抗阿爾茲海默癥燈盞乙素苷元衍生物設(shè)計(jì)、合成及活性研究

背景介紹阿爾茲海默癥（AD）是一種漸行性神經(jīng)退行性疾病，是導(dǎo)致癡呆的主要原因。燈盞乙素及其活性代謝物燈盞乙素苷元（Scutellarein）具有廣泛的藥理活性，包括抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、金屬螯合和抗炎特性，以及改善Aβ誘導(dǎo)的損傷等，表明燈盞乙素可能成為治療AD的有利藥物?；贏D這種神經(jīng)退行性疾病表現(xiàn)出復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制表明，人們的注意力正轉(zhuǎn)向探索多靶點(diǎn)定向配體策略（MTDLs），即單個(gè)藥物分子可以同時(shí)與疾病病理相關(guān)的多個(gè)靶點(diǎn)結(jié)合并調(diào)節(jié)。本文亮點(diǎn)1、根據(jù)多靶點(diǎn)定向配體策略，以燈盞乙素苷元為骨架，通過(guò)不同的連接體，連接N，N-雙取代氨基甲酸酯片段和炔丙胺，N-甲基炔丙胺片段，設(shè)計(jì)并合成抗AD燈盞乙素苷元衍生物；2、基于AD的膽堿酯酶假說(shuō)和單胺氧化酶假說(shuō)，根據(jù)Ellama法和Holt法，進(jìn)行酶活性測(cè)試，2-(4-((二甲基氨基甲?；?氧基)苯基)-5，6-二羥基-4-氧代-4H-色烯-7-基5-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)-5-氧代戊酸酯對(duì)兩種酶表現(xiàn)出較好的抑制活性；3、目標(biāo)化合物可能是一個(gè)具有潛力的抗AD化合物，有待在抗氧化活性、金屬離子螯合、肝微粒體代謝等抗AD活性實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。內(nèi)容介紹1實(shí)驗(yàn)部分1.1

主要儀器與試劑1.2

實(shí)驗(yàn)步驟1.2.1

燈盞乙素苷元的制備3mol/L硫酸-95%乙醇溶液的制備：①先配制95%乙醇：取950mL的無(wú)水乙醇于1000mL容量瓶中，用超純水定容，搖勻，裝入備用瓶。②取163mL(18.4mol/L)濃硫酸，少量多次加入到盛有上述95%乙醇的大燒杯中，勤攪拌，待冷卻后，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶，用95%乙醇定容，搖勻備用。苷元的制備：取2.00g燈盞乙素于250mL的圓底燒瓶中，加入180mL的上述硫酸-乙醇溶液，80℃回流20h，至橘紅色澄清液體。反應(yīng)結(jié)束后，倒入盛有2L冰水的大燒杯中，待沉淀析出完全后，抽濾，超純水反復(fù)洗滌濾餅至中性，用無(wú)水乙醇溶解并減壓旋干，得到黃色燈盞乙素苷元粗品，產(chǎn)率70%，直接用于下一步反應(yīng)。1.2.2

二苯縮酮保護(hù)的燈盞乙素苷元的合成在250mL的干燥潔凈圓底燒瓶中，加入500mg(1.75mmol)燈盞乙素苷元，加入14mL二乙二醇二甲醚(DEME)將苷元溶解，加入251.6mg(1.75mmol)對(duì)二甲氨基吡啶(DMAP)，常溫?cái)嚢柘戮徛渭佣榷郊淄?，滴畢，將體系升溫回流反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，加入適量石油醚，待晶體析出完全后，去上清液，殘余物經(jīng)硅膠柱層析分離純化，洗脫劑為V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1：70，得橘黃色粉末，產(chǎn)率為65%。1.3

膽堿酯酶活性測(cè)試以及酶動(dòng)力學(xué)測(cè)試采用Ellman法對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行膽堿酯酶活性測(cè)試。96孔板中依次加入140μLPBS、20μL酶、20μL待測(cè)物或?qū)φ掌?測(cè)試組),同時(shí)設(shè)置測(cè)試本底組(20μLPBS代替酶溶液)、空白組(20μLPBS代替待測(cè)化合物或?qū)φ掌?、空白本底組(180μLPBS)。37℃培養(yǎng)20min后，依此加入現(xiàn)配的10μLDTNB和10μL的ATCI，每孔溶液總體積為200μL。37℃培養(yǎng)10min后，然后立刻使用酶標(biāo)儀測(cè)試化合物在412nm處的OD值。每組數(shù)據(jù)重復(fù)做3次，取平均值。根據(jù)公式計(jì)算抑制率，用GraphPadPrism8.0計(jì)算出化合物抑制膽堿酯酶的IC50。抑制率(%)=[1-(OD測(cè)試組-OD本底組)/(OD空白組-OD空白本底組)]×100%1.4

