SC-T 7028-2022 水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細(xì)菌耐藥性調(diào)查規(guī)范 通則

ＩＣＳ

CCS

B

50備案號：XXXX-XXXX中華人民共和國水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC／Ｔ

7028—2022

2022－

11－

11

2023－

03－

01

中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布SC/T

７０２８—２０２２前言本文件按照

GB/T１１—２０２０?標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第１部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則?的規(guī)定起草.請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利.本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任.本文件由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局提出.S本文件由全國水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(AC/TC１５６)歸口.S本文件起草單位:全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站、中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所.本文件主要起草人:劉忠松、鄧玉婷、陳艷、陳學(xué)洲、姜蘭、馮東岳、宋晨光.ⅠSC/T

７０２８—２０２２水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細(xì)菌耐藥性調(diào)查規(guī)范范圍本文件界定了水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細(xì)菌耐藥性調(diào)查規(guī)范的術(shù)語和定義,確立了水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細(xì)菌耐藥性調(diào)查流程,規(guī)定了細(xì)菌耐藥性調(diào)查中樣品采集、信息采集、細(xì)菌分離鑒定、菌株保存、藥物敏感性試驗(yàn)、結(jié)果判定和結(jié)果記錄與統(tǒng)計(jì)的要求,描述了上述各步驟相應(yīng)追溯或證實(shí)的方法.本文件適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細(xì)菌對漁用抗菌藥物的耐藥性調(diào)查.規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款.其中,注日期的引用文件,僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件.分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法水生動物病原菌實(shí)驗(yàn)室保存規(guī)范術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件.３１３２３３３４３５３６

ei采樣點(diǎn)samplei同一水域、同一品種、相同環(huán)境及養(yǎng)殖條件的養(yǎng)殖場為一個(gè)采樣點(diǎn).t i最小抑菌濃度minimalinhibioryconcentatont i在采用稀釋法測定藥物敏感性的試驗(yàn)中,能抑制細(xì)菌生長的最低抗菌藥物濃度.折點(diǎn)breakpointi

e用于區(qū)分菌株為敏感、中介和耐藥的

MICi

e敏感susceptble抗菌藥物對菌株的

MIC值等于或低于敏感折點(diǎn),即菌株對該藥物表現(xiàn)為敏感.e中介intrmediatit抗菌藥物對菌株的

MIC值在高于敏感折點(diǎn)且低于耐藥折點(diǎn)的范圍內(nèi),即菌株對該藥物表現(xiàn)為中介it耐藥ressant抗菌藥物對菌株的

MIC值等于或高于耐藥折點(diǎn),即菌株對該藥物表現(xiàn)為耐藥.耐藥性調(diào)查流程細(xì)菌耐藥性調(diào)查按以下流程進(jìn)行:a)樣品采集;b)信息采集;c)細(xì)菌分離鑒定;１SC/T

７０２８—２０２２d)菌株保存;e)藥物敏感性試驗(yàn)(微量肉湯稀釋法);f)結(jié)果判定;g)結(jié)果記錄與統(tǒng)計(jì).耐藥性調(diào)查的實(shí)施５１樣品采集５１１采樣對象水產(chǎn)養(yǎng)殖動物,每尾(個(gè))動物個(gè)體為一個(gè)樣品.５１２

采樣頻次每個(gè)采樣點(diǎn)每年至少３次,每次間隔２個(gè)月或以上.５１３采樣數(shù)量每個(gè)采樣點(diǎn)每次采集不少于１０個(gè)樣品,全年不少于３０個(gè)樣品.５１４樣品采集、保存及運(yùn)輸樣品采集后分別放置于清潔、干燥、密封的容器中,且存放溫度為０℃,應(yīng)在內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌分離.每個(gè)樣品分別加貼采樣標(biāo)簽,注明采樣地、采樣編號、采樣人和采樣日期.５２信息采集采樣人員記錄養(yǎng)殖場基本信息和樣品來源信息.按附錄

A的要求填寫采樣記錄表.５３細(xì)菌分離鑒定根據(jù)不同細(xì)菌分別選擇適宜的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和鑒定方法.對樣品進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng),采用生理生化反應(yīng)和分子生物學(xué)等方法對分離菌株進(jìn)行菌種鑒定.每個(gè)樣品分離菌株１株~２株,每個(gè)采樣點(diǎn)每年分離菌株不少于３０株.５４菌株保存分離的菌株若不能及時(shí)進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn),應(yīng)置于０℃~４℃

