(高清版)GBT 40249-2021 斑節(jié)對蝦桿狀病毒病診斷規(guī)程 PCR檢測法

ICS65.020.30斑節(jié)對蝦桿狀病毒病診斷規(guī)程國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)IGB/T40249—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本文件由全國水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC156)歸口。本文件起草單位：中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所、全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站。許華。1GB/T40249—2021本文件規(guī)定了斑節(jié)對蝦桿狀病毒病診斷規(guī)程中普遍適用的核酸檢測技術(shù)的要求，針對斑節(jié)對蝦桿狀病毒(Penaeusmonodon-typebaculovirus,MBV),給出了PCR檢測法所需試劑或材料、儀器設(shè)備、本文件適用于對蝦各生活期樣品中MBV帶毒情況的定性檢測，以進(jìn)行斑節(jié)對蝦桿狀病毒病的流2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文GB/T28630.4—2012白斑綜合征(WSD)診斷規(guī)程第4部分：組織病理學(xué)診斷法本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。bp:堿基對(basepair)DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)dNTPs:脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)HCl:鹽酸(hydrogenchloride)NaOH:氫氧化鈉(sodiumhydroxide)PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)SDS:十二烷基硫酸(sodiumdodecylsulfate)Taq:水生棲熱菌(thermusaquaticus)TE:Tris鹽酸和EDTA緩沖液(EDTATris·HCl)Tris:三羥甲基氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane)5.5蛋白酶K:按A.7配制。5.8酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)。5.9氯仿/異戊醇(24:1)。5.16引物261F(10mol/L):5'-AAT-CCT-AGG-CGA-TCT-TAC-CA-3',-20℃保存。5.17引物261R(10μmol/L):5'-CGT-TCG-TTG-ATG-AAC-ATC-TC-3',-20℃保存。5.18內(nèi)參引物CF(10μmol/L):5'-TGC-CTT-ATC-AGC-TNT-CGA-TTG-TAG-3',-20℃保存。5.19內(nèi)參引物CR(10μmol/L):5'-TTC-AGN-TTT-GCA-ACC-ATA-CTT-CCC-3',-20℃保存。23GB/T40249—20217樣品斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)等易感對蝦。參見附錄B。采樣數(shù)量、方法和保存運(yùn)輸應(yīng)符合GB/T28630.4—2012中附錄B的要求。7.3.2分子生物學(xué)檢測時(shí)，仔蝦或未達(dá)到0.5g樣品可以合并樣本，個(gè)體稍大的蝦可取個(gè)體進(jìn)行檢測。所取樣品分別置于1.5mL離心管中，立即進(jìn)行DNA提取操作或暫時(shí)保存于-20℃。8試驗(yàn)步驟8.1DNA的提取設(shè)置陽性對照和陰性對照。8.1.2加入2.5μL20mg/mL蛋白酶K,至終濃度100μg/mL,混勻后置于50℃水浴3h,不時(shí)旋動(dòng)。8.1.3將溶液冷卻至室溫，加入等體積平衡酚，顛倒混合10min,于10000r/min離心3min分離兩相。8.1.4水相移至新1.5mL離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25:24:1),顛倒混合10min,于10000r/min離心1min分離兩相。離心1min分離兩相。8.1.7用70%乙醇洗滌沉淀2次，每次10000r/min離心5min,小心棄掉上清，將沉淀于室溫晾干。8.1.8加入100μL滅菌雙蒸水溶解DNA。8.1.10可采用同等抽提效果的其他方法或使用商品化DNA提取試劑盒。8.2PCR擴(kuò)增8.2.1PCR反應(yīng)體系：按照表1的要求，加入除TaqDNA聚合酶以外的各項(xiàng)試劑，配制成大體積的預(yù)混物，分裝保存于-20℃。臨用前，加入相應(yīng)體積的TaqDNA聚合酶，混勻，按1個(gè)反應(yīng)體系/支分裝到0.2mLPCR管中。