫鹽將鹽析沉淀物溶于蒸儲水后經(jīng)sephadexG-10脫鹽后冷凍干燥即得到胸腺素。

五、注意事項(xiàng)

1.豬胸腺組織往往帶有許多脂肪及結(jié)締組織，應(yīng)盡可能去凈，否則提取液呈混濁。

2.采用加熱法除掉雜蛋白，注意溫度不可過高，時(shí)間也不宜過長。

3.向溶液中加入固體硫酸錢時(shí)應(yīng)注意攪勻，使硫酸鏤全部溶解，否則易造成局部濃度過

局。

六、思考題

1.胸腺素具有哪些理化性質(zhì)？有何意義?

2.胸腺素組分是否單一多肽類成分？

實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞色素c的制備及其測定

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握細(xì)胞色素c的制備及其測定方法。

二'實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞色素是多種能夠傳遞電子的含鐵蛋白質(zhì)的總稱。它廣泛存在于各種動物、植物

組織和微生物中。細(xì)胞色素是呼吸鏈中極重要的電子傳遞體，細(xì)胞色素C只是細(xì)胞色素

中的一種，它主要存在于線粒體中。

細(xì)胞色素C為含鐵吟琳的結(jié)合蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量約為13000,蛋白質(zhì)部分由104

個(gè)左右的氨基酸殘基組成。它溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可自酸性溶液中提

取。其制品分為氧化型和還原型兩種，前者水溶液呈深紅色，后者水溶液呈桃紅色。細(xì)

胞色素C對熱、酸和堿都比較穩(wěn)定，但三氯乙酸和乙酸可使之變性，引起失活。

吸附劑通常在微酸性(pH5~6)或低鹽溶掖中吸附蛋白質(zhì)。吸附于吸附劑上的蛋白質(zhì)

在微堿性或較高改濃度條件下即可洗脫下來。

本實(shí)驗(yàn)用人造沸石從組織浸提液中吸附細(xì)胞色素C,除去雜蛋白，再以高鹽溶液

從人造沸石上將細(xì)胞色素C洗脫下來。這樣制得的粗制細(xì)胞色素C再經(jīng)透析除去鹽分

子，后用離子交換劑純化，獲得較純細(xì)胞色素C。

細(xì)胞色素C分為氧化型和還原型。在水溶液中，氧化型呈深紅色，最大吸收峰為

408nm,530nm和550nm。550nm波長處的摩爾俏光系數(shù)為0.9xl()4moL/m；還原型的水

溶液呈桃紅色，最大吸收峰為415nm,520nm和550nm。550nm處的磨爾消光系數(shù)為

2.77xl04moL/m?其中還原型最穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)中所獲得的細(xì)胞色素產(chǎn)品是氧化型和還原型

