漢恒生物無縫克隆引物快速設(shè)計教程

漢恒生物基于GibsonAssembly的無縫克隆快速設(shè)計教程軟件：GenomeCompiler設(shè)計舉例：把LacZ克隆到pEGFP-N3中，得pLacZ-EGFP難點：LacZ需要和EGFP融合表達，所以克隆位點的選擇尤其關(guān)鍵！注：Snapgene也可以設(shè)計，容后開篇介紹。下載pEGFP-N3的載體文件。我們推薦從Snapgen網(wǎng)站下載。導(dǎo)入到Genomecompiler中〔如圖1〕。LacZ序列軟件本身就有，可以搜索得到。圖1點擊File-newconstructionproject,再點擊下面的GibsonAssembly進入〔圖2〕。圖2把BackbonepEGFP-N3拖入，載體信息會完全展示出來，包括序列、圖譜和各種注釋〔圖3-4〕。點擊sequence和circular可以在質(zhì)粒的序列和圖譜之間切換，方便查看。圖4所示的是我們選中對多克隆位點MCS的序列展示。圖3圖4圖4之間有一些選項：快速克隆首先需要對載體進行線性化處理。通常有2種方法：雙酶切線性化和PCR線性化。本次教程我們來講雙酶切線性化。本例是做融合蛋白的克隆構(gòu)建，所以必須考慮讀碼框的問題。簡而言之，就是要融合表達的兩個蛋白之間間隔的堿基數(shù)必需是3的倍數(shù)，比方9bp，15bp，21bp這樣子，而且不能含有終止密碼子StopCodon-TAA，TAG和TGA。鑒于此，我們選擇雙酶切的時候一定要足夠小心，確保滿足第6條的標準。比方在本例中我們選擇NheI和BamHI(如圖5)，BamHI識別序列為GGATCC6堿基限制性內(nèi)切酶，編碼兩個氨基酸G和S，因此，可以作為讀碼框的一局部。而BamHI識別位點GGATCC距離下游GFP的舉例為15bp，剛好包含5個氨基酸GSIAT〔如圖15〕。如果不能完美對框，比方距離為14bp，那么需要在引物合成的時候補上1個〔非終止密碼子〕堿基，如果是13bp，那么需要補2個〔非終止密碼子〕堿基等。圖5然后我們選中NheI，會自動出來下面的選項，酶切位點的處理方式，包括不處理Nonprocessed〔不處理〕，regenerate〔再生〕和Eliminate〔去除〕。我們選擇regenerate〔再生〕，這樣保證構(gòu)建的克隆酶切位點可以恢復(fù)〔圖6〕。同樣的，下游的酶切位點也同樣處理。然后點擊下一步。圖6這一步是選擇insert〔插入片段〕。我們選擇”Addfragment“〔圖7〕。把LacZ文件拖進去〔圖8〕.中間可以對插入片段重命名，位置也可以自由定制〔本例中選擇的時候注意不要帶StopCodon〕。本例LacZ序列不帶stopcondon，我們選擇selectall即可。如果是做多片段組裝，方法同上。需要對齊讀碼框的請一定格外小心。點擊下一步。圖7圖8這一步就進入引物設(shè)計設(shè)計階段。默認重疊序列15-25bp，TM值在50度〔圖9〕。點擊runassembly。引物序列就設(shè)計好了〔圖10〕.但我們不著急，繼續(xù)下一步。圖9圖10下一步就把克隆虛擬組裝好了〔圖11〕。但我們一定要check一下讀碼框是否和我們預(yù)想的一樣正確。我們選中LacZ-EGFP序列。然后選中Annotationlayers，點擊ORF旁邊的小齒輪進入設(shè)置〔圖12，13〕。因為這個融合讀碼框很大〔超多600個氨基酸〕，我們范圍也選定到大于600aa。點擊確認〔圖14〕。圖11圖12圖13圖14圖14圖譜中會出現(xiàn)一個環(huán)形箭頭，代表一個ORF。我們切換到序列，找到LacZ和EGFP的融合出看看細節(jié)〔圖15〕。箭頭分別指示了3個ORF—LacZ，EGFP和LacZ-EGFP融合，發(fā)現(xiàn)融合以后兩者的讀碼框嚴格保存，而中間就多了GSIAT5個氨基酸。說明和我們預(yù)想的一致，設(shè)計ok。點擊完成即可。圖15完了保存。引物會在圖譜里面顯示出來。切換到線性圖譜模式，選中引物，右鍵選擇“cop