(高清版)GBT 40225-2021 肌動蛋白抗體的檢測 免疫印跡法

ICSCCS07.080A40肌動蛋白抗體的檢測免疫印跡法國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會IGB/T40225—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由全國生化檢測標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC387)提出并歸口。本文件起草單位：中國測試技術(shù)研究院、成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司、深圳市第二人民醫(yī)院、甘肅中商食品質(zhì)量檢驗檢測有限公司、深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司、上海市計量測試技術(shù)研究院。1GB/T40225—2021肌動蛋白抗體的檢測免疫印跡法本文件描述了肌動蛋白抗體的免疫印跡檢測方法。本文件適用于基于免疫印跡法原理的肌動蛋白抗體的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法注1:目前發(fā)現(xiàn)肌動蛋白至少存在6種異構(gòu)體形式，主要分布在心肌、骨骼橫紋肌和平滑肌組織中，調(diào)控細胞的收縮注2:肌動蛋白分子質(zhì)量為45ku±3ku(1u≈1Da),具有高度保守性，在細胞中的表達相對穩(wěn)定，因此它常被用作校正系統(tǒng)的內(nèi)參。3.2疫球蛋白的總稱。下列縮略語適用于本文件。APS:過硫酸銨(ammoniumperoxodisulphate)BCA:二喹啉甲酸(bicinchoninicacid)ECL:化學(xué)發(fā)光試劑(electrogeneratedchemiluminescence)HRP:辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase)NP-40:乙基苯基聚乙二醇(NonidetP40)PBS:磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersaline)PBST:磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphatebuffersalinewithTween)PMSF:苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonylfluoride)PVDF:聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride)GB/T40225—2021SDS:十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate)TBS:Tris緩沖鹽溶液(tris-bufferedsaline)TBST:Tris緩沖鹽吐溫溶液(tris-bufferedsalinewithTween)TEMED:四甲基乙二胺(N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine)免疫印跡法，又稱蛋白質(zhì)印跡。其基本原理是通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分待測樣品不同的蛋白質(zhì)進行檢測，通過分析特異性反應(yīng)的位置和強度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或(和)組織中表達情況的信息。免疫印跡試驗通常由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白質(zhì)的印跡和檢測兩個部分組成。6試劑和材料6.1硝酸纖維膜或PVDF膜。