的混合物。經(jīng)氧化劑或還原劑處理，可變?yōu)閱我环N型。測定其中一種的光吸收，根據(jù)磨

爾消光系數(shù)，即可計(jì)算出細(xì)胞色素C的含量。

細(xì)胞色素C在動物心肌和酵母中含量豐富，可作為實(shí)驗(yàn)材料。本實(shí)驗(yàn)以新鮮豬心臟

為材料。

三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑

儀器：搗碎機(jī)，離心機(jī)，電動攪拌機(jī)，可見分光光度計(jì)，玻璃柱(2.5mx30m),透析袋，

紗布，聯(lián)二亞硫酸鍋。

原料：新鮮豬心。

試劑：

1.0.145mol/L三氯乙酸溶液：稱取三氯乙酸23.69g,溶于蒸儲水，最后定容至

lOOOmLo

2.0.065mol/LNa2HPO4~0.45mol/LNaCl溶液：稱取21.5gNa2HPO#12H2。，

23.4gNaCl,加蒸儲水使之溶解，定容至lOOOmLo

3.15mol/L氫氧化鉉

4.40%(w/v)三氯乙酸

5.25%(W/v)硫酸鉉

6.0.2%(W/V)NaCl

7.O.Olmol/L鐵氟化鉀溶液

8.連二亞硫酸鈉

9.人造沸石(Na20Al2O3：xSiO2-yH2O)：為白色顆粒，不溶于水，溶于濃酸。選用

60—80目的顆粒，以水浸沒0.5h,除去15s不沉淀的細(xì)小顆粒，抽干備用。

再生方法：使用過的沸石，先用自來水洗去硫酸鍍，再用0.2moL/LNaOH和1moL

/LNaCl的等體積混合液洗滌沸石，重復(fù)幾次直至沸石變白為止。最后用蒸僧水洗滌至

pH為7~8,即可再次使用。

10.AmberliteIRC-50(H)樹脂處理：AmberliteIRC-50(H)以樹脂為母體，引入竣基形

成的弱酸型陽離子交換劑。使用前應(yīng)先將交換劑轉(zhuǎn)變?yōu)镹H2型。為此，取一定量的Amb

erliteIRC—50(H)(數(shù)量根據(jù)柱體積而定)，用蒸鐳水浸泡過夜，傾倒去水，加入2倍體積

的2moi/LHC1溶液，60℃恒溫條件下電磁攪拌約lh,傾倒去鹽酸溶液，用無離子水洗

滌至中性；加入2倍體積的2moi/LNHQH溶液，60℃恒溫條件下攪拌lh,傾倒去氨溶

液，再用無離子水洗至中性。新樹脂需要重復(fù)處理兩次。若顆粒過大，最后一次在2mol/L

NFUOH存在下，用研缽輕輕研磨，傾倒去15s內(nèi)不沉降的顆粒，最終顆粒100-150目為

好。最后用無離子水洗至中性備用。

樹脂再生：用過的AmberliteIRC-50(H)先用無離子水洗，再用2moi/LNH40H洗滌，傾

倒堿水，用無離子水洗至近中性。加2mol/LHC1溶液在60℃條件下攪拌20min,傾去

酸溶液。用無離子水洗至中性。再用2moi/LNH40H溶液浸泡，然后用無離子水洗至中

性后即可使用。如長期不用，可用布氏漏斗抽干備用。

11.透析袋處理：商品透析袋是用人工合成的半透膜制成的管狀袋，規(guī)格很多。一

般以袋的半徑表示其規(guī)格。商品透析袋常常被重金屬鹽、蛋白醐及核酸酶污染。為了防

止被透析的生物大分子物質(zhì)失活，透析袋最好在堿性EDTA溶液(10g/LNa2cO3。

Imol/LEDTA)中煮沸30min。以除去酶和重金屬鹽，然后用蒸儲水煮拂洗滌6~7次，除

去堿和EDTA即可使用。經(jīng)處理的透析袋，只能用清潔的鑲子或戴上橡皮手套取拿，不

宜按用手操作，以防污染。濕的透析袋非常容易長霉，因此保存使用過的透析袋時(shí)，最

好經(jīng)水洗滌后，再煮沸后備用或浸泡在含有微量苯甲酸的溶液里。

12.1x20cm層析柱。

13.絞肉機(jī)。

四'實(shí)驗(yàn)步驟

(~)細(xì)胞色素C的制備

1.材料處理

取新鮮或冰凍豬心，除盡脂肪、血管和韌帶，洗盡積血，切成小塊，放入搗碎機(jī)搗

碎。

2.提取

稱取500g絞碎的心肌肉放入大燒杯中，力U500mL0.145mol/L三氯乙酸溶液用玻璃

棒攪勻，室溫下放置，不時(shí)攪拌，浸提約2h。然后，用4層紗布分次壓濾，收集濾液。

用Imol/LNHQH溶液調(diào)節(jié)濾波的pH至6（用pH試紙檢查，pH過高或過低將影響以后

的過濾速度），再用濾紙過濾一次，收集濾液，此濾液應(yīng)清亮。

3.吸附粗分離

將上述所得的清亮濾液，用Imol/LNH40H溶液調(diào)至pH7.2（用酸度計(jì)檢測）。最后量

取濾液體積，按3g/100mL濾液計(jì)算稱取拂石，在不斷攪拌下加于濾液中，并持續(xù)攪拌

lh左右，使之充分吸附。在此過程中可見沸石由白色逐漸變?yōu)榉奂t色。吸附完畢，倒去

上層液體。余下的沸石先用約100mL蒸儲洗滌3~4次，再用100mL0.2%的NaCl溶液分

三次洗滌，最后用蒸儲水洗至上溶液澄清為止，倒去上清液。

4.洗脫

吸附在澇石上的細(xì)胞色素C用25%硫酸鍍液即可洗脫下來。洗脫時(shí)每次加

10mL25%硫酸鍍于沸石中反復(fù)攪拌，倒出洗脫液，再換新的25%硫酸鍍?nèi)芤?，直至?/p>

石變白為止。合并洗脫液，體積約為120mL。硫酸鍍洗脫后的沸石經(jīng)再生后回收備用。

5.鹽析及濃縮

按每100mL洗脫液加25g固體硫酸鏤計(jì)算，稱取固體硫酸鍍，在不斷攪拌下逐步

加于洗脫液中，靜置30~45min。以3000rpm離心lOmin,收集上清夜并量取體積，轉(zhuǎn)入

另一離心管中。沉淀?xiàng)壢?。在攪拌下向上清液中慢慢加?0%三氯乙酸溶液，直至產(chǎn)生

褐色絮狀沉淀為止。以3000rpm離心lOmin。棄上清夜，將離心管到置在濾紙上盡量吸

去上清液，即得細(xì)胞色素C粗提物。

6.透析

所得的細(xì)胞色素C粗提物中含有大量鹽類，在進(jìn)一步純化之前應(yīng)進(jìn)行脫鹽。本實(shí)驗(yàn)

