基因克隆原理及實驗介紹-1

基因克隆原理及實驗介紹Theprincipleandexperimentofgenecloning1整理課件內(nèi)容概要實驗進展匯報（5.10~8.24）基因克隆基本原理及實驗操作2整理課件目的基因長度質(zhì)粒載體備注結(jié)果NS1-11056bppcDNA3.1+3flag中間有3個位點突變成功NS1-21056bppcDNA3.1+3flag中間有3個位點突變成功NS1-31056bppcDNA3.1+3flag中間有3個位點突變成功

NS2A-1654bppcDNA3.1+3flag中間有2個位點突變成功

NS2B-1390bppcDNA3.1+3flag不配對失敗NS2B-2390bppcDNA3.1+3flag雙峰失敗NS2B-3390bppcDNA3.1+3flag中間有1個位點突變成功

NS3-11854bppcDNA3.1+3flag測序有問題，需要溝通

NS3-21854bppcDNA3.1+3flag測序有問題，需要溝通

NS3-31854bppcDNA3.1+3flag測序有問題，需要溝通

NS4A-1859bppcDNA3.1+3flag需要重新設(shè)計引物，直接pcr成功NS4A-2859bppcDNA3.1+3flag需要重新設(shè)計引物，直接pcr成功NS4A-3859bppcDNA3.1+3flag需要重新設(shè)計引物，直接pcr成功

NS4B-1336bppcDNA3.1+3flag需要重新設(shè)計引物，重新實驗失敗NS4B-2336bppcDNA3.1+3flag需要重新設(shè)計引物，重新實驗失敗NS4B-3336bppcDNA3.1+3flag需要重新設(shè)計引物，重新實驗失敗

NS5-12700bppcDNA3.1+3flagPCR做不出來失敗NS5-22700bppcDNA3.1+3flagPCR做不出來失敗NS5-32700bppcDNA3.1+3flagPCR做不出來失敗

E-31485bppcDNA3.1+3flag中間有4個位點突變成功

Cap-1339bppcDNA3.1+3flag前后有數(shù)個位點突變成功Cap-2339bppcDNA3.1+3flag前后有數(shù)個位點突變成功Cap-3339bppcDNA3.1+3flag前后有數(shù)個位點突變成功

prM-1498bppcDNA3.1+3flag中間有3個位點突變成功prM-2498bppcDNA3.1+3flag中間有3個位點突變成功prM-3498bppcDNA3.1+3flag中間有3個位點突變成功

M-1225bppcDNA3.1+3flag中間有1個位點突變成功M-2225bppcDNA3.1+3flag沒有突變成功M-3225bppcDNA3.1+3flag沒有突變成功目的基因長度質(zhì)粒載體備注結(jié)果NS3-11854bppcDNA3.1+3flag有2個突變成功NS3-21854bppcDNA3.1+3flag有2個突變成功NS3-31854bppcDNA3.1+3flag有2個突變成功

NS4A-1381bppcDNA3.1+3flag沒有突變成功NS4A-2381bppcDNA3.1+3flag沒有突變成功NS4A-3381bppcDNA3.1+3flag沒有突變成功

NS4B-1744bppcDNA3.1+3flag有2個突變失敗NS4B-2744bppcDNA3.1+3flag有3個突變失敗NS4B-3744bppcDNA3.1+3flag有2個突變失敗

NS4A+2K-1450bppcDNA3.1+3flag

NS4A+2K-2450bppcDNA3.1+3flag

NS4A+2K-3450bppcDNA3.1+3flag

NS5-32700bppcDNA3.1+3flag

E1485bppcDNA3.1+3flagPCR做不出來失敗

prM-1498bppLenti+3flag無信號，取消測序失敗prM-2498bppLenti+3flag沒有突變成功prM-3498bppLenti+3flag沒有突變成功

