植物生理學(xué)中各項生理指標(biāo)的測定方法

植物生理學(xué)中各項生理指標(biāo)的測定方法PAGEPAGE1一.實驗內(nèi)容實驗1MDA(丙二醛)含量測定所需試劑：10%三氯乙酸（TCA）（純）0.25%硫代巴妥酸(純)實驗2：可溶性蛋白含量測定所需試劑：考馬斯亮藍(lán)G-25095%乙醇85%磷酸實驗3：SOD(超氧化物歧化酶)酶活性測定所需試劑：dl-甲硫氨酸（Met）NBTEDTA-Na2核黃素實驗4：CAT(過氧化氫酶)活性（過氧化氫酶）測定所需試劑：PBS（PH=7.0）30%H2O2實驗五：Apx(抗壞血酸過氧化物酶)活性（即ASA—POD活性）測定所需試劑：ASA（分子量167.12）(乙=胺四乙酸=鈉)EDTA—Na2PBS(pH7.0)30%H2O實驗6：ASA(維生素C)含量測定偏磷酸95%乙醇磷酸4%2,2-二聯(lián)吡啶FeCl3（或FeCl3·6H2O）實驗7：GSH(谷胱甘肽,媚力肽GSHGSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結(jié)合而成的三肽化合物)含量測定所需試劑：NaH2PO4·2H2ODTNB（二硫代硝基苯甲酸）PBS(PH6.8)實驗8：脯氨酸測定所需試劑：磺基水楊酸甲苯茚三酮冰乙酸85%磷酸試驗9：葉綠素含量測定。80%丙酮 試驗9：GR活性測定試驗10：過氧化氫含量測定。三氯乙酸試驗11：超氧陰離子含量測定二．酶液和母液提取1.酶液提取所需試劑：50mmol/L磷酸緩沖液（PH=7.8）(內(nèi)含1%(m/v)聚乙烯吡哆烷酮PVP），0.1mmol/LEDTANa2或EDTA)，也可為（內(nèi)含2%(m/v)PVP），0.2mmol/LEDTANa2或EDTA）（先配制后用緩沖液定容）2.ASA.GSH母液提取所需試劑：5%偏磷酸1．抗氧化酶酶液提?。⊿OD.POD.CAT）：1g（根據(jù)樣品的量,少的可以適當(dāng)減少）葉片加入預(yù)冷5ml.50mmol/L磷酸緩沖液（PH=7.8）↓4℃冷凍1500↓上清液即為酶液（5℃下保存一兩天內(nèi)備用，中短期用-20℃2．ASA.GSH母液提?。?.1g葉片加入3ml預(yù)冷5%偏磷酸溶液↓4℃冷凍14000g↓蒸餾水（ml）1.00.80.60.40.20蛋白含量（μg）020406080100③各試管加入5mlG-250染色劑，翻轉(zhuǎn)混合，放置2分鐘，595nm比色，繪制過原點標(biāo)準(zhǔn)曲線（方程式）。（相關(guān)系數(shù)要兩個9以上）2.2步驟：①標(biāo)準(zhǔn)曲線（參考鄒琦）（595nm比色）注意：制作通過原點的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以含0μg蛋白質(zhì)液調(diào)零②取0.1g樣品，加5ml蒸餾水提取，5000g離心10分鐘，取上清1ml測定③1ml樣液+5mlG-250液蓋塞翻轉(zhuǎn)混合數(shù)次，最后595nm比色，直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀含量。（此方法反應(yīng)十分迅速，2分鐘即達(dá)到平衡，其結(jié)合物在室溫下1小時內(nèi)保持穩(wěn)定）實驗3：SOD酶活性3.1步驟：1.取50μl酶液①加入2ml39mmol/L甲硫氨酸（Met）②2ml0.225mmol/LNBT,（氮藍(lán)四唑）③1ml0.6mmol/LEDTA-Na2（①②③可以配制在一個試劑瓶里）④1ml0.012mmol/L核黃素，搖勻。（現(xiàn)配現(xiàn)用）2．（人工培養(yǎng)箱內(nèi)）4000Lχ日光燈下放置30分鐘后，溫度控制在30℃（用大燒杯套著小燒杯，將試管放在同心圓內(nèi)，每隔5min轉(zhuǎn)過90度，轉(zhuǎn)四次。對照（不加酶液）每次至少對稱地放3支，調(diào)零的不照光和不加酶液）3．560nm處測吸光值，酶活性以抑制NBT光反應(yīng)50%為一個酶活單位表示。（實驗中可將除酶液和核黃素外其它試劑按比例混合好后，一次加入5ml，然后依次加入核黃素和酶液，以不加酶液的照光管為對照。）均以50mmol/LPBS均以50mmol/LPBS配置PH=7.8dl-甲硫氨酸（Met）39mmol/L1.1638g/200mlNBT0.225mmol/L(0.01840克)/100ml0.0368g/200mlEDTA-Na20.6mmol/L0.0223g/100ml核黃素0.012mmol/L0.0045g/L或0.0045g/100ml用時稀釋10倍各試劑溶液均在用前配置，配置好后均應(yīng)避光保存，尤其是核黃素，必須隨用隨配，避光保存。