中用透析法脫鹽。為此，在獲得的粗提物中加入2mL蒸儲水，使之溶解。取一段處理

好的、大小合適的透析袋，用夾子或線將一端封閉、并裝水檢查是否漏水。若不漏水，

倒出水后將溶解了的細(xì)胞色素C加入透析袋。加入的溶液體積一般為袋的2/3左右，過

滿在透析時(shí)容易脹破。裝好后應(yīng)擠壓趕出袋中的空氣，然后用夾子或線將口封閉，檢查

封口是否漏溶液，在表明透析袋兩端不漏溶液后，即將透析袋放入蒸儲水中，在電磁攪

拌器攪拌下透析。透析是一個(gè)物理平衡過程，通常要5~6h才能達(dá)到平衡。而且只用蒸

儲水透析一次是不可能完成透析的，因此要更換幾次蒸儲水，每次用奈氏試劑檢查透析

袋外液體，直至無氨離子為止。透析時(shí)間過長，為防止蛋白質(zhì)變性，透析應(yīng)在低溫(4℃)

條件下進(jìn)行。

7.純化

用離子交換層折法純化透析后的粗制品。將處理好的AmberliteIBC_50(NH2),裝入

1x20cm的層析袋中，使柱床高18cm左右。洗脫瓶中裝無離子水，沖洗離子交換柱，至

流出液的pH為7~8。關(guān)閉下口，吸去柱床面上的水，將透析后的粗制品加于柱床表面，

打開下口控制流速，使樣品慢慢進(jìn)入離子交換柱，讓樣品盡可能吸附在柱的上部，越集

中越好，洗脫時(shí)樣品易于集中，減少洗脫液體積。樣品加完后，柱床面上加一層水，用

無離了水繼續(xù)沖洗5~6min,流速為ImL/min,除去不吸附的雜質(zhì)。然后改用0.065mol/L

Na2HPO4~0.45mol/LNaCl溶液洗脫，控制流速為ImoL/min。用試管收集洗脫液，每管

10滴，直至洗脫液無色為止。合并洗脫液，量取總體積，此即為較純的細(xì)胞色素C產(chǎn)

品。洗脫液可進(jìn)一步在4c條件下對無離子水透析除鹽，用硝酸銀溶液檢查透析袋外溶

液，直至無氯離子為止。透析后如發(fā)生沉淀，則離心除去。上清液即為純的細(xì)胞色素C

溶液，可置冰箱保存，也可在低溫干燥成固體。

(-)細(xì)胞色素C的含量測定

制得的細(xì)胞色素C樣品是氧化型分子與還原型分子的混合物。測定其含量時(shí)要先用

氧化劑(鐵氟化鉀)將其全部轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸?，或用還原劑(連二亞硫酸鈉)將其全部轉(zhuǎn)變?yōu)?/p>

還原型。然后在550nm波長處測得光密度值(OD),根據(jù)巳知氧化型或還原型細(xì)胞色素C

的摩爾消光系數(shù)，即可計(jì)算出樣品中細(xì)胞色素C的含量。具體操作如下：

取1mL標(biāo)準(zhǔn)樣品(81mg/mL)用水稀釋至25mL,從中取0.2,0.4,0.6,0.8和1.0mL分

別放入5支試管中，每管補(bǔ)加蒸溜水至4mL,并加少許聯(lián)二亞硫酸銷作還原劑，然后在

波長550nm處測得各管的消光值(A550)計(jì)算得到的濃度值為橫坐標(biāo)、A值為縱坐標(biāo)，作

出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

取樣品1mL稀釋適當(dāng)倍數(shù)，再取此稀釋液1mL,加水3mL,再加少許聯(lián)二硫酸鈉,

然后在波長550nm處測得A550值。

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)所測得A520m值查標(biāo)準(zhǔn)曲線，得細(xì)胞色素C的濃度，即可計(jì)算出樣品原液

的濃度。在本實(shí)驗(yàn)中，每100g豬心碎肉應(yīng)獲得75mg以上的細(xì)胞色素C的粗制品。

注意事項(xiàng)：

(1)盡量除盡豬心的非心肌組織，包括脂肪、血管、韌帶和積血。

(2)提取、中和過程中要注意調(diào)節(jié)pH值。吸附、洗脫步驟應(yīng)嚴(yán)格掌握流速。

(3)鹽析時(shí)，加入團(tuán)體硫酸鈉要邊加邊攪拌，不要一次快速加入。

(4)逐滴加入三氯乙酸溶液，攪勻，加完后，盡快離心處理。

(5)注意要求透析袋不漏。

六、思考題

在進(jìn)行生物樣品的分離純化時(shí)，為保證樣品的活性，通常需要注意哪些方面？

實(shí)驗(yàn)三蛋白質(zhì)的含量測定（紫外吸收法）

一'實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握紫外吸收法測定蛋白質(zhì)濃度的原理及方法。

二'實(shí)驗(yàn)原理

由于蛋白質(zhì)中存在著含有共物雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外光

的性質(zhì)，最大吸收峰在280nm波長處。在此波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光密度OD280nm

與其濃度呈正比關(guān)系，可作定量測定。紫外吸收法測蛋白質(zhì)含量迅速、簡便、不消耗樣

品，低濃度鹽類不干擾測定。因此，已在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中廣泛采用，尤其在柱

