雞球蟲(chóng)卵囊的收集及孢子化技術(shù)

2雞球蟲(chóng)卵囊的收集及孢子化技術(shù)本文件適用于雞球蟲(chóng)病相關(guān)科研工作、流行病學(xué)調(diào)查、疾病診斷和疫無(wú)80目和180目網(wǎng)篩、玻璃棒、15mL離心管、1mL注射器（無(wú)針頭）、250mL離心瓶、燒杯、手術(shù)去離子水、飽和食鹽水、2.5%重鉻酸鉀溶液將保存于4℃2.5%重鉻酸鉀溶液中的雞球蟲(chóng)孢子化卵在顯微鏡10倍鏡下計(jì)數(shù)孢子化卵囊。一般計(jì)數(shù)對(duì)角線10個(gè)小格里中的卵囊，最終確定1mL重鉻酸鉀溶3根據(jù)1mL重鉻酸鉀溶液中的孢子化卵囊數(shù)及擴(kuò)繁卵囊數(shù)確定重鉻酸鉀溶液體積，將重鉻酸鉀溶液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，4000r/min離心8min，棄上清，加入去離子水重懸沉淀清洗并離心，反復(fù)用去離子水清洗直到上清澄清，最后用去離子水重懸卵囊沉淀并將卵囊密度調(diào)至1×104個(gè)?mL-1。感染劑量見(jiàn)喂料，飲水和飼料均不添加任何抗球蟲(chóng)藥物。用1mL注射器（無(wú)針頭）吸取6.2中卵囊懸液1mL，經(jīng)口應(yīng)蟲(chóng)種排卵囊期的糞便。7種球蟲(chóng)的糞便收集將排卵囊期收集到的糞便用5倍體積的去離子水充分浸泡并攪拌，充分?jǐn)囁榧S渣，釋放出足夠多的濾，2次濾液混合在一起后再用180目網(wǎng)將表層浮液倒入另一容器中，加入不少于浮液10倍體積的去離子水將浮液稀釋，4000r/min水平離心8min，棄去上清，沉淀則含有球蟲(chóng)卵囊。糞便中卵囊的收集均適用于7種球蟲(chóng)卵囊以及各種混合卵囊的膜進(jìn)行收集，在感染后第6天（E.tenella）或第7天（E.necatrix）化20min，每隔5min進(jìn)行顛倒混勻。消化結(jié)束后，先后用60目和離心管中，4000r/min水平離心8min，棄上清。液重懸，4℃孵育10~15min，4000r/min水平離心10min，棄上清。沉淀用去離子水重懸，4000r/min水4續(xù)用2.5%重鉻酸鉀溶液調(diào)節(jié)卵囊密度至不超過(guò)1×106個(gè)?mL-1，容器中重鉻酸鉀溶液的厚度不超過(guò)0.7此間每天對(duì)培養(yǎng)液輕輕攪拌3~5次或用移液器輕輕吹打液面幾十次，并觀察液面，若液面下降，向容器5稱取重鉻酸鉀固體25g，放入1L燒杯中，加入完全溶解無(wú)顆粒，繼續(xù)補(bǔ)加去離子水至1000mL，充分混勻后即為2.5%重鉻酸鉀溶液。6將稀釋液混勻后并填滿麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)器左右兩個(gè)計(jì)數(shù)室，靜置2min，在顯微鏡10倍物鏡下計(jì)數(shù)數(shù)分別為a+b，則1mL稀釋液中的孢子化卵囊總數(shù)為(a+b)/(2×0.17E.necatrixE.acervulinaE.brunettiE.maximaE.mitisE.praecoxa感染后天數(shù)8AB9將充滿有球蟲(chóng)懸液的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡下，在10倍物鏡下計(jì)算計(jì)數(shù)室四角4個(gè)大方格（每個(gè)若計(jì)數(shù)室四角沒(méi)有大方格，則用正中的1個(gè)大方格，連續(xù)計(jì)數(shù)多次，求其平均數(shù)，再乘以104即為1mL[1]GB/T1.1-2020,標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則.[4]秦建華,李國(guó)清.動(dòng)物寄生蟲(chóng)病學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)A,ConwayDP,McKenzieME,etal.WorldAssociatifVeterinaryParasitology.WorldAssociationfortheAdvancementofVeterinaryguidelinesforevaluatingtheefficacyofanticocc[6]TomleyF.Techniquesforisolation