單胺氧化酶活性測(cè)試1.5

化合物抑制/解聚Aβ1-42聚集活性實(shí)驗(yàn)1.6

透射電鏡(TEM)觀察Cu2+誘導(dǎo)的Aβ1-42聚集/解聚2結(jié)果與討論2.1

酶活性測(cè)試結(jié)果如表1所示，所有的目標(biāo)化合物對(duì)eeAChE均顯示了不同程度的抑制活性，IC50值范圍為3.50~12.69μmol/L，均優(yōu)于陽(yáng)性藥，這表明N,N-雙取代氨基甲酸酯的引入是抑制膽堿酯酶活性的關(guān)鍵。其中化合物4b、4c、6a抑制作用較好，有待進(jìn)一步的研究。2.2

酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基于上述結(jié)果，選擇化合物6a進(jìn)行eeAChE動(dòng)力學(xué)研究，結(jié)果如圖10a所示，eeAChE的Lineweaver-Burker圖中所有的直線在第三象限中相交于一點(diǎn)，隨著化合物(抑制劑)濃度的增加，斜率和截距都增加(即Vmax減少，Km增加)，這一結(jié)果表明，化合物對(duì)eeAChE抑制機(jī)理為混合型抑制。以Lineweaver-Burker圖中斜率對(duì)化合物濃度作圖，如圖10b所示，得抑制常數(shù)Ki值為3.61，表明化合物的抑制能力較強(qiáng)。2.3

抑制/解聚Aβ1-42聚集活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，所有化合物均有抑制Aβ1-42聚集的作用。除化合物4a、4b、4c外，其余6個(gè)化合物抑制Aβ1-42聚集的作用遠(yuǎn)高于燈盞乙素和姜黃素。選擇化合物5a、5b、6a、6b進(jìn)一步考察其抑制Cu2+誘導(dǎo)的Aβ1-42聚集，以及解聚自誘導(dǎo)和Cu2+誘導(dǎo)的聚集，結(jié)果如表2。化合物6a抑制自身誘導(dǎo)和Cu2+誘導(dǎo)的抑制率為87.57%和75.01%；化合物6a解聚自身誘導(dǎo)和Cu2+誘導(dǎo)的解聚率為82.22%和77.40%，均優(yōu)于燈盞乙素和姜黃素。2.4

透射電鏡(TEM)觀察Cu2+誘導(dǎo)的Aβ1-42聚集/解聚結(jié)果見圖11，未孵育過(guò)的Aβ1-42在電鏡下呈比較規(guī)整分散的圓形顆粒，Aβ1-42與Cu2+單獨(dú)孵育24h后聚集成不規(guī)則的纖維狀，Aβ1-42與Cu2+單獨(dú)孵育48h后聚集成不規(guī)則的纖維狀較24h更明顯。加入姜黃素和化合物6a后，聚集減少，且與化合物6a孵育的Aβ1-42聚集程度比與姜黃素孵育的Aβ1-42聚集程度明顯減少。表明化合物能夠有效抑制/解聚Cu2+誘導(dǎo)聚集，且抑制/解聚Cu2+誘導(dǎo)聚集的效果比姜黃素要好。透射電鏡結(jié)果與硫磺素T法測(cè)得的結(jié)果一致。3結(jié)論根據(jù)多靶點(diǎn)導(dǎo)向配體策略(MTDLs)，設(shè)計(jì)并合成9個(gè)雙靶點(diǎn)抗阿爾茲海默癥燈盞乙素苷元衍生物。結(jié)構(gòu)通過(guò)1HNMR、13CNMR、ESI-MS進(jìn)行確證，9個(gè)終產(chǎn)物(化合物4a~4c、化合物5a~5c、化合物6a~6c)總產(chǎn)率范圍在14.46%~19.37%之間?；贏D的膽堿酯酶假說(shuō)和單胺氧化酶假說(shuō)，根據(jù)Ellama法和Holt法，進(jìn)行酶活性測(cè)試。結(jié)果表明，2-(4-((二甲基氨基甲?；?氧基)苯基)-5,6-二羥基-4-氧代-4H-色烯-7-基5-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)-5-氧代戊酸酯(6a)對(duì)兩種酶表現(xiàn)出較好的抑制活性，對(duì)eeAChE的IC50為(5.06±1.59)μmol/L，對(duì)MAO-B的IC50為(23.61±0.27)μmol/L?；衔?a與eeAChE的酶動(dòng)力學(xué)表明化合物6a對(duì)eeAChE是混合型抑制?；衔?a不僅對(duì)自身和Cu2+誘導(dǎo)的Aβ1-42聚集具