層析分離純化中，常用280nm進(jìn)行紫外檢測，來判斷蛋白質(zhì)吸附或洗脫情況。

三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑

儀器：紫外分光光度計(jì)，吸管，試管和試管架，容量瓶。

材料和試劑：

1.標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液：準(zhǔn)確稱取經(jīng)凱氏定氮法校正的結(jié)晶牛血清蛋白，配制成濃度為

1mg/mL的溶液。

2.待測蛋白質(zhì)溶液：實(shí)驗(yàn)一所制備，濃度為Img/mL左右的溶液。

四'實(shí)驗(yàn)步驟

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

按表1分別向每支試管內(nèi)加入各種試劑，混勻。以光程為1cm的石英比色杯，在

280nm波長處測定各管溶液的光密度值OD280nm。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，光密度值

為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液

管號蒸儲水(mL)蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)OD280nm

(mL)

1040

20.53.50.125

31.03.00.25

42.02.00.50

53.01.00.75

64.001.0

2.樣品測定

取待測蛋白質(zhì)溶液1mL,加入蒸儲水3mL,混勻，按上述方法測定280nm的光密度,

并從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上查出待測蛋白質(zhì)溶液的濃度。

五'附注

在測定工作中，可以利用280nm及260nm的光密度值求出蛋白質(zhì)的濃度：

蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)=1.45OD280nm—0.74OD260nm

式中的OD280nm是蛋白質(zhì)溶液在280nm下測得的光密度，OD260nm是蛋白質(zhì)溶液在

260nm下測得的光密度。

六、思考題

1.你了解幾種測定蛋白質(zhì)含量的方法，它們所根據(jù)的原理是什么？

［附1］蛋白質(zhì)的含量測定(考馬斯亮藍(lán)法)

一'實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度的原理及方法。

二'實(shí)驗(yàn)原理

此方法是1976年Bradform建立?？捡R氏亮藍(lán)G-250在酸性溶液中為棕紅色，當(dāng)它

與蛋白質(zhì)通過疏水作用后，變成藍(lán)色，最大吸收波長從465nm轉(zhuǎn)移到595nm處，在一

定的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與595nm的吸光度成正比。

三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑

儀器：紫外分光光度計(jì)，吸管，試管和試管架，容量瓶。

材料和試劑：

1.考馬斯亮藍(lán)G-250染料試劑：稱100mg考馬斯亮藍(lán)G-250染料，溶于50mL95%的

乙醇后，再加入120mL85%的磷酸，用水稀釋至1L。

2.標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白溶液：準(zhǔn)確稱取經(jīng)凱氏定氮法校正的結(jié)晶牛血清蛋白，配制成濃度為

Img/mL的溶液。

3.待測蛋白質(zhì)溶液：實(shí)驗(yàn)一所制備，濃度為Img/mL左右的溶液。

四'實(shí)驗(yàn)步驟

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

按下表操作配制系列濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，分別取0.5mL系列濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)

品，加入4mL的染色液，混勻后室溫放置15分鐘。

管標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶蒸儲水蛋白質(zhì)濃考馬斯亮藍(lán)G-250

OD595nm

號液(mL)(mL)度(mg/mL)染色液(mL)

10404

20.53.50.1254

31.03.00.254

42.02.00.504

53.01.00.754

64.001.04

在595nm波長比色，讀出吸光度，以各管的標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)

繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.樣品測定

取待測蛋白質(zhì)溶液0.5mL,加入4mL的染色液，混勻后室溫放置15分鐘，并從標(biāo)

準(zhǔn)工作曲線上查出待測蛋白質(zhì)溶液的濃度。

五'附注

1.高濃度的Tris、EDTA、尿素、甘汕、蔗糖、丙酮等對測定有干擾。

2.顯色結(jié)果受時(shí)間與溫度影響較大，須注意保證樣品與標(biāo)準(zhǔn)的測定控制在同一條件

下進(jìn)行，因此，待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)測定。

3.考馬氏亮藍(lán)G-250染色能力很強(qiáng)，特別要注意比色杯的清洗。

六、思考題

1.說明各種蛋白質(zhì)含量測定法中哪幾種可以測出蛋白質(zhì)的絕對含量，哪幾種只能測

定其相對含量，為什么？

實(shí)驗(yàn)四堿變性法提取質(zhì)粒DNA

一'實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的原理方法和各項(xiàng)基本技術(shù)；

2.了解堿裂解法質(zhì)粒提取過程中各種純化步驟的設(shè)計(jì)思想。

二、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA,大小范圍從Ikb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒

都是存在于細(xì)胞質(zhì)中、獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，通常情況下可持

續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，

隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。

質(zhì)粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質(zhì)

粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質(zhì)粒DNA的提取，本實(shí)驗(yàn)采用堿裂解法提取

質(zhì)粒DNA。堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，其基本原理為：當(dāng)

菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒

DNA分子能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時(shí)留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不

變性而呈絮狀，離心時(shí)可沉淀下來。純化質(zhì)粒DNA的方法通常是利用了質(zhì)粒DNA相

對較小及共價(jià)閉環(huán)兩個(gè)性質(zhì)。例如，氯化葩-澳化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、