冰箱中保存,時(shí)間不超過４８h;或按照的規(guī)定,采用甘油保存法或真空冷凍干燥法,置于－２０℃或－８０℃冰箱中保存.５５藥物敏感性試驗(yàn)采用微量肉湯稀釋法對分離菌株進(jìn)行藥物敏感性測定.具體操作方法和步驟按附錄B的規(guī)定進(jìn)行.５６結(jié)果判定根據(jù)不同抗菌藥物對受試菌的

MIC值結(jié)果,將菌株判定為敏感、中介或耐藥.不同細(xì)菌的耐藥性判定參考值見附錄C.５７結(jié)果記錄與統(tǒng)計(jì)１ ２ ３將每一受試菌的菌株編號、菌種名稱、對各種藥物的

MIC結(jié)果以及判定結(jié)果記錄于藥物敏感性１ ２ ３結(jié)果記錄表中,見附錄D.按照公式()、公式()、公式()分別計(jì)算分離菌株的敏感率、中介率及耐藥率.１２３敏感率＝(敏感菌株數(shù)/受試菌株總數(shù))×１００％

()１２３中介率＝(中介菌株數(shù)/受試菌株總數(shù))×１００％

()耐藥率＝(耐藥菌株數(shù)/受試菌株總數(shù))×１００％

()２場名:聯(lián)系人:電話:地址:主要養(yǎng)殖品種::□

≤１０□１１~１００□

＞１００養(yǎng)殖模式::□~２□~５□動物品種:樣品數(shù)量::;采樣部位:發(fā)病情況:使用抗菌藥物情況:():():采樣時(shí)間:

SC/T

７０２８—２０２２附錄A(規(guī)范性)采樣記錄表采集養(yǎng)殖場基本信息和樣品來源信息等按表

A１的要求填寫.表表A１采樣記錄表藥物名稱儲備液濃度μg/mL溶劑稀釋劑氟苯尼考３２０９５％

磺胺間甲氧嘧啶２０４８０c２５mol/LNaOH

a磺胺甲

１２１６０c２５mol/LNaOH

a６４０００５mol/L,１０％cb８０/２,mol/LNaOH

鹽酸多西環(huán)素１６０a,,,.b,.c,.SC/T

７０２８—２０２２附錄B(規(guī)范性)藥物敏感性試驗(yàn)(微量肉湯稀釋法)B試劑和材料B１１抗菌藥物B１１１標(biāo)準(zhǔn)品氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲

唑、甲氧芐啶和恩諾沙星等.B１１２抗菌藥物儲備液的制備B１１２１抗菌藥物粉劑的稱量B Bμ抗菌藥物粉劑應(yīng)在分析天平上稱量,并且根據(jù)公式(B Bμ重量(mg)＝濃度(g/mL)×容量(mL)÷含量(％)×０００１

(B１１２２溶劑與稀釋劑各藥物的溶劑與稀釋劑見表試驗(yàn)用水應(yīng)符合

中三級水的要求.表B１抗菌藥物儲備液所用的溶劑和稀釋劑B１１２３溶劑與稀釋劑將稱取的抗菌藥物溶解于無菌水或溶劑中表B１抗菌藥物儲備液所用的溶劑和稀釋劑B１１２３溶劑與稀釋劑４制備完的藥液,置于４℃冰箱中保存,

周內(nèi)使用.４B１２水解酪蛋白(,MH)肉湯培養(yǎng)基按產(chǎn)品說明用干粉培養(yǎng)基配制

MH

肉湯,試驗(yàn)用水應(yīng)符合

GB/T６６８２中三級水的要求.針對需要復(fù)雜營養(yǎng)的細(xì)菌,應(yīng)在

MH

肉湯里添加適宜其生長的物質(zhì).B１３質(zhì)控菌株E大腸埃希氏菌(scherichiacol

EB１４９６孔板宜選用規(guī)格１０７mm

×１００mm×１６９mm、聚苯乙烯材質(zhì)、U型孔底、帶蓋、每孔可容納液體的無菌９６孔板.B儀器設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、高壓滅菌鍋、分析天平、電熱鼓風(fēng)干燥箱、冰箱、移液器、超凈工作臺等.B抗菌藥物稀釋取滅菌

MH

肉湯,在無菌９６孔板的第１孔加入１６０μL,在第２孔至第１０孔中分別加入１００μL.在第１孔中加入抗菌藥儲備液４０μL,吹打混勻;取第１孔中的含藥肉湯至第２孔中吹打混勻;吸取４藥物名稱,μg/mL１０１１１２氟苯尼考A３２１６０５０２５０１２５００６陽性對照空白對照鹽酸多西環(huán)素B１６０５０２５０１２５００６００３陽性對照空白對照磺胺間甲氧嘧啶C２０４８１０２４５１２２５６１２８６４３２１６陽性對照空白對照磺胺甲

