三葉青種質(zhì)資源鑒定技術(shù)規(guī)程 SSR標(biāo)記法

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三葉青種質(zhì)資源鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法

1范圍

本文件規(guī)定了利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simplesequencerepeats,SSR）標(biāo)記進(jìn)行三葉青（Tetrastigma

hemsleyanumDielsetGilg）不同種質(zhì)資源鑒定的原理、儀器設(shè)備及試劑、溶液配制、操作程序及判

定方法。

本文件適用于三葉青種質(zhì)資源SSR指紋數(shù)據(jù)采集及種質(zhì)資源鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682—2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

引物primer

在核酸合成反應(yīng)時(shí)，作為多核苷酸鏈進(jìn)行延伸的出發(fā)點(diǎn)而起作用的一小段單鏈脫氧核糖核酸

（DeoxyribonucleicAcid，DNA）或核糖核酸（RibonucleicAcid，RNA）。

3.2

參照種質(zhì)資源referencegermplasmresource

具有所用SSR位點(diǎn)上不同等位變異的品種。參照種質(zhì)資源用于輔助確定送檢樣品的等位變異，校正

儀器設(shè)備的系統(tǒng)誤差。

注：本文件選用的參照品種為：三葉青2012-1。

4原理

由于不同三葉青種質(zhì)資源遺傳組成不同，基因組DNA中簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）的重復(fù)次數(shù)有差異，從

而使得不同種質(zhì)資源中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列長度存在差異。這種差異可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase

ChainReaction，PCR）擴(kuò)增及電泳方法進(jìn)行檢測(cè)，從而能夠區(qū)分不同種質(zhì)資源。

5儀器設(shè)備及試劑

5.1一般規(guī)定

3

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本文件所用的試劑和水，在沒有注明其他要求時(shí)，均指分析純?cè)噭┖虶B/T6682—2008中規(guī)定的三

