細(xì)菌內(nèi)毒素檢測

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法培訓(xùn)培訓(xùn)講師：培訓(xùn)時間：繆2020.11一、細(xì)菌內(nèi)毒素簡介細(xì)菌內(nèi)毒素是G-菌細(xì)胞壁個層上的特有結(jié)構(gòu)，可激活中性粒細(xì)胞，引起發(fā)熱，主要化學(xué)成分為脂多糖。細(xì)菌內(nèi)毒素廣泛存在。如自來水中含內(nèi)毒素的量為1至100EU/ml。當(dāng)內(nèi)毒素通過消化道進(jìn)入人體時并不產(chǎn)生危害，但內(nèi)毒素通過注射等方式進(jìn)入血液時則會引起不同的疾病。因此，生物制品類、疫苗類等制劑必須經(jīng)過細(xì)菌內(nèi)毒素檢測試驗合格后才能使用。1956年美國人Bang發(fā)現(xiàn)美洲鱟血液遇革蘭氏陰性菌時會產(chǎn)生凝膠。其后Levin和Bang又搞清楚微量革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素也可以引起凝膠反應(yīng)，從而創(chuàng)立了鱟試劑檢測法。由于鱟試劑法簡單﹑快速﹑靈敏﹑準(zhǔn)確，已廣泛用于臨床、制藥工業(yè)藥品檢驗等方面。中國獸藥典收錄了2種細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法：凝膠法：利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來定性檢測或半定量內(nèi)毒素。光度測定法濁度法（動態(tài)和終點）：利用鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化定量測定內(nèi)毒素。顯色基質(zhì)（比色）法（動態(tài)和終點）：利用鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中及產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團(tuán)的多少來定量測定內(nèi)毒素。2015年版《中國獸藥典》第一部1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法二、檢查依據(jù)三、鱟試劑反應(yīng)原理-動態(tài)濁度法四、檢查法/干擾試驗步驟開機(jī)：預(yù)熱30min

0.8mlBET水，混合15min標(biāo)曲C稀釋樣品處理0.5ml樣品+0.5mlBET檢查用水0.5ml樣品+0.5mlE0.5內(nèi)毒素溶液復(fù)溶加樣：陰性對照（2支）：100ulBET檢查用水+100ul鱟試劑溶液（同時點擊開始）標(biāo)準(zhǔn)曲線：100ulE0.03125內(nèi)毒素溶液+100ul鱟試劑溶液100ulE0.25內(nèi)毒素溶液+100ul鱟試劑溶液100ulE2.0內(nèi)毒素溶液+100ul鱟試劑溶液樣品：100ul樣品S1+100ul鱟試劑溶液100ul樣品B1+100ul鱟試劑溶液五、結(jié)果分析≧0.980（標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗成立）50%≦R≦200%（干擾試驗通過）回收率不在指定范圍：須按“凝膠法干擾試驗”中的方法（稀釋倍數(shù)增大、過濾、中和、透析或加熱處理等）去除干擾因素，并重復(fù)干擾試驗來驗證處理的有效性。當(dāng)檢測結(jié)果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠限量試驗結(jié)果為準(zhǔn)。凝膠限量試驗：?用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素配成溶液相鄰濃度之間的稀釋倍數(shù)不得>10，最低濃度不得低于鱟試劑的檢測范圍。?稀釋過程中，每一步稀釋均應(yīng)在漩渦混合器混合30秒。?將8×75mm的試管放入動態(tài)試管檢測儀上，應(yīng)