M-1225bppLenti+3flag

M-2225bppLenti+3flag

M-3225bppLenti+3flag

3整理課件分子生物學DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄分子生物學是在分子水平上研究生命現(xiàn)象、生命本質(zhì)、生命活動及其規(guī)律的科學，其研究對象是核酸（DNA、RNA）和蛋白質(zhì)等生物大分子，其研究內(nèi)容包括核酸和蛋白質(zhì)等的結(jié)構(gòu)、功能及其遺傳信息和代謝信息傳遞中的作用和作用規(guī)律。4整理課件基因克隆基因克?。╣enecloning）或分子克隆，又稱為重組DNA技術(shù)，是應(yīng)用酶學方法，在體外將不同來源的DNA分子通過酶切、連接等操作重新組裝成雜合分子，并使之在適當?shù)乃拗骷毎羞M行擴增，形成大量的子代DNA分子的過程。目的：大量擴增目的基因，為下一步基因的功能研究做準備。5整理課件pcDNA3.1+3flagpCR雙酶切連接引物設(shè)計回收純化重組質(zhì)粒pcDNA3.1+3flag-NS36整理課件pCR雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序大腸桿菌(感受態(tài))引物設(shè)計回收純化載體目的片段酶切鑒定7整理課件網(wǎng)上檢索引物設(shè)計DNA制備PCR擴增擴增產(chǎn)物純化與克隆載體連接感受態(tài)E.coli制備轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)重組克隆篩選PCR或酶切鑒定測序生物信息學分析等質(zhì)粒提取實驗流程8整理課件引物設(shè)計從GenBank下載全基因組序列（completegenome），記錄編號保存各目的基因的序列（如NS1、NS2A、NS5、Cap、E等）獲取載體質(zhì)粒的相關(guān)信息（抗性、標簽、酶切位點）復(fù)制到PrimerPremier5分析其酶切位點，選擇共有的酶切位點在目的基因合適的位置添加引物，并在引物前/后加上酶切位點pCR回收純化雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序引物設(shè)計9整理課件ori是復(fù)制起點,他被宿主細胞識別后才能在該細胞中復(fù)制。10整理課件11整理課件PrimerPremier5pCR回收純化雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序引物設(shè)計12整理課件PrimerPremier5pCR回收純化雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序引物設(shè)計13整理課件引物處理Procedure標記，Sense→F，Antise→R，如“NS3SenseBamH1”，記為“NS3-F-BamH1”離心，使粉末在底部集聚，12000g，10min（注意是g，不是rpm）稀釋，ddH2O按報告單儲存濃度（100μM）的10倍量稀釋至使用濃度10μM保存，分裝-20℃pCR回收純化雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序引物設(shè)計14整理課件Attention離心時待離心機達到最高轉(zhuǎn)速方可離開，防止不平衡造成損壞μM是濃度單位，如100μM=100μmol/L引物稀釋量向上取5倍整數(shù)，如383μl稀釋至385μlpCR回收純化雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序引物設(shè)計15整理課件1預(yù)變性94℃2min2c變性98℃10s3c退火X℃

30s*4c延伸68℃

需計算*5總延伸68℃10min6冷卻16℃10min總循環(huán)數(shù)30-40（from2cto4c）引物設(shè)計雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序回收純化pCR成分體積（μl）滅菌ddH2O3310×KOD-plus-neoBuffer5dNTPs（2mM）5MgSO43Template1PrimerR（10μM）1PrimerF（10μM）1KOD-plus-neoPolymease1Total50AB*延伸時間計算：

，向上取整數(shù)（多預(yù)留延伸時間）*退火溫度計算：一般為上下游引物TM平均值—5℃16整理課件Attention試劑如不完全融化，會造成濃度不均，酶需冰上放置PCR管根據(jù)目的基因名稱、日期、編號做標記模板(Template)可根據(jù)濃度確定加入體積，緩沖液(Buffer)必須在酶之前加入。注意不同引物對應(yīng)不同PCR管PCR結(jié)果優(yōu)化略，詳見《pCR常見問題解決方法》引物設(shè)計回收純化雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序pCR17整理課件瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，本身不帶電荷。具有分子篩效應(yīng)(凝膠色譜)與電泳效應(yīng)。目的：分離不同大小的核酸，以達到純化、鑒定的目的。原理：DNA分子遷移率與其大小成反比，電泳時