級(jí)水。

5.2儀器設(shè)備

本方法中所用的儀器設(shè)備包括：

a)普通電泳儀；

b)垂直電泳槽及配套的制膠附件；

c)水浴鍋；

d)水平搖床；

e)高速冷凍離心機(jī)（最大離心力不小于20000g）；

f)電子天平（精度為千分之一）；

g)微量移液器（量程分別為10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL、5000μL）；

h)pH計(jì)；

i)冰箱（4℃和-20℃）；

j)磁力攪拌器；

k)核酸定量測(cè)定儀；

l)微波爐；

m)高壓蒸汽滅菌鍋；

n)制冰機(jī)；

o)組織破碎儀；

p)凝膠成像系統(tǒng)；

q)超純水儀。

5.3所用試劑

本方法中所用的試劑包括：

a)十六烷基三甲基溴化銨（CetyltrimethylammoniumBromide，CTAB）；

b)三氯甲烷；

c)異戊醇；

d)異丙醇；

e)乙醇；

f)乙二胺四乙酸二鈉；

g)三羥甲基氨基甲烷；

h)SSR引物；

i)DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記（marker）；

j)5×PCR預(yù)混液Pre-Mix（含Mg2+、Taq酶、dNTP和染料指示劑）；

k)瓊脂糖；

l)冰醋酸；

m)氫氧化鈉；

n)丙烯酰胺；

o)甲叉雙丙烯酰胺；

p)過硫酸銨；

4

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q)四甲基乙二胺；

r)硝酸銀；

s)甲醛；

t)乙二胺四乙酸；

u)硼酸；

v)氯化鈉。

6溶液配制

按照附錄A的規(guī)定配制溶液。

7操作程序

7.1樣品準(zhǔn)備

選取三葉青幼嫩葉片，每份樣品檢測(cè)5張葉片的混合樣，并設(shè)置三個(gè)重復(fù)。

7.2DNA提取

DNA提取應(yīng)按照以下步驟進(jìn)行：

a)將0.5g葉片剪碎后放入2.0mL離心管，加入800μL經(jīng)65℃預(yù)熱的十六烷基三甲基溴化

銨（CetyltrimethylammoniumBromide,CTAB）緩沖提取液，加入2粒鋼珠，置于組織破碎

儀上研磨充分成勻漿；

b)上述勻漿經(jīng)65℃水浴1h，期間顛倒混勻2次～3次，取出靜置2min，而后在離心機(jī)中10000

g離心15min，用移液器小心吸取500μL左右上清液至另一個(gè)潔凈離心管中，加入500μL

的三氯甲烷:異戊醇（體積比為24:1）溶液，顛倒混勻，置于離心機(jī)中10000g離心10min；

c)小心吸取上述所得上清液約450μL，加入異丙醇300μL，顛倒混勻，在-20℃冰箱中放置

20min，置于離心機(jī)中10000g離心15min；

d)倒掉上述上清液，依次加500μL75%和100%乙醇各洗一次，晾干后，加入100μL三羥甲基

氨基甲烷-乙二胺四乙酸（Tris-EDTAbuffersolution，TE）水溶液溶解，經(jīng)核酸定量測(cè)定儀

測(cè)定DNA濃度，用超純水將DNA稀釋至約100ng/μL，以備后續(xù)PCR擴(kuò)增，-20℃保存。

7.3PCR擴(kuò)增

7.3.1引物選擇

宜選擇附錄B中引物進(jìn)行擴(kuò)增。

7.3.2反應(yīng)體系

SSR-PCR擴(kuò)增體系為15μL，包括3μLPre-Mix（含Mg2+、Taq酶、dNTP和染料指示劑）、1μL模板

（含75ng～100ng上述提取所得DNA）、0.6μL正向引物（0.4μmol/L）、0.6μL反向引物（0.4μmol/L）

和超純水9.8μL。

7.3.3PCR反應(yīng)程序

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PCR反應(yīng)程序如下：

a)94℃預(yù)變性5min；

b)94℃變性1min；

c)60℃退火45s；

d)72℃延伸30s～60s；

e)重復(fù)b）～d），共35個(gè)循環(huán)；

f)72℃延伸5min；

g)4℃保存。

7.4PCR產(chǎn)物檢測(cè)

7.4.1非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

7.4.1.1凝膠準(zhǔn)備

凝膠制備應(yīng)按照如下步驟進(jìn)行：

a)將垂直夾心式電泳裝置的玻璃板與膠皮套裝在一起，取微波爐煮沸后的1%瓊脂糖封膠液約5mL

封住玻璃板底部的縫隙，制成鑄膠槽；

b)在燒杯中依次加入5mL5×Tris-硼酸（TBE）緩沖液，5mL40%丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺混

合液，超純水14.8mL，搖勻后加入200μL10%過硫酸銨和12μL四甲基二乙胺（TEMED），

攪拌混勻后注滿鑄膠槽，隨即插好樣孔梳，于室溫下靜置直至凝膠完全聚合后使用。

7.4.1.2電泳

去掉封口的瓊脂糖膠，將膠板固定于垂直電泳槽中，在電泳槽中加滿1×TBE緩沖液，小心抽出樣孔

梳，用移液器吸取TBE緩沖液沖洗每個(gè)點(diǎn)樣孔2次，然后向加樣孔中點(diǎn)入1.5μLPCR反應(yīng)產(chǎn)物；同時(shí)，

在一側(cè)加樣孔中加入DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記（marker）。按樣品向正極遷移接通電源，以5V/cm（正負(fù)極

間距離）恒壓電泳約2.5h。

7.4.2銀染顯色

電泳完畢后關(guān)閉電源，取下玻璃板。小心分開兩塊玻璃板，取下聚丙烯酰胺凝膠，用蒸餾水沖洗凝

膠30s～60s，放入染色液中，輕搖5min～10min進(jìn)行染色；然后將凝膠從染色液中取出，用蒸餾水

快速漂洗2次，每次30s～60s，放入顯影液中，輕搖至顯色出清晰帶紋，取出凝膠用蒸餾水沖洗2遍，

瀝干后掃描或拍攝成像。

7.5數(shù)據(jù)處理

應(yīng)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜，在相同遷移位置處，有電泳條帶記為“1”，無條帶記為“0”，生成

矩陣。以此來實(shí)現(xiàn)電泳帶型的數(shù)據(jù)化，并鑒定參試材料。

示例：標(biāo)記SSR-X在所有材料中共擴(kuò)增出4條大小不同的條帶，按照從小到大依次編號(hào)為SSR-X-1、SSR-X-2、SSR-X-3、

SSR-X-4，用標(biāo)記SSR-Y分析在所有材料中共擴(kuò)增出3條大小不同的條帶，依次編為SSR-Y-1、SSR-Y-2、SSR-Y-3。若材

料1顯示的條帶為SSR-X-1、SSR-X-2、SSR-Y-1、SSR-Y-3，則其帶型數(shù)據(jù)為1100101，若材料2顯示的條帶為SSR-X-1、

SSR-X-3、SSR-Y-1、SSR-Y-3，則其帶型數(shù)據(jù)為1010101，同樣可給出其它參試材料的帶型數(shù)據(jù)。由此，可建立每份材料

