稀有人參皂苷對(duì)CCl4所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

背景介紹肝臟是人體中最重要的消化器官，在代謝中扮演著無(wú)可取代的角色。近年來，全球肝臟疾病的發(fā)病率和死亡率逐年增加，中國(guó)肝病患者在全球占比約為20%。在眾多誘發(fā)因素中，導(dǎo)致急性肝損傷（ALI）疾病的主要原因有藥物、酒精、超重和病毒等。人參作為名貴藥材，其多種功效已被研究及臨床結(jié)果證明，例如提高免疫力、改善糖尿病、增強(qiáng)記憶力、預(yù)防和治療癌癥等。有研究表明，人參皂苷是人參的主要活性成分，而且人參皂苷已經(jīng)被證明具有多種藥理學(xué)活性。文章亮點(diǎn)1.探究了稀有人參皂苷改善急性肝損傷（ALI）的作用。通過酸水解法制備稀有人參皂苷Rk3、Rg5、Rh4，利用HPLC分離皂苷并檢驗(yàn)皂苷單體純度；2.人參皂苷Rk3、Rg5、Rh4均能有效改善ALI引起的轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)異常及氧化應(yīng)激等病理進(jìn)程，降低血清ALT和AST含量，降低肝臟MDA水平，提高血清SOD和肝組織GSH-Px活性，并減少CCl4造成的小鼠肝細(xì)胞壞死灶數(shù)量；3.

從人參中提取人參皂苷有望作為治療急性肝損傷的新藥，為后期臨床治療ALI提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。內(nèi)容介紹1

實(shí)驗(yàn)部分1.1

主要儀器與試劑1.2

實(shí)驗(yàn)方法1.2.1

人參皂苷的分離純化利用酸水解法高效富集和制備稀有人參皂苷。將人參粉放入燒杯中，加入含5%DL-酒石酸溶液后將燒杯放置在油浴鍋中加熱，使皂苷進(jìn)行酸化水解反應(yīng)。1.2.2

ALI小鼠模型的建立及分組將CCl4溶于茶油至其含量為0.2%后使用磁力攪拌器攪拌4h使得溶液完全混勻。50只SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。動(dòng)物模型分組情況為空白組、0.2%CCl4模型組（10mL/kg）、Rk3（100mg/kg）+CCl4（10mL/kg）組、Rg5（100mg/kg）+CCl4（10mL/kg）組、Rh4（100mg/kg）+CCl4（10mL/kg）組。1.2.3

血清生化指標(biāo)測(cè)定人參皂苷給藥結(jié)束后，小鼠禁食2h后注射乙醚使其麻醉，從眼眶靜脈叢采集血樣，采血結(jié)束后斷頸法處死實(shí)驗(yàn)小鼠。在4℃下，用3000r/min離心15min，將全血標(biāo)本放入新的EP試管。采用全自動(dòng)生化分析儀，按說明書要求測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的含量。1.2.4

肝臟組織學(xué)分析1.2.5

肝臟脂質(zhì)過氧化水平檢測(cè)1.2.6

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）1.2.7

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用GraphPadPrism9.0和IBMSPSSStatistics21.0（SPSSInc.USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以“平均值（mean）±標(biāo)準(zhǔn)偏差（standarddeviation，SD）”的形式表示。*p

<0.05即認(rèn)為結(jié)果具有顯著性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2

結(jié)果與討論2.1

人參皂苷的制備與純化使用大孔吸附樹脂和高效液相色譜分離純化三醇組人參皂苷，并對(duì)分離出的三醇組皂苷進(jìn)行檢測(cè)鑒定。通過單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)控制洗脫液乙醇的濃度優(yōu)化分離純化工藝。HPLC分離人參皂苷Rk3、Rg5、Rh4結(jié)果如圖2所示。2.2

人參皂苷對(duì)小鼠體重影響每日10:00記錄小鼠體重，得到人參皂苷對(duì)小鼠體重影響結(jié)果如圖4所示，灌胃人參皂苷Rk3、Rg5、Rh4對(duì)小鼠體重并無(wú)明顯影響，即人參皂苷Rk3、Rg5、Rh4對(duì)小鼠無(wú)明顯毒性作用。2.3

人參皂苷改善肝臟組織病理形態(tài)如圖5所示，與對(duì)照組相比，CCl4主要造成了小鼠肝細(xì)胞的壞死灶病理?yè)p傷，以中央靜脈為中心的肝細(xì)胞壞死灶分散分布；病灶內(nèi)的壞死肝細(xì)胞細(xì)胞核消失，細(xì)胞膜溶解，胞漿呈淡粉紅顆粒狀；肝細(xì)胞壞死呈彌散性分布，主要集中于中心靜脈，病灶中的胞膜溶解、胞質(zhì)變淺粉色；且伴隨淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比，人參皂苷給藥組肝細(xì)胞壞死灶數(shù)量減少，且淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)減少，其中人參皂苷Rg5的效果最為明顯。2.4

人參皂苷改善ALI引起的肝功能受損人參皂苷對(duì)急性肝損傷小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（AST）活力的影響如圖6所示。2.5

參皂苷改善ALI引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)人參皂苷對(duì)小鼠急性肝損傷時(shí)丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）含量的影響結(jié)果見圖7。2.6

人參皂苷對(duì)于ALI的炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響2.7

討論本研究發(fā)現(xiàn)，CCl4模型組小鼠相較于對(duì)照組，其SOD及GSH-Px水平都明顯升高，而給予人參皂苷Rk3、Rg5、Rh4進(jìn)行灌胃治療的小鼠相對(duì)模型組均有所改善，其中Rg5效果最佳。CCl4可在肝臟中引發(fā)以IL-6，TNF-α等為主要特征的炎性因子的炎癥反應(yīng)。IL-6能刺激T淋巴細(xì)胞分化、增殖，從而加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)；前期研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重肝臟損傷。Rk3、Rg5和Rh4能夠抑制IL-6及TNF-αmRNA的表達(dá)，且以Rg5的作用最明顯。3

結(jié)論本研究中的稀有人參皂苷提取物均采用酸水解法制備提純得到。稀有人參皂苷Rg5可降低AST水平，而Rg5和Rk3均可降低ALT水平，人參皂苷Rk3、Rg5、Rh4