凝膠過濾層析、聚乙二醇分級沉淀等方法，但這些方法相對昂貴或費(fèi)時(shí)。對于小量制備

的質(zhì)粒DNA,經(jīng)過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白

質(zhì)和RNA,所得純化的質(zhì)粒DNA已可滿足細(xì)菌轉(zhuǎn)化、DNA片段的分離和酶切、常規(guī)

亞克隆及探針標(biāo)記等要求，故在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常用。

三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑

儀器：恒溫水浴培養(yǎng)箱，搖床，低溫超速離心機(jī)，水浴鍋，冰水浴，電泳儀，穩(wěn)壓電源,

電爐，乳膠手套，紫外投射儀，照相裝置等。

材料和試劑：

1.含pUCl8-EGFP的E.collDH5a菌株。

2.LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani)：稱取蛋白陳(Tryptone)lOg,酵母提取物(Yeastextract)

5g,NaCl5g,溶于800mL去離子水中，用NaOH(lmol/L)調(diào)pH至7.5,加去離子水至

總體積1L,高壓下蒸氣滅菌20分鐘。

3.LB固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中每升加12g瓊脂粉，高壓滅菌。

4.氨茶青霉素(Ampicillin,Amp)母液：配成50mg/mL水溶液,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5.溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Cl(pH8.0),lOmmol/LEDTA(pH8.0)?

溶液I可成批配制，每瓶100mL,高壓滅菌15分鐘,儲存于4℃冰箱。

6.溶液H：0.2mol/LNaOH(臨用前用lOmol/LNaOH母液稀釋)，1%SDS?

7.溶液in：5mol/LKAc60mL,冰醋酸11.5mL,H2O28.5mL,定容至100mL,并高

壓滅菌。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1.挑取單菌落接種于3mL含氨苦青霉素(70ng/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培

養(yǎng)過夜。

2.取1mL菌液于1.5mLEppendorf管中，3000r/min離心5分鐘，棄去上清液，濕菌體

在渦流混合器上振蕩均勻。

3.加入100似溶液I,搖勻。冰浴10分鐘。

4.加入200山溶液II,溫和振蕩，溶液變粘稠，而且清亮透明，冰浴10分鐘。

5.加入150Hl溶液ni,溫和振蕩，出現(xiàn)白色沉淀，冰浴10分鐘。

6.4℃10000r/min離心10分鐘,將上清液小心倒入另一個(gè)新Eppendorf管中，加入800pL

預(yù)冷的無水乙醇。-20°C冰箱中放置1小時(shí)，沉淀DNA。

7.4℃10,000r/min離心10分鐘，棄去上清液，將Eppendorf管中所有液體揮發(fā)干凈。

8.加入20|aLTE緩沖液溶解DNA。

五、一些試劑的生化作用原理

1.溶液I

①葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械力作用而降解。

②EDTA：螯合Mg2\Ca2+等金屬離子，抑制DNase對DNA的降解作用。另外,

EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。

2.溶液II

(l)NaOH：DNA在pH大于5、小于9的溶液中是穩(wěn)定的。但當(dāng)pH>12或pH<3時(shí)，

就會引起雙鏈之間的氫鍵解離而變性。溶液II中的NaOH濃度為200mmol/L,加到提取

液中時(shí)，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6,因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。

(2)SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能是溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)和蛋白，因而溶

解膜蛋白破壞細(xì)胞膜；解聚細(xì)胞中的核蛋白;SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SCh—…R+—

蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。

3.溶液in

NaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8,必須加入大量的冰醋酸，所以該溶液

實(shí)際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc是為了把pH12.6的提取液調(diào)回至pH

中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并穩(wěn)定存在。而高鹽的3moi/LNaAc可以中和核

酸上的電荷，減少相斥力，有利于變性的大分子染色體DNA、RNA互相聚合而沉淀下

來，同時(shí)鈉鹽與SDS-蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完

全。

4.沉淀DNA

乙醇可以任意比例和水相混溶，乙醉與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全，

因此是理想的DNA沉淀劑。DNA溶液中DNA是以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在的，當(dāng)加入乙醇

時(shí).，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失去水而易于聚合。

六'實(shí)驗(yàn)操作中注意的問題

1.該實(shí)驗(yàn)最重要的是去掉染色體DNA,在全部提取過程中，只有一次機(jī)會去除染

色體DNA,其關(guān)鍵步驟是加入溶液II和溶液HI時(shí)，控制變性與復(fù)性操作時(shí)機(jī)，既要使

試劑與染色體DNA充分作用使之變性，又要使染色體DNA不斷裂成小片段，從而能

與質(zhì)粒DNA相分離。這就要求試劑與溶菌液充分搖勻，搖動時(shí)用力要適當(dāng)。一般加入

溶液I時(shí)可用力振蕩幾次，因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)菌還沒有與溶菌的完全作用，染色體DNA尚未