6.3HRP標(biāo)記二抗抗體：HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG或HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG。6.4NP-40裂解液。6.6BCA蛋白測定試劑盒。6.7ECL發(fā)光液。6.10Tween-20。6.12聚丙烯酰胺凝膠儲液：30%丙烯酰胺-亞甲基雙丙烯酰胺凝膠儲液，按照A.1配制。6.13濃縮膠緩沖液(0.5mol/LTris·HCl,pH=6.8),按照A.2配制。6.14分離膠緩沖液(1.5mol/LTris·HCl,pH=8.8),按照A.3配制。6.211×PBS緩沖液(0.01mol/L磷酸6.265%濃縮膠，按照A.15配制。6.2712%分離膠，按照A.16配制。6.28麗春紅染色液。23GB/T40225—20216.29顯影液。6.30定影液。6.31電泳蛋白Marker:10ku～170ku。7.5化學(xué)發(fā)光儀。8樣品8.1自制的肌動蛋白抗體建議按照預(yù)估效價調(diào)整適當(dāng)稀釋梯度進行預(yù)試驗。8.2肌動蛋白抗體產(chǎn)品，首次使用時可按照產(chǎn)品說明書進行稀釋或選擇適當(dāng)稀釋梯度進行預(yù)試驗，待9.1.2抗體稀釋比例和抗原上樣量可根據(jù)實際試驗情況和肌動蛋白抗體效價進行適當(dāng)調(diào)整。9.2.1當(dāng)經(jīng)過處理后的細胞到達處理時間或者細胞密度達到80%～95%時，收集細胞。從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)瓶，置于冰上，用移液器吸出培養(yǎng)液。在培養(yǎng)瓶中加入4℃冰箱預(yù)冷30min后的1×PBS,緩慢平動培養(yǎng)瓶，使緩沖液充分洗滌細胞表面，倒掉PBS,重復(fù)操作2次～3次；在最后一次洗9.2.2向培養(yǎng)瓶中加入4℃冰箱預(yù)冷30min后的NP-40裂解液(每75cm2培養(yǎng)瓶約加1mL),放置在冰上裂解20min。然后用細胞刮子沿著瓶壁刮細胞。吸出刮好的細胞裂解液置于15mL離心管中(置9.2.3重復(fù)步驟9.2.2,盡可能將多的細胞裂解液收集到15mL的離心管中，插入冰盒進行超聲，超聲強度以不產(chǎn)生泡沫為準(zhǔn)，超聲每次2s～3s,重復(fù)3次。如仍有細胞碎片或沉淀，宜4℃,10000r/min,9.2.4取出少量細胞裂解液測定蛋白濃度(可用BCA蛋白測定試劑盒測定),其余細胞裂解液可分裝4GB/T40225—2021液濃度為1mg/mL。分子質(zhì)量為45ku±3ku,可選擇8%～12%濃度的分離膠，本文件給出了12%分離膠的配制，見A.16。蛋白質(zhì)分子質(zhì)量范圍/ku8注：來源參考：AbcamR。9.4.3抗原上樣前需與2×上樣緩沖液等體積混勻，95℃變性5min。用2×上樣緩沖液稀釋抗原內(nèi)參至10ng/μL,95℃變性5min。變性后的抗原和抗原內(nèi)參按照規(guī)定上樣量上樣?？乖蓞⒖?μg、議在鄰近的齒孔加入5μL電泳蛋白Marker。9.4.4將電泳槽連接電源進行電泳，注意正負極的區(qū)分。電壓調(diào)至80V～120V,分離膠電泳時間為9.5.1電泳結(jié)束后比照Marker的大小，選擇包含抗原內(nèi)參凝膠部分，輕輕切下后將凝膠取出，放置于4℃冰箱預(yù)冷30min的1×轉(zhuǎn)移緩沖液中。9.5.2按照即將切下的目的膠塊的大小來剪相應(yīng)大小的硝酸纖維膜或PVDF膜，剪下后在左上角剪小角以區(qū)分正反面，后將其浸泡于甲醇中活化約1min;之后取出放到配制好的1×轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡超置1塊海綿、3層～5層濾紙，用玻璃棒輕輕趕走氣泡后，放上已平衡好的硝酸纖維膜或PVDF膜9.5.4轉(zhuǎn)膜槽中倒入4℃冰箱預(yù)冷30min的1×轉(zhuǎn)膜液，加入冰塊，蓋上轉(zhuǎn)膜蓋。