的數(shù)字化指紋，每一數(shù)字對(duì)應(yīng)一個(gè)擴(kuò)增條帶或位點(diǎn)。

6

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8判定方法

按照由帶型數(shù)據(jù)賦予的數(shù)字化指紋，可單獨(dú)或聯(lián)合使用的標(biāo)記鑒定材料材料的異同，具體如下：

a)當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)≥2，判定為“不同”；

b)當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)=1，判定為“高度相似”；

c)當(dāng)樣品間差異位點(diǎn)數(shù)=0，判定為極近似或相同。

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AA

附錄A

（規(guī)范性）

溶液配制

A.1DNA提取溶液的配制

A.1.1十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）提取液

稱取十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）20.0g、氯化鈉（NaCl）81.816g、乙二胺四乙酸（EDTA）2.922

g、三羥甲基氨基甲烷（Tris）12.114g于1000mL燒杯中，加入800mL超純水溶解，調(diào)整pH為8.0，轉(zhuǎn)

移至1000mL容量瓶中，用超純水定容至1000mL，在103.4kPa（121℃）條件下滅菌20min。

A.1.2TE水溶液

稱取乙二胺四乙酸（EDTA）0.292g、三羥甲基氨基甲烷（Tris）1.211g于1000mL燒杯中，加入

800mL超純水溶解，調(diào)整pH為8.0，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，用超純水定容至1000mL，在103.4kPa

（121℃）條件下滅菌20min。

A.1.3三氯甲烷-異戊醇（24:1）

按體積比24:1的比例配制混合液。

A.1.475%乙醇溶液

取750mL無水乙醇于1000mL容量瓶中，用超純水定容至1000mL。

A.2PCR擴(kuò)增溶液的配制

A.2.1SSR引物

用超純水配制濃度為10μmol/L的工作液。

A.3聚丙烯酰胺凝膠電泳溶液的配制

A.3.10.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）溶液

稱取186.1g乙二胺四乙酸二鈉鹽于1000mL燒杯中，加入800mL超純水溶解，調(diào)整pH為8.0，轉(zhuǎn)移

至1000mL容量瓶中，用超純水定容至1000mL。

A.3.25×TBE緩沖液

稱取三羥甲基氨基甲烷（Tris）54.0g和硼酸27.5g于1000mL燒杯中，加入20mL0.5mol/L乙

二胺四乙酸二鈉（EDTA）溶液，加入800mL超純水溶解，調(diào)整pH為8.0，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，用

超純水定容至1000mL。

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A.3.31×TBE緩沖液

量取5×TBE緩沖液200mL于1000mL容量瓶中，用超純水定容至1000mL。

A.3.440%丙烯酰胺溶液

分別稱取丙烯酰胺190.0g和甲叉雙丙烯酰胺10.0g于500mL燒杯中，加入300mL超純水溶解，后

轉(zhuǎn)移至容量瓶中定容至500mL，避光保存。

A.3.510%過硫酸銨溶液

稱取10.0g過硫酸銨，溶于100mL水中。

A.4銀染溶液的配制

A.4.1固定液

量取100mL冰醋酸于1000mL容量瓶中，加超純水定容至1000mL。

A.4.2染色液

稱取1.0g硝酸銀于1000mL燒杯中，加800mL超純水溶解，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，定容至1000

mL，避光保存。

A.4.3顯影液

稱取10.0g氫氧化鈉于1000mL燒杯中，加入800mL超純水溶解，量取5mL甲醛，轉(zhuǎn)移至1000mL

容量瓶中定容至1000mL。

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BB

附錄B

（資料性）

推薦引物

引物系根據(jù)三葉青參照種質(zhì)資源2012-1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)開發(fā)，并用設(shè)計(jì)的60對(duì)引物對(duì)45份三葉青材

料進(jìn)行過測(cè)試，組合運(yùn)用一些引物可將參試材料完全區(qū)分。為此，選擇其中12對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性

信息含量高（多態(tài)性信息含量大于0.53）的引物作為三葉青種質(zhì)資源鑒定的推薦引物。在實(shí)際資源鑒定

中，這些推薦引物不一定都用，可按表B.1中引物排列順序選用或組合使用，推薦引物見表B.1。

表B.1推薦引物

基因IDSSR編號(hào)引物序列F/R(5'-3')預(yù)期產(chǎn)物（bp）

GCCCATCAAAGCTCTCTCAC

c68169THSSR47167

AGGCATCAACTCCTTAGCGA

CCAAGATAATCTGGCCTCCA

c66945THSSR6279

TTTGATTCCTTTTGGGTTGG

AAGAGGGAGCCTGGAATCAT

c70882THSSR59278

AGCTGAATGTGAGGACGGAC

GGAGGTGGAGGTACTGGTGA

c66457THSSR5217

TCCAATTCCATCCCTTTGAG

TGGGTCTCTATCGTTTTCTGC

c60999THSSR31278

TCAAACCCTTCCATGCTTCT

CCGAACCCCAACTGTAGAAA

c64355THSSR39187

CACAGTTTCTGTGAAGCGGA

GCCACACACAAACACACACA

c57644THSSR8248

GCTGGAAGCAAATTCAAAGC

CAGCACTAAGCTCACCACGA

c62119THSSR45233

CAAACTGATCCCCTTTTGGA