分別加入各樣品的模板DNA(質(zhì)量濃度：50ng/μL～100ng/μL)1μL,同時(shí)設(shè)陽8.2.2將上述加有DNA模板的PCR管按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s,35個(gè)循環(huán)4GB/T40249—2021試劑試劑終濃度10×PCR緩沖液(無Mg2+)1×PCR緩沖液試劑試劑終濃度dNTPs(各2.5mmol/L)引物261R(10pmol/L)滅菌雙蒸水—TaqDNA聚合酶(5U/μL)8.2.3每份樣品均設(shè)立十足目生物內(nèi)參對照，擴(kuò)增十足目生物組織DNA的PCR反應(yīng)體系按照表2的表2擴(kuò)增十足目生物組織DNAPCR反應(yīng)體系試劑·組成試劑試劑終濃度10×PCR緩沖液(無Mg2+)1×PCR緩沖液dNTPs(各2.5mmol/L)滅菌雙蒸水TaqDNA聚合酶(5U/μL)注：25pL體系的模板量為1μL。8.2.4將上述加有DNA模板的PCR管按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃預(yù)變性3min;94℃變性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min,35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min;4℃保溫。8.3.1配制1.5%的瓊脂糖凝膠，加入10mg/mLEB至終濃8.3.2將5μLPCR反應(yīng)產(chǎn)物與1μL6×載樣緩沖液混勻后加入到加樣孔中。同時(shí)設(shè)立DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)對照。8.3.3在1V/cm～5V/cm的電壓下電泳，使DNA由負(fù)極向正極移動(dòng)。當(dāng)載樣緩沖液中的溴酚藍(lán)指示劑的色帶遷移至瓊脂糖凝膠的1/2～2/3處時(shí)停止電泳，將凝膠置于紫外觀察儀或凝膠成像儀下觀察或拍照。8.3.4如果觀察到預(yù)期大小條帶，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。5GB/T40249—20219結(jié)果判定十足目生物組織樣品在848bp處有特定條帶，陽性對照在261bp處有特定條帶，陰性對照在261bp處無條帶且空白對照不出現(xiàn)任何條帶，試驗(yàn)有檢測樣品在261bp處有條帶，測序結(jié)果同參考序列(參見附錄C)進(jìn)行比對，結(jié)果符合的可判為PCR結(jié)果陽性；檢測樣品在261bp處無條帶可判為PCR結(jié)果陰性。6(規(guī)范性)A.11水mol/LTris·HCl(pH8.0)gmL溶解后加入約42mL濃鹽酸調(diào)pH接近8.0,冷卻至室溫，再用2.5mol/LHCl調(diào)整pH至8.0。加水定容至1000mLA.20.5mol/LEDTA(pH8.0)乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na?·2H?O)18.6g磁力攪拌，用2.5mol/LNaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0,完全溶解，定容至100mL。A.3TE緩沖液(pH8.0)1mol/LTris·HCl(pH8.0)10mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)2mL加水定容至1000mLA.41mg/mL胰RNA酶TE緩沖液(pH8.0)10mL加熱至68℃助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2,加水定容至100mL。室溫貯存。若溶液有結(jié)晶形成，用前加熱融解即可。SDS微細(xì)晶粒易于擴(kuò)散，稱量時(shí)要戴面罩，稱量完畢后要清除殘留在稱量工作臺(tái)區(qū)和天平上A.6抽提緩沖液1mol/LTris·HCl(pH8.0)lmL0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL1mg/mL胰RNA酶2mL10%SDS7GB/T40249—2021A.720mg/mL蛋白酶K蛋白酶K20mg溶解后分裝于1.5mL離心管中(0.25mL/管),—20℃下保存。A.810mol/L乙酸銨乙酸銨77gA.950×電泳緩沖液Tris242g0.5mol/LEDTA(pH8.0)100mL50×電泳緩沖液20mL室溫貯存。A.1170%乙醇無水乙醇70mLA.1210mg/mLEB貯存液磁力攪拌數(shù)小時(shí)以確保其完全溶解。室溫保存于棕色瓶或用鋁鉑包裹的瓶中。GB/T40249—2021(資料性)斑節(jié)對蝦桿狀病毒病簡介斑節(jié)對蝦桿狀病毒病(InfectionwithPenaeusmonodon-typebaculovirus)由斑節(jié)對蝦桿狀病毒(MBV)感染引起。國際病毒分類委員會(huì)(ICTV)將該病毒名稱暫定為斑節(jié)對蝦單核多角體病毒(Pe-moNPV),但在多數(shù)情況下該病原被稱為MBV,為核多角體病毒屬成員。核酸類型為雙鏈DNA。該病毒可感染對蝦屬(Penaeus)、明對蝦屬(Fenneropenaeus)、囊對蝦屬(Metapenaeus)和溝對蝦屬(Melicertus)等多種對蝦。除卵和無節(jié)幼體，其余各生長階段均易感染，且通常存在持續(xù)性感染。嚴(yán)重感染MBV的野生雌性斑節(jié)對蝦產(chǎn)卵時(shí)，會(huì)排出含MBV的糞便，從而污染蝦卵，將病毒傳給下一代。有分布，但在斑節(jié)對蝦自然地理分布范圍以外的野生對蝦群體中未發(fā)現(xiàn)。MBV經(jīng)腸道感染肝胰腺小管和中腸前段黏膜上皮細(xì)胞。受