試驗進(jìn)行時一次性加5ml的反應(yīng)混合液配置方法：Met+NBT+EDTA-Na2200mll+200ml+100mlSOD酶測定時，酶液量50μl偏少，改為100μl為佳，另外反應(yīng)時間30分鐘過長，改為20分鐘適合。SOD活性（酶單位u/gFW）=(A0-A1)*V/A0*0.5*FW*aA0對照照光管光吸收值；A1樣品管光吸收值。V樣液總體積（ml）5mlFW鮮重（g）1ga測定用樣品的量（ml）0.1ml實驗4：CAT活性（過氧化氫酶）4.1所需試劑：①PBS（PH=7.0）50mmol/L（61份50mmol/lNa2HPO4,39份50mmol/lNaH2PO4）②15mmol/LH2O2(以30%H2O2配)（取85.2μL30%H2O2，以50mmol/LPBS((PH7.0)定容至100ml）4.2步驟：1.3ml50mmol/LPBS(PH7.0)加入50μl酶液（加比色杯的蓋子搖2-3下，讓酶液與緩沖液充分分散）再加入5μl15mmol/LH2O2搖勻（加比色杯的蓋子搖2-3下，讓酶液與緩沖液充分分散）。2．240nm處作時間掃描（每0.5分鐘測1次，共測3分鐘）3．CAT活性以每分鐘消耗1μmol的H2O2為一個酶活單位?；钚杂嬎愀膭樱海ㄒ悦糠昼奜D值減少0.01為一個酶活單位u）（2005和2006年均是按OD值減少0.01算的）（以每分鐘OD值減少0.1為一個酶活單位u）注意：以PBS作空白調(diào)零50mmol/L實驗5：APX活性(抗壞血酸過氧化物酶)（即ASA—POD活性）5.1所需試劑：ASA（分子量167.12）0.3mmol=0.052836(g)(乙=胺四乙酸=鈉)EDTA—Na2(以PBS配成0.1mmol/L=0.0372(g)/L) 50mmol/LPBS(pH7.0)9mmol/LH2O2(以30%H2O2配制)(51μl30%H2O2定容至100ml)計算為：K1=2.8，K2=3，K3=-1，K4=100可得到總?cè)樱?ml酶液或1g樣）的最終活性。酶活性單位為μmol/g(鮮重)·min以后APX活性測定可參考沈文飚：抗壞血酸過氧化物酶活性測定的探討3ml反應(yīng)液中含50mmol/LPBS,pH7.0,0.1mmol/LEDTA（或EDTA—Na2），0.1mmol/LH2O2，0.5(或0.3)mmol/LAsA，最后加入適量酶液（20、50、100ul均可）啟動反應(yīng)，連續(xù)記錄測定室溫下290nm吸收值的變化。以不加H2O2作為對照，H2O2本身對AsA的氧化作用在測定時間內(nèi)由于吸收值變化太小可忽略不計。室溫下每分鐘氧化1umolAsA的酶量作為一個酶活性單位(U)(吸光系數(shù)為2.8mmol/Lcm)5.2步驟：1.配反應(yīng)液（50mmol/LPBS(pH7.0)，內(nèi)含0.1mmol/LEDTA—Na2，含0.3mmol/LASA）2.樣品池加入3ml反應(yīng)液，加入50μl酶液，最后加入5μl9mmol/LH2O2(蓋上比色杯的蓋子搖勻，2—3次)在290nm處作時間掃描，每10秒測一次，共測30秒。（注意：在測定中消光值應(yīng)該是不斷減小的）3.根據(jù)OD290值變化，計算單位時間內(nèi)AsA消耗量，（ASA氧化消耗量按消光系數(shù)2.8mmol/L·cm。），酶活性以單位時間每消耗1μmol的ASA為一個酶活單位，最后計算樣品的APX活性（單位為：U/g(鮮重)·min）。（活性計算改動）根據(jù)OD290值變化，計算單位時間內(nèi)AsA減少量（ASA氧化量按消光系2.8mmol/L·cm），并計算樣品APX終活性。酶活性單位為μmol/g(鮮重)·min實驗6ASA含量測定6.1步驟：1.取樣品母液0.2ml,1.4ml，75mmol/lNaH2PO4溶液（pH值7.4）(2.34gNaH2PO4·2H2O定容至200ml，用NaOH將pH調(diào)至7.4)混合；（75mmol/lNaH2PO4溶液亦可用150mmol/lNaH2PO4溶液稀釋1倍得到）2.依次加入（1）10%偏磷酸（26.3158g（2）44%磷酸（26ml85%磷酸+41ml蒸餾水）0.4ml;(3)4%2,2’二聯(lián)吡啶（稱取4.0g70%酒精配制（95%乙醇70份重量+蒸餾水25份重量）3%FeCl30.2ml(稱取5.0gFeCl3·6H2O定容至100ml)，搖勻，于37℃保溫1.0h（5）4.以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算ASA含量6.