釋放出來，不必?fù)?dān)心其分子斷裂。加入SDS以后，必須注意不能過分用力振蕩，但又

必須保證溶液混合充分，可上下顛倒EP管數(shù)次，直至混勻。

2.加入溶液II5分鐘后，如果溶液不變粘稠時(shí)，實(shí)驗(yàn)不能繼續(xù)做下去，要檢查所

用的試劑是否正確，數(shù)量是否符合，待找出原因改正后才可繼續(xù)進(jìn)行下去，否則，提取

到最后，將得不到質(zhì)粒DNA或收率極低。

3.加入乙醇沉淀DNA時(shí)，要把離心管蓋上蓋子倒翻搖動幾次，注意觀察水相和乙

醇之間沒有分層現(xiàn)象之后，才可以放到冰箱中去沉淀DNA。

七、思考題

1.質(zhì)粒的基本性質(zhì)有哪些？

2.在堿法提取質(zhì)粒DNA操作過程中應(yīng)注意哪些問題？

實(shí)驗(yàn)五水平式瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA

一'實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

學(xué)習(xí)并掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理和基本操作，通過DNA瓊脂糖凝膠電泳可知

DNA的純度、含量和相對分子質(zhì)量。

二、實(shí)驗(yàn)原理

瓊脂糖凝膠電泳是分子生物學(xué)中最常用的鑒定DNA的方法，它簡便易行，只需少

量DNA。DNA分子在瓊脂糖凝膠中涌動是由電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，前者由分子所帶

電荷量的多少而定，后者則主要與分子大小及構(gòu)象有關(guān)。DNA分子在高于其等電點(diǎn)的

pH溶液中帶負(fù)電荷，在點(diǎn)場中向正極移動。由于糖一磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，

相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極移動。

在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的泳動速度取決于DNA分子大小和構(gòu)象。具有不同

相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不同，DNA分子的遷移速度與其相對分子質(zhì)量的

對數(shù)成反比。另外DNA分子的構(gòu)象也可影響其遷移速度，同樣相對分子質(zhì)量的DNA,

超螺旋共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA(covalenllyclosedcircularDNA,cccDNA)遷移速度最快，線狀

DNA(linearDNA)其次，開環(huán)DNA(opencircularDNA,ccDNA)最慢。

觀察瓊脂糖凝膠中DNA的最簡便方法是利用熒光染料澳乙錠(ethidiumbromide,

簡稱EB)染色，EB分子是一種扁平分子，在紫外燈照射下，發(fā)出紅色熒光。當(dāng)DNA在

瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)，加入的EB就可以嵌入DNA雙鏈的堿基之間，形成一種熒光絡(luò)

合物，使發(fā)射的熒光增強(qiáng)幾十倍.而熒光的強(qiáng)度正比于DNA的含量，如將已知濃度的

標(biāo)準(zhǔn)樣品作電泳對照，就可估計(jì)出待測樣品的濃度。

瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍較廣，用各種濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長度為

200bp?50kb的DNA,見下表。

瓊脂糖的含量(%)分離線狀DNA分F的有小皰用(Kb)

0.35?6

0.61-20

0.70.8-10

0.90.5-7

1.20.4-6

1.50.2?4

綜上所述，通過DNA瓊脂糖凝膠電泳可知DNA的純度、含量和相對分子質(zhì)量。

三'實(shí)驗(yàn)儀器、材料及試劑

儀器：Eppendorf管，Tip,一次性手套，移液器，錐形瓶，燒杯，量筒，滴管，微波爐

(電熱恒溫水浴鍋)，穩(wěn)壓電泳儀，紫外檢測儀，水平式電泳槽，水平儀，攝影設(shè)備。

材料及試劑：

1.pUC18-EGFP質(zhì)粒；入DNA/H比dIH分子量標(biāo)準(zhǔn)。

2.瓊脂糖(Agarose):進(jìn)口或國產(chǎn)的電泳用瓊脂糖均可。

3.5xTBE電泳緩沖液：稱取Tris54g,硼酸27.5g,并加入0.5MEDTA(pH8.0)20mL,

定溶至lOOOmLo

4.6x電泳載樣緩沖液：0.25%浸粉藍(lán)，40%(w/v)蔗糖水溶液，貯存于4℃。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1.取5xTBE緩沖液20mL加水至200mL,配制成0.5xTBE稀釋緩沖液，待用。

2.膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖，置于200mL錐形瓶中，加入50mL0.5xTBE稀

釋緩沖液，放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為0.8%瓊脂

糖凝膠液。加熱過程中要不時(shí)搖動，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時(shí)應(yīng)蓋

上封口膜，以減少水份蒸發(fā)。

3.膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的

膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm

左右的間隙。

4.加樣：取lO^L酶解液與2pL6x載樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。

若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加

完一個(gè)樣品要更換tip頭，以防止互相污染，注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或

將樣品槽底部凝膠刺穿。

5.電泳：加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V,電

流在40mA以上。當(dāng)澳酚藍(lán)條帶移動到距凝膠前沿約2cm時(shí)，停止電泳。

6.染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入OSpig/mL的EB溶液中，室溫下染色

20-25分鐘。

7.觀察和拍照：在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的

電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上防

護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃面罩，以免損傷眼睛。經(jīng)照相機(jī)鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后

將相機(jī)固定于照相架上，采用全色膠片，光圈5.6,曝光時(shí)間10-120秒（根據(jù)熒光條帶的

深淺選擇）。

8.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：在放大的電泳照片上，以樣品槽為起點(diǎn)，用卡尺