/甲氧芐啶D６０８/３２３０４/１６１５２/９５/０５４３/０２５２４/０１２１２/００６陽性對照空白對照恩諾沙星E０５０２５０１２５００６２５００３００１５陽性對照空白對照注:“陽性對照”為不含藥液的菌懸液;“空白對照”為不含藥液和不含菌懸液

MH

肉湯.藥物類別藥物名稱MIC,μg/mL酰胺醇類氟苯尼考４~１６四環(huán)素類多西環(huán)素０５~２磺胺類磺胺甲

/０６/００３~４８/０２５磺胺間甲氧嘧啶８~３２喹諾酮類恩諾沙星０００８~００３SC/T

７０２８—２０２２第２孔中的含藥肉湯至第３孔中吹打混勻.重復(fù)上述操作,將藥物進(jìn)行２倍倍比稀釋,當(dāng)?shù)冢保翱紫♂屚旰髼壢ノ龅暮幦鉁保埃唉蘈,使含有藥物的

MH

肉湯每一孔均為１００μL.B細(xì)菌

MIC值測定B４１菌懸液制備根據(jù)不同細(xì)菌分別選擇適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件,將純化的受試菌株接種于適宜的培養(yǎng)基中,取對數(shù)生長期的培養(yǎng)物,用比濁儀或麥?zhǔn)媳葷峁軠y定校正菌液濁度為０２５~１麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn),再用

MH

肉湯稀釋２００倍,制備成用于接種的菌懸液(菌懸液濃度為４０×１０

CFU/mL~１６×１０

CFU/mL).B４２對照設(shè)立配制的菌懸液應(yīng)在１５min內(nèi)加入已稀釋好抗菌藥物的９６孔板第１孔至第１０孔中,每孔各１００μL.設(shè)不含抗菌藥物的菌懸液作為陽性對照,設(shè)不含藥物和菌懸液的

MH

肉湯作為空白對照.每一受試菌株單獨(dú)使用一塊９６孔板.接種后,每孔抗菌藥物的終濃度見表

接種后菌液的終濃度為２０×１０CFU/mL~８０×１０

CFU/mL.表B２抗菌藥物在９６孔板中各孔的終濃度B４３孵育加樣完畢后,蓋好板蓋.將表B２抗菌藥物在９６孔板中各孔的終濃度B４３孵育菌分別選擇適宜的培養(yǎng)條件.B４４MIC值判讀空白對照孔不得有細(xì)菌生長,陽性對照孔有明顯的渾濁才可判讀.沒有細(xì)菌生長的孔所對應(yīng)的最低濃度為

MIC值.如存在一個(gè)跳孔現(xiàn)象時(shí),應(yīng)讀最高的

MIC值,多于一個(gè)跳孔時(shí)應(yīng)重測.B質(zhì)量控制測定每一批次受試菌前,應(yīng)測定質(zhì)控菌株大腸埃希氏菌

ATCC２５９２２對試驗(yàn)藥物的

MIC值,對配制的藥物及藥物稀釋過程進(jìn)行質(zhì)量控制,測定方法見不同抗菌藥物的質(zhì)控范圍見表如果質(zhì)控菌株的結(jié)果明顯偏離質(zhì)控范圍,應(yīng)查找原因重新配制藥物進(jìn)行測定或從指定菌種保藏機(jī)構(gòu)更換新的標(biāo)準(zhǔn)菌株.表表B３大腸埃希氏菌ATCC２５９２２質(zhì)控范圍５藥物類別藥物名稱,μg/mL敏感中介耐藥酰胺醇類氟苯尼考≤２≥８四環(huán)素類鹽酸多西環(huán)素≤４≥１６a≤１ba≥２磺胺類磺胺甲

/≤３８/２≥７６/４a≤９５/０５a１９/１~３８/２a≥７６/４磺胺間甲氧嘧啶≤２５６≥５１２喹諾酮類恩諾沙星≤０５１－２≥４a

,

/,.b“—”.SC/T

７０２８—２０２２附錄C(資料性)細(xì)菌耐藥性判定參考值表C１給出了細(xì)菌對不同抗菌藥物的耐藥性判定參考值.表表C１細(xì)菌耐藥性判定參考值采樣點(diǎn)