根據(jù)分子大小不同形成不同的條帶根據(jù)目的基因片段大小，配制不同濃度的凝膠引物設(shè)計pCR雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序回收純化凝膠濃度目的基因片段(bp)0.5%1000-300000.7%800-120001.0%500-100001.2%400-70001.5%200-30002.0%50-200018整理課件引物設(shè)計pCR雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序回收純化Attention瓊脂糖凝膠可根據(jù)情況分成數(shù)小塊（一般是每8孔），或插入孔徑不同的梳子EB具有強致癌性，應(yīng)在污染區(qū)操作為保持凝膠成像儀與點樣順序一致，點樣時應(yīng)從右往左點（靠近自己一段開始）Marker是已知大小的正對照DNA，電泳能分離出不同條帶，相當于尺子上的刻度，可以用來測算未知DNA樣品的大小。紅色為正極，黑色為負極，DNA樣品由負極往正極泳動（靠近加樣孔的一端為負)。19整理課件引物設(shè)計pCR雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序回收純化2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpEECapCapCapCap2B2B2A2ANS1NS120整理課件引物設(shè)計pCR雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序回收純化Procedure打開紫外燈，在操作臺上根據(jù)熒光位置切膠，動作要快并盡可能切小塊，切出的凝膠轉(zhuǎn)移至1.5mlEp管里，稱量凝膠重量*凝膠成像儀的紫外燈對DNA有突變作用，應(yīng)盡可能減少紫外燈對凝膠的照射按照E.Z.N.ATMGelExtractionKit(200)試劑盒說明書回收純化DNA：21整理課件Objective原理：限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段特定的DNA序列的特異位點上,并切割雙鏈DNA目的DNA與質(zhì)粒載體同時進行雙酶切（兩個不同的酶切位點，如BamH1和EcoR1），形成同樣的酶切位點為進行連接引物設(shè)計pCR回收純化連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序雙酶切Procedure目的DNA酶切體系試劑用量目的DNA41μlBuffer（10×）5μlenzyme12μlenzyme22μlddH2O補至50μl載體酶切體系試劑用量Plasmid4μg(Xμl*)Buffer（10×）5μlenzyme12μlenzyme22μlddH2O補至50μl*根據(jù)質(zhì)粒濃度（如pcDNA3.1+3flag濃度為455ng/μl，4000bp，反應(yīng)體積約為9μl）混勻，37℃孵育4-6h（6h以上更佳）22整理課件Objective通過凝膠電泳驗證目的DNA、質(zhì)粒是否酶切成功，并通過膠回收DNA及質(zhì)粒（切去的片段除外）最終回收體積為30μl通過連接使目的DNA導入質(zhì)粒中，為下一步轉(zhuǎn)染準備引物設(shè)計pCR回收純化雙酶切轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序連接Procedure目的DNA與質(zhì)粒連接體系試劑用量目的DNA13-15μlplasmid2-4μl10×LigaseBuffer2μlT4DNALigase1μlTotal20μl混勻，4℃過夜或常溫條件下反應(yīng)4h23整理課件引物設(shè)計pCR回收純化雙酶切連接挑菌提質(zhì)粒測序轉(zhuǎn)化Objective將連接產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到感受態(tài)大腸桿菌中，從而使連接產(chǎn)物（重組質(zhì)粒）在大腸桿菌中大量復(fù)制LB培養(yǎng)基配制胰蛋白胨（Tryptone）10g/L酵母提取物（Yeastextract）5g/L氯化鈉（NaCl）10g/L瓊脂粉（Agar）*10-15g/L*配制固體LB時加入

每錐形瓶加入200/250ml（定量）24整理課件引物設(shè)計pCR回收純化雙酶切連接轉(zhuǎn)化提質(zhì)粒測序挑菌Objective從大腸桿菌培養(yǎng)基中挑取優(yōu)勢菌落（單菌落）進行擴大培養(yǎng)培養(yǎng)過夜后取出部分菌液進行保菌25整理課件Procedure消毒實驗臺及器具，取酒精棉球擦拭桌面、鑷子，準備無菌槍頭、試管、試管板兩個，點燃酒精燈，酒精消毒雙手取LB培養(yǎng)液加入抗生素，向各試管中倒入LB培養(yǎng)液約10-15ml從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿，在火源附近打開，用鑷子夾取一個槍頭，挑取一個單菌落，輕輕沾取菌落，槍頭丟入試管內(nèi)，每菌種挑取2-3管培養(yǎng)皿用封口膜封好放入4℃保存將試管放入搖床震蕩培養(yǎng)過夜，次日出現(xiàn)渾濁消毒桌面，取1.5ml無菌Ep管標記搖勻試管，使底部菌落分散，吸取1000μl菌液，加入200μl60%甘油，-20℃裝袋保存引物設(shè)計pCR回收純化雙酶切連接轉(zhuǎn)化提質(zhì)粒測序挑菌26整理課件Objective從宿主細胞大腸桿菌中提取大量復(fù)制后的質(zhì)粒引物設(shè)計pCR回收純化雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌測序提質(zhì)粒Procedure按照E.Z.N.ATMEndo-freePlasmidMiniKitⅡ(200)試劑盒說明書提取質(zhì)粒27整理課件引物設(shè)計pCR回收純化雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌測序質(zhì)粒濃度檢測器260/280比值（約1.8）260/230比值（約2.1）

濃度＞400（ng