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：（1）稱取10mgASA分析純，以5%偏磷酸定容至100ml,成100微克/毫升的標(biāo)準(zhǔn)液；（2）按下表取8支試管，按照表中的程序加液試管編號12345678標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.020.040.060.080.100.120.145%·偏磷酸（ml）0.200.180.160.140.120.100.080.06ASA含量（微克）02468101214按前面步驟1、2所述依次加入各反應(yīng)液，最后測525nm波長下的光吸收值，作過原點標(biāo)準(zhǔn)曲線，求線性方程。實驗7：GSH含量測定7.1步驟：1.取樣品母液0.2ml，加入150mmol/LNaH2PO4溶液（pH7.7）（11.70gNaH2PO4·2H2O定容至500ml用氫氧化鈉調(diào)pH至7.7）2.6ml2.混勻再加入0.2mlDTNB溶液（=硫代硝基苯甲酸DTNB75.3mg溶于30ml0.1mol/L磷酸緩沖液pH6.8）搖勻。[實際配置時，稱75.3×2=150.6mg，即0.1506gDTNB溶于60mlPBS中]3.在30℃保溫5分鐘，【有些文獻(xiàn)（如龔吉蕊、於丙軍）方法同樣用DTNB顯色，都是在常溫下顯色30分鐘因此可將反應(yīng)時間適當(dāng)延長至10分鐘】7.2根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（GSH）方程，計算GSH含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：1.稱取100mgGSH分析純，以5%偏磷酸定容至100ml，成1mg/ml即1000ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)液。2.參照實驗6標(biāo)液方法。試管編號12345678標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.020.040.060.080.100.120.145%·偏磷酸（ml）0.200.180.160.140.120.100.080.06GSH(微克）×02468101214正確GSH含量（微克）0204060801001201403.以GSH含量為0的溶液調(diào)零，制作過原點標(biāo)準(zhǔn)曲線（及方程）所需試劑：NaH2PO4（150mmol/L）→稱23.41gNaH2PO4·2H2O定容至1L（或稱5.85定容至250ml）DTNB（二硫代硝基苯甲酸）0.1mol/LPBS(PH6.8)（參照鄒琦的書）實驗8：脯氨酸測定8.1步驟：1.取0.5g葉片，用5ml3%磺基水揚酸溶液提取，勻漿液在沸水浴浸提10分鐘，冷卻后，以3000g2.取2ml待測液，加入2ml蒸餾水，再加入2ml冰乙酸和4ml2.5%茚三酮溶液，置沸水溶顯色60min，冷卻后，加入4ml甲苯充分振蕩提取紅色物后，靜置后，取甲苯相（將移液槍的量程調(diào)至3.0ml吸取甲苯相，注意不要將槍伸到水相中。）測定520nm，波長處的吸收值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量。8.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：1.標(biāo)準(zhǔn)液配制；準(zhǔn)確稱取25mg脯氨酸，用蒸餾水溶解后定容至250ml，其濃度為100μg/ml，再取10ml此液，蒸餾水定容至100ml，即為10μg·ml-1的脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。（脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，放在冰箱也易變性）2.取7支20ml具塞試管按下表加入各試劑1234567標(biāo)準(zhǔn)脯氨酸（ml）00.20.40.81.21.62.0H2O（ml）21.81.61.20.80.40冰乙酸（ml）2222222顯色液（ml）4444444脯含量（ug）02481216203%磺基水楊酸（ml）22222223.置沸水浴中顯色60min。冷卻后（以后步驟同前）依據(jù)測定值繪制造原點標(biāo)準(zhǔn)曲線（以脯含量為0的試管作空白調(diào)零）為方程。8.3所需試劑：★3%磺基水楊酸水溶液（稱3g磺基水楊酸，蒸餾水定容至100ml）★甲苯★85%磷酸★冰乙酸 ★2.5%酸性茚三酮顯色液稱取2.5g茚三酮，加入60ml冰乙酸和40ml6.0mol/L磷酸。貯于棕色瓶，4℃下2~實際配置時，需稱10g，配制400ml（其中冰乙酸240ml，磷酸160ml6mol/L磷酸液（40.8ml85%磷酸定容至100ml）實際配制時81.6ml定容至200ml（68ml85%磷酸定容至1升，為1