測量WNA的EcoRI和HindIII酶切片段的遷移距離，以厘米為單位。以核甘酸數(shù)的常

用對數(shù)為縱坐標(biāo)，以遷移距離為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出連結(jié)各點(diǎn)的平滑曲線，即為該

電泳條件下DNA分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

五、注意事項(xiàng)：

1.EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性，配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套，并且不要把EB灑到桌面

或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。

2.當(dāng)EB太多,膠染色過深,DNA帶看不清時(shí)，可將膠放入蒸儲水沖泡,30分鐘后再觀

察。

六、思考題

1.瓊脂糖凝膠電泳中DNA分子遷移率受哪些因素的影響？

實(shí)驗(yàn)六動物組織核糖核酸的制備及測定

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.學(xué)習(xí)和掌握用苯酚法及鹽溶液法從動物組織提取核酸的原理及操作技術(shù)；

2.練習(xí)從動物組織提取RNA,并鑒定純度。

二'實(shí)驗(yàn)原理

利用苯酚法可以直接從動物組織中提取RNA,組織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA

即溶于上層被酚飽和的水層中，DNA和蛋白質(zhì)則留在酚層中，向水層加入乙醇后RNA

即呈白色絮狀沉淀析出。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1.稱取3克肝組織，剪成小塊，置于研缽中，加3-4滴90%的苯酚溶液后研磨，勻漿中

加入15mL水，轉(zhuǎn)移至三角燒瓶中，加10mL酚至三角燒瓶中。

2.室溫下劇烈振蕩45分鐘，于3000rpm離心20分鐘。

3.用吸管將上層液吸出，并加入1/2體積的氯仿-異戊醇，于低溫下振蕩20分鐘，以除

去提取液中的蛋白質(zhì)，以2000rpm離心10分鐘，吸出上層清液，向上清液中加入醋酸

鉀粉末，使最后濃度大約為2%,裝入小燒杯后，一邊攪拌，一邊緩慢加入兩倍于上清

液體積的95%乙醇以沉淀RNA。

4.于冰浴中放置半小時(shí)后，以lOOOrpm離心5分鐘，沉淀再用少量75%乙醉洗滌1-2

次，收集沉淀，置于干燥器內(nèi)干燥，稱重。

5.測定A260/A280的值，應(yīng)大于1.85,若小于1.85,則說明含雜蛋白和DNA高了。

四'思考題

根據(jù)核酸在細(xì)胞內(nèi)的分布、存在方式及其特性，提取過程中采取了什么相應(yīng)的措施？

［附2］紫外吸收法測定核酸含量

原理

DNA和RNA都有吸收紫外光的性質(zhì)，它們的吸收高峰在260nm波長處。吸收紫

外光的性質(zhì)是喋吟環(huán)和嘴咤環(huán)的共聊雙鍵系統(tǒng)所具有的，所以口票吟和喀咤以及一切含有

它們的物質(zhì)，不論是核甘、核甘酸或核酸都有吸收紫外光的特性，核酸和核甘酸的摩爾

消光系數(shù)(或稱吸收系數(shù))用K(P)260nm來表示，K(P)260nm為每L溶液中含有1摩爾核酸磷

的光吸收值。RNA的K(P)260nm(pH7為7700~7800)。RNA的含磷量約為9.5%,因此每

mL溶液含IpigRNA的光吸收值相當(dāng)于0.022~0.024。小牛胸腺DNA鈉鹽的K(P)260nm(pH7)

為6600,含磷量為9.2%,因此每mL溶液含IpgDNA的鈉鹽光吸收值為0.020。

蛋白質(zhì)由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白質(zhì)的吸收高峰在280nm

波長處，在260nm處的吸收值公為核酸的十分之一或更低，故核酸樣品中蛋白質(zhì)含量較

低時(shí)對核酸的紫外測定影響不大。RNA的260nm與280nm吸收的比值在2.0以上;DNA

的260nm與280nm吸收的比值則在1.9左右。當(dāng)樣品中蛋臼質(zhì)含量較高時(shí)比值即下降。

操作方法

將樣品配制成每mL含5~50pg核酸的溶液，于紫外分光光度計(jì)上測定260nm和

280nm吸收值，計(jì)算核酸濃度和兩者吸收比值。

A

RM4濃度(〃g/mL)=—典-x稀釋倍數(shù)

0.024xZ,

DNA溶度/源)=x稀釋倍數(shù)

0.020x￡

式中：460??,為260nm波長處光吸收讀數(shù)；L為比色池的厚度一般為1或0.5cm;0.024

為每mL溶液內(nèi)含IggRNA的光吸收；0.020為每mL溶液內(nèi)含IggDNA鈉鹽時(shí)的光吸

收值。

［附3］二苯胺顯色法測定DNA含量

原理

脫氧核糖核酸中的2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，

在595nm處有最大光吸收。DNA在40-400解范圍內(nèi)，光吸收與DNA的濃度成正比。

在反應(yīng)液中加入少量乙醛，可以提高反應(yīng)靈敏度。除DNA外，脫氧木糖、阿拉伯糖也

有同樣反應(yīng)。其他多數(shù)糖類，包括核糖在內(nèi)，一般無此反應(yīng)。

操作方法

一、DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

取10支試管，分成2組，依次加入0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mLDNA標(biāo)準(zhǔn)溶液。添