然后將轉(zhuǎn)膜槽放置9.5.5轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，確認Marker是否轉(zhuǎn)移成功。將硝酸纖維素膜或PVDF膜浸沒在麗春紅染色液中，搖動5min～10min或更長時間；取出印跡膜，用蒸餾水或1×PBS當(dāng)溶液漂洗2次～3次，可出現(xiàn)清晰5將印跡膜輕輕取出后，放置于封閉緩沖液中，室溫條件下?lián)u床2h或者置于4℃冰箱中封閉8h~將待測樣品抗肌動蛋白抗體與封閉緩沖液按照1:2500,1:5000,1:10000,1:20000,1:40000比例混合。將印跡膜置于10mL該混合液中，避免產(chǎn)生氣泡，室溫條件下輕輕搖動2h或者4℃冰箱孵育8h～12h。將HRP標(biāo)記的二抗與封閉緩沖液按照1:5000比例混合。將印跡膜置于10mL該混合液中，室步驟與9.6.3相同。待測樣品應(yīng)在45ku±3ku位置出現(xiàn)肉眼可見的相應(yīng)大小條帶。也可使用圖像處理軟件做條帶灰45ku±3ku大小條帶，每個稀釋梯度條帶大小一致，條帶信號從1:2500至1:40000逐漸減弱?？贵w1:40000稀釋比應(yīng)有明顯陽性信號。圖譜見附錄B。為1:10000進行測試。待測樣品中均應(yīng)出現(xiàn)45ku±3ku大小條帶，每個上樣量條帶大小一致，條帶信號從5μg總蛋白/泳道至60μg總蛋白/泳道逐漸增強?？贵w檢測5μg總蛋白/泳道的上樣量應(yīng)有明顯陽性信號。圖譜見附錄B。分別用NIH3T3細胞(小鼠細胞)、C6細胞(大鼠細胞)、COS7細胞(猴細胞)、CHO-K1細胞(倉鼠細胞)代替HeLa細胞(人細胞)樣品進行測試，待測樣品稀釋成1:10000后進行測試。各細胞樣品均6GB/T40225—2021將抗體原液放于密閉的、內(nèi)壁硅化處理的聚丙烯管中，置于37℃±0.5℃二氧化碳培養(yǎng)箱進行熱處理7d。對照抗體置于-20℃存放7d。兩組樣本處理后在室溫進行目測及采用分光光度法測定吸光度OD?00,目測沒有顯著沉淀，吸光度偏差小于10%視為無質(zhì)量變化。免疫印跡檢測不同物種細胞應(yīng)在45ku±3ku位置觀察到單一目的條帶，且可與肌動蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或商品化的肌動蛋白在同一位置檢測出條帶。應(yīng)定期對相關(guān)檢測儀器進行檢定或校準(zhǔn)。肌動蛋白抗體檢測涉及的相關(guān)試劑需從具備專業(yè)資質(zhì)并經(jīng)過驗證核實的供應(yīng)商處采購，且具備檢檢測涉及的細胞應(yīng)按照國家相關(guān)指導(dǎo)性文件要求使用和管理。細胞房應(yīng)按照國家相關(guān)文件要求建設(shè)和管理。a)產(chǎn)品名稱；b)抗體總量；c)抗體分子質(zhì)量；f)抗體保存條件及期限。7GB/T40225—2021(規(guī)范性)A.1聚丙烯酰胺凝膠儲液Acr(丙烯酰胺)Bis(甲叉雙丙烯酰胺)加蒸餾水定容至將上述各成分充分溶解于80存30d～60d。A.2濃縮膠緩沖液：0.5mol/LTrisbase(Tris堿)加HCl調(diào)pH至6.8加蒸餾水定容至mL蒸餾水，加蒸餾水定容至100mL,過濾后置于棕色瓶中，4℃可貯Tris·HCl,pH=6.8pH=6.8將上述Trisbase充分溶解于80儲存于4℃。Trisbase(Tris堿)加HCl調(diào)pH至8.8加蒸餾水定容至將上述Trisbase充分溶解于80儲存于4℃。mL蒸餾水，加6mol/L鹽酸調(diào)pH至6.8,加蒸餾水定容至100mL,Tris·HCl,pH=8.8pH=8.8mL蒸餾水，加6mol/L鹽酸調(diào)pH至8.8,加蒸餾水定容至100mL,A.4上樣緩沖液0.5mol/LTris·HClpH6.85mLgGlycerol(甘油)2mL0.4mLBromophenolBlue(BPB,溴酚藍)mg加蒸餾水定容至mL將上述0.5mol/LTris·HCI、SDS及適量加蒸餾水(控制三者總體積≤8mL),攪拌充分溶解；再加入β-ME、BPB,攪拌充分溶解，加蒸餾水定容至10mL,儲存于4℃。