加蒸館水，使之都成2mL。另取2支試管，各加2mL蒸儲水作為對照。然后各加入4mL

二苯胺試劑，搖勻。于60℃恒溫水浴中保溫1小時(shí)，冷卻后于595nm處進(jìn)行比色測定。

取兩管平均值，以DNA濃度為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

二、樣品的測定

取2支試管，各加2mL待測液（內(nèi)含DNA應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的可測范圍之內(nèi)）和4mL

二苯胺試劑，搖勻。其余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

三、DNA含量的計(jì)算

根據(jù)測得的光吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相當(dāng)該光吸收值DNA的含量，按下式計(jì)

算出制品中DNA的百分含量：

DNA。/:待測液中測得的DNA/zg數(shù)

待測液中制品的〃g數(shù)

試劑和器材

試劑

1.DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液（須經(jīng)定磷確定其純度）：取小牛胸腺DNA鈉鹽以0.01mol/L氫氯化鈉溶

液配成200|ig/mL的溶液。

2.樣品待測液：準(zhǔn)確稱取DNA干燥制品以0.01mol/L氫氯化鈉溶液配成lOOpg/mL左右

的溶液。在測定RNA制品中的DNA含量時(shí)，要求RNA制品的每mL待測液中至少含

有20圈DNA,才能進(jìn)行測定。

3.二苯胺試劑：使用前稱取1g重結(jié)晶二苯胺，溶于100mL分析純的冰乙酸中，再加入

10mL過氯酸（60%以上），混勻待用。臨用前加入lmL1.6%乙醛溶液。所配得試劑應(yīng)為

無色。

器材

1.分析天平2.恒溫水浴3.試管4.吸量管（2mL和5mL）5.分光光度計(jì)

實(shí)驗(yàn)七表達(dá)蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

一'實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.學(xué)習(xí)和掌握利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測基因工程菌目的蛋白質(zhì)的表達(dá)；

2.掌握蛋白質(zhì)純度和分子量的測定。

二、實(shí)驗(yàn)原理

最廣泛使用的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)最早是由Ornstein(1964)和Davis(1964)設(shè)計(jì)的，樣品

和濃縮膠中含Tris-HCl(pH6.8),上下槽緩沖液含Tris-甘氨酸(pH8.3),分離膠中含

Tris-HCl(pH8.8)o系統(tǒng)中所有組分都含有0.1%的SDS(LaemmLi,1970)。樣品和濃縮膠

中的氯離子形成移動界面的先導(dǎo)邊界而甘氨酸分子則組成尾隨邊界，在移動界面的兩邊

界之間是一電導(dǎo)較低而電位滴度較陡的區(qū)域,它推動樣品中的蛋白質(zhì)前移并在分離膠前

沿積聚。此處pH值較高，有利于甘氨酸的離子化，所形成的甘氨酸離子穿過堆集的蛋

白質(zhì)并緊隨氯離子之后，沿分離膠泳動。從移動界面中解脫后，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物成一

電位和pH值均勻的區(qū)帶泳動穿過分離膠，并被篩分而依各自的大小得到分離。

SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的流體力學(xué)和光學(xué)

性質(zhì)表明，它們在水溶液中的形狀，近似于雪茄煙形狀的長桶園棒，不同蛋白質(zhì)的SDS

復(fù)合物的短軸長度都一樣(約為18A,即1.8nm),而長軸則隨蛋白質(zhì)分子量成正比地變

化。這樣的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，在凝膠電泳中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形

狀的影響，而只是橢園棒的長度也就是蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)。

由于SDS和疏基乙醇的作用，蛋白質(zhì)完全變性和解聚，解離成亞基或單個(gè)肽鏈，

因此測定的結(jié)果只是亞基或單條肽鏈的分子量。SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍取

決于用于灌膠的聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度。在沒有交聯(lián)劑的情況下聚合的丙烯酰胺形

成毫無價(jià)值的粘稠溶液，而經(jīng)雙丙烯酰胺交聯(lián)后凝膠的剛性和抗張強(qiáng)度都有所增加，并

形成SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物必須通過的小孔。這些小孔的孔徑隨“雙丙烯酰胺?丙烯酰胺”

比率的增加而變小，比率接近1：20時(shí)孔徑達(dá)到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按“雙

丙烯酰胺?丙烯酰胺”為1：29配制，試驗(yàn)表明它能分離大小相差只有3%的蛋白質(zhì)。

凝膠的篩分特性取決于它的孔徑，而孔徑又是灌膠時(shí)所用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺絕

對濃度的函數(shù)。用5?15%的丙烯酰胺所灌制凝膠的線性分離范圍如下表：

SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍

*丙烯酰胺濃度(％)線性分離范圍(kD)

1512?43

1016?68

7.536-94