A.510×電泳緩沖液Trisbase(Tris堿)Glycine(甘氨酸)GB/T40225—2021加蒸餾水定容至1000mL將上述Trisbase、Glycine、SDS充分溶解于800mL蒸餾水，加蒸餾水定容至1000mL,儲存于室溫。A.610×轉(zhuǎn)移緩沖液Trisbase(Tris堿)Glycine(甘氨酸)加蒸餾水定容至注：10×轉(zhuǎn)移緩沖液不含甲醇，稀釋成1×轉(zhuǎn)移緩沖液后，加入甲醇溶液使甲醇終濃度為20%。將上述Trisbase、Glycine、SDS充分溶解于800mL蒸餾水，加蒸餾水定容至1000mL,儲存于室溫。A.71×電泳緩沖液10×電泳緩沖液100mL加蒸餾水定容至1000mL將上述100mL10×電泳緩沖液用蒸餾水稀釋并定容至1000mL,充分混勻，儲存于4℃。A.81×轉(zhuǎn)移緩沖液10×轉(zhuǎn)移緩沖液Methonol(甲醇)加蒸餾水定容至注：甲醇現(xiàn)用現(xiàn)加。將上述100mL10×轉(zhuǎn)移緩沖液和600mL蒸餾水混合，再加入200mL甲醇，加蒸餾水定容至1000mL,儲存于4℃。A.910×PBS緩沖液(0.1mol/L磷酸鹽緩沖液),pH=7.4磷酸二氫鉀(KH?PO?)磷酸氫二鈉(Na?HPO?)氯化鈉(NaCl)氯化鉀(KCl)加蒸餾水至加HCl調(diào)節(jié)pH至7.4,加蒸餾水定容至將上述成分充分溶解于800mL蒸餾水，加6mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH到7.4,加蒸餾水定容至1000mL,儲存于室溫。A.101×PBS緩沖液(0.01mol/L磷酸鹽緩沖液),pH=7.4方法一：將A.9中100mL10×PBS緩沖液用蒸餾水稀釋并定容至1000mL,充分混勻，儲存于4℃。方法二：按照如下配方，將各成分充分溶解于800mL蒸餾水，加6mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH到7.4,加蒸餾水定容至1000mL,高溫高壓滅菌≥20min(可選做),儲存于室溫或4℃。磷酸二氫鉀(KH?PO?)0.24g磷酸氫二鈉(Na?HPO?)1.44g89氯化鈉(NaCl)氯化鉀(KCl)加蒸餾水至加HCl調(diào)節(jié)pH至7.4,加蒸餾水定容至GB/T40225—2021gmLmLA.1110×TBS緩沖液(0.1mol/LTris鹽緩沖液),pH=7.4Tris-base(Tris氯化鈉(NaCl)氯化鉀(KCl)加蒸餾水至800mL加HCl調(diào)節(jié)pH至7.4,加蒸餾水定容至將上述成分充分溶解于800mL蒸餾水，加6mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH到7.4,加蒸餾水定容至1000mL,儲存于室溫。A.121×TBS緩沖液(0.01mol/LTris鹽緩沖液),pH=7.4方法一：將A.11中100mL10×TBS緩沖液用蒸餾水稀釋并定容至1000mL,充分混勻，儲存于方法二：按照如下配方，將各成分充分溶解于800mL蒸餾水，加6mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH到7.4,加蒸餾水定容至1000mL,高溫高壓滅菌≥20min(可選做),儲存于室溫或4℃:氯化鈉(NaCl)8g氯化鉀(KCl)0.2g加蒸餾水至加HCl調(diào)節(jié)pH至7.4,加蒸餾水定容至A.13洗膜緩沖液：即TBST或PBST,含0.1%Tween-20的1×TBS或PBS緩沖液Tween20加蒸餾水定容至mLmL稱取上述Tween-20,100mL10×TBS或10×PBS緩沖液，加蒸餾水混勻、稀釋并定容至1000mL,儲存于室溫或4℃。A.14封閉緩沖液：即含5%脫脂奶粉的TBST或PBST脫脂牛奶5g洗膜緩沖液100mL封閉緩沖液現